专利名称：活c－kit表达细胞的分离工具的制作方法
技术领域：
本发明为分离c-kit表达细胞提供了一种工具。c-kit促癌基因(proto-oncogene)编码Kit。Kit是干细胞因子(SCF)的膜受体酪氨酸激酶，经鉴定它是许多细胞的特异性标记物1，这些细胞包括Cajal间质细胞(ICC)、造血干细胞、上皮细胞和内分泌细胞，如朗氏岛的细胞、肾上腺髓质细胞、甲状腺细胞、松果体细胞和垂体细胞。
虽然Kit定位于细胞膜上，但由于在解离过程中膜蛋白丢失，难以进行c-kit表达细胞的成功分离。利用c-kit特异性抗体的常规技术，如免疫荧光法或免疫组化法评价分离细胞的c-kit表达特征，其结果是失败的。
本发明通过提供c-kit质粒靶向载体解决了本领域的这一问题，其中c-kit质粒靶向载体能够整合到野生型c-kit等位基因上，并编码包含核仁定位信号，如TCOF-12、RLP313、RPS254或Fxr2h5的嵌合荧光蛋白。所述的构建体产生一个能够定位于活组织中的、浓缩的、亮荧光信号，该信号在组织解离后也存在。该构建体使得能够使用共聚焦显微镜进行观察，并使得能够利用流式细胞仪对解离的细胞进行自动细胞分选。
相应地，c-kit质粒靶向载体可用于产生一种转基因动物模型，该模型在内源c-kit启动子的控制下表达上述的嵌合荧光蛋白，从而使嵌合荧光蛋白在所述的转基因动物中特异性地标记c-kit表达细胞。可以将后者分离，建立c-kit表达细胞系，如ICC细胞系或造血干细胞系。
因此本发明的另一个目标是提供包含上述c-kit质粒靶向载体的转基因动物和c-kit表达细胞系。
参照下面的实验细节可以更好地理解本发明，本领域的熟练技术人员会明白这些实验细节仅是本发明的示例，其后的权利要求书中会更全面地加以描述，另外，在整篇申请文本中引用了各种出版物。这些出版物的内容在申请文本中引用作为参考，以更全面地描述本发明所属领域的状态。
附图简述
图1编码嵌合荧光蛋白的四个构建体图谱，其中嵌合荧光蛋白位于c-kit启动子控制下，包含核仁定位信号。
图2pZsGreen-N1-c-kit-RLP31构建体序列图3在基因组c-kit毗邻序列群(contig)(KOS)中插入Sfi位点，使得中间载体pKI中的SfiI序列盒在酵母中通过同源重组交换到KOS基因组克隆中；URA＝尿嘧啶。
图4KOS克隆pKOS.12和pKOS.65组装成完整的基因组c-kit克隆pKOS.11。
图5c-kit gDNA毗邻序列群(26567bp)和插入了图3中PKI构建体的c-kit gDNA毗邻序列群(30072bp)。
发明详述本发明为分离c-kit表达细胞提供了一个工具。该工具由一个核酸载体组成，能够指导表达的嵌合荧光蛋白进入c-kit表达细胞的核仁中，其中嵌合荧光蛋白特征是嵌合蛋白包含一个核仁定位信号，并位于c-kit表达细胞中c-kit启动子的控制下。
这里所用的“嵌合蛋白”通常指融合蛋白，该融合蛋白由两个或多个蛋白质的全部或部分氨基酸序列组成，通过使用已知技术将蛋白质编码基因融合在一起而形成。在本发明中，嵌合蛋白由功能性核仁定位信号和荧光蛋白融合而成。举例来说，荧光蛋白选自EGFP、EYFP、EBFP、ZsGreen1、ZsYellow1、DsRED、AmCyan、AsRed，优选由ZsGreen1组成。举例来说，核仁定位信号选自TCOF-1、RLP31、RPS25和Fxr2h，优选由RLP31组成。
相应地，该构建体或载体能够产生表达嵌合荧光蛋白的非人类的动物细胞，其中所述嵌合荧光蛋白的表达位于c-kit启动子的控制之下。
在本发明的一个实施方案中，核酸载体进一包含促进载体向非人类动物细胞的基因组中整合的序列，以抑制所述动物c-kit蛋白的功能性表达，促进嵌合荧光蛋白的表达。因此本发明的一个目的是提供一个核酸载体，该核酸载体包括a)编码嵌合荧光蛋白的核酸序列；和b)促进载体整合到非人类动物基因组中的序列，以抑制所述动物c-kit蛋白的功能性表达，促进嵌合荧光蛋白的表达。
相应地，本发明提供了能够整合到野生型c-kit等位基因的c-kit质粒靶向载体，所述的载体编码包含核仁定位信号的嵌合荧光蛋白。在所述的发明中，核仁定位信号优选自TCOF-1、RLP31、RPS25和Fxr2h，更为优选的是，所述的核仁定位信号由RLP31组成。嵌合荧光蛋白分子进一编码荧光蛋白，所述的荧光蛋白选自任何商业来源的荧光蛋白，例如EGFP、EYFP、EBFP、ZsGreen1、ZsYellow1、DsRed、AmCyan或AsRed。在一个具体的实施方案中，荧光蛋白由ZsGreen1组成。
在一个优选的实施方案中，本发明的载体包含SEQ ID No.2，特别包含SEQ ID No.1，更优选由SEQ ID No.1组成。其中SEQ ID No.2由能够促进向非人类动物基因组中整合的多聚核苷酸序列组成，以抑制所述动物c-kit蛋白的功能性表达，促进和编码嵌合荧光蛋白的多聚核苷酸序列可操作性相连的嵌合荧光蛋白的表达。(Seq Id No2cagagtctagcgcagccaccgcgatgagaggcgctcgcggcgcctgggatctgctctgcgtcctgttggtcctgctccgtgaattccgcttgtccagaaaacgtaaggatccaccggtcgccaccatggcccagtccaagcacggcctgaccaaggagatgaccatgaagtaccgcatggagggctgcgtggacggccacaagttcgtgatcaccggcgagggcatcggctaccccttcaagggcaagcaggccatcaacctgtgcgtggtggagggcggccccttgcccttcgccgaggacatcttgtccgccgccttcatgtacggcaaccgcgtgttcaccgagtacccccaggacatcgtcgactacttcaagaactcctgccccgccggctacacctgggaccgctccttcctgttcgaggacggcgccgtgtgcatctgcaacgccgacatcaccgtgagcgtggaggagaactgcatgtaccacgagtccaagttctacggcgtgaacttccccgccgacggccccgtgatgaagaagatgaccgacaactgggagccctcctgcgagaagatcatccccgtgcccaagcagggcatcttgaagggcgacgtgagcatgtacctgctgctgaaggacggtggccgcttgcgctgccagttcgacaccgtgtacaaggccaagtccgtgccccgcaagatgcccgactggcacttcatccagcacaagctgacccgcgaggaccgcagcgacgccaagaaccagaagtggcacctgaccgagcacgccatcgcctccggctccgccttgccctgagc)编码嵌合荧光蛋白的序列优选是cDNA序列，该序列中核仁定位信号序列和编码荧光蛋白的核酸序列可操作性相连接，其中本发明中使用的核仁定位信号序列(NoLs)选自表2中所列序列，即RLP31(参见图1)、RPS25、Fxr2h和TCOF-1。为了获得嵌合荧光蛋白，将所述序列中的一个序列连接到编码荧光蛋白的商业来源载体上，例如购自Clontech的pZsGreen1、pZsYellow1或pDsRed。
本发明的载体可以转化到适当的宿主细胞中，宿主细胞优选真核细胞，自身用于转化非人类动物。因此，本发明的另一个方面提供了一种制备嵌合荧光蛋白的方法，该方法包括在一定条件下培养转化或转染有本发明载体的宿主细胞，提供载体表达的所述蛋白质，并回收表达的蛋白质。优选的是，宿主细胞是非人类动物细胞，优选哺乳动物细胞，更优选非人类动物的胚细胞。
相应地，本发明的一个进一步的实施方案提供了转染有本发明c-kit质粒靶向载体的细胞。其中所述的细胞是一种真核细胞，特别是能够在适当的培养基中连续培养的细胞，优选哺乳动物细胞，所述细胞从包含敲入了本发明载体的转基因动物分离，或者所述细胞选自COS-7或Colon26，更优选为COS-7细胞。
如下文更详细加以讨论的，可以使用本领域中在动物中操纵基因表达的已知方法，如使用Cre/Lox系统(使用Cre/Lox系统将可诱导基因靶向小鼠，酶学方法指南，14，381-392(1998)和最近如SigridW.et al.，1999 BioTechniques 261150-1160所述从λKOS基因组文库中建立的基因靶向载体，将本发明的载体靶向到小鼠的相应c-kit序列上。在后面的实施例中提供了该方法。该方法采用酵母同源重组机器来简化敲入载体的构建过程。
在本发明的一个具体实施方案中，促进载体向非人类动物基因组中整合的序列包括和动物的c-kit序列或其旁侧序列相比具有足够同源性的核苷酸序列，该同源性优选为95％，更优选为98％，最优选为100％，以进行同源重组和随后载体向所述动物基因组的插入，插入位置能够破坏编码区，进而内源c-kit的表达有利于所述载体中序列所编码的嵌合荧光蛋白。
通过Sambrook et al.，分子克隆实验指南，冷泉港实验室出版社中所述的、本领域的熟练技术人员所熟知的方法，将核酸序列加到本发明的载体中，用于随后的转化和向所述宿主细胞基因组或非人类动物基因组中的整合。在一个具体的实施方案中，核酸序列SEQ IDNo.2最先克隆到中间载体pKI上(参见图3)，所述的载体包括旁侧有两个SfiI位点的剪接受体/剪接供体序列盒和一个诸如PGK Neo标记之类的floxed选择标记。该中间载体上剪接受体/剪接供体序列盒随即交换为旁侧有SfiI的酵母标记URA，在酵母中通过同源重组导入包含c-kit基因的KOS基因组克隆。在包含Prm-CRE转基因的ES细胞中进行c-kit基因的最终靶向。在该ES细胞系中，精子发生Cre的表达受控于鱼精蛋白启动子。因此，当饲养产生于ES细胞系的嵌合小鼠时，靶等位基因传经雄性胚系，旁侧带有loxP位点的Neo序列盒切除，从而使Neo标记在嵌合体的饲养过程中切除。
可以通过转染或其他诸如电穿孔之类的适当技术将载体导入。在本发明中，通过电穿孔法将载体导入胚胎干细胞，完成外源DNA向动物基因组中的导入。基因组中通过同源重组插入了外源DNA的细胞随即注射到胚泡中，产生具有所需表型的转基因动物。通过人们所熟知的技术鉴定包含本发明载体的成功转化细胞，比如裂解细胞，通过Southern印迹法或使用聚合酶链式反应对DNA进行验证。
举例来说，载体可以是质粒、病毒、粘粒或噬菌体载体，可以含有一个或多个选择标记，如新霉素或潮霉素标记基因。
本发明还有利地提供了由本发明的核酸中至少约10个连续核苷酸组成的核酸序列，优选10至50个核苷酸，核酸序列包含如表1所示的序列。这些序列可以有利地用作探针或启动复制的引物等。可以根据本领域人员所熟知的技术产生这种核酸序列。这些序列还可用于诊断试剂盒等，检测本发明中核酸的存在与否。这些实验通常包括在杂交条件下将探针和样品相接触，检测是否存在探针和样品中任意核酸之间所形成的二聚体或三聚体。
根据本发明的这一方面，探针可以锚定在固体支持物上，优选的是，它们存在于芯片上，使多个探针可以同时和单一的生物样品杂交。探针可以点在芯片上，或在芯片上原位合成。(参见Lockhart et al.，Nature Biotechnology，vol.14，December 1996“通过和高密度寡核苷酸芯片杂交进行表达监测”。一个芯片可以包含处于离散位置上的多于100、500、甚至1000个的不同探针。
可以使用重组手段或合成手段来生成本发明中的核酸序列，例如使用PCR克隆机制，该克隆机制通常涉及制备引物对，这些引物可以是所要克隆的基因区域中的约10个至50个核苷酸；将引物和来源于人细胞的mRNA、cDNA或基因组DNA相接触；在能够导致所需区域扩增的条件下进行聚合酶链式反应；分离扩增区域或片段，回收扩增的DNA。通常来说，这些技术都是本领域人员所熟知的，如Sambrook等所述(分子克隆实验指南，1989)。
本发明的核酸或寡核苷酸可以携带一个展现标记。适当的标记包括诸如32p或35S之类的同位素标记，酶标记或诸如生物素或荧光标记之类的其他蛋白质标记。这些标记可以加到本发明的核酸或核苷酸上，使用上文的已知技术进行检测。
根据本发明，特定的核酸不仅包括相同的核酸，还包括任意碱基突变，这些碱基突变尤其包括一种替换，这种替换由于保守氨基酸替换中的兼并密码，导致产生同义密码子(编码同一氨基酸残基的不同密码子)。术语“核酸序列”还包括和具有碱基突变的任意单链序列互补的序列。
本发明的进一步方面包括获得转基因非人类动物的方法，其中转基因非人类动物在c-kit表达细胞中表达嵌合荧光蛋白，该方法包括以下步骤(a)将本发明中的核酸载体导入所述动物的胚细胞中；(b)将步骤(a)获得的胚导入雌性动物；(c)饲养步骤(b)中的雌性动物，直至胚发育成熟，从雌性动物体内出生；和(d)饲养转基因动物。
优选的是，根据本发明方法使用的非人类动物是哺乳动物，更优选为小鼠。在一个进一步的方面中，本发明和涉及产生前面所述的转基因动物相交配的后代，后面称作子代。还包括从所述转基因动物获得的胚系细胞，这些胚系细胞自身用于产生后代，这些后代包含本发明中稳定整合到基因组中的载体。
例如，可以通过电穿孔法将所述的核酸载体导入胚胎干细胞中。在处于单细胞期的胚上进行细胞微注射，以确保核酸载体能够掺入到动物的胚系中，并在动物的所有细胞中表达，并随后转移到子代中。本发明的一个进一步的方面包括本发明中转基因动物的子代，这些子代携带有本发明中稳定整合到其基因组中的任意核酸载体。
在一个具体的实施方案中，将表达嵌合荧光蛋白的第一个非人类动物和转入另一个目标特征的另一个非人类转基因动物杂交，尤其是和转有SV40大T抗原的另一个非人类转基因动物杂交，也提供了本发明中的转基因的非人类动物。
因此，根据本发明的这一方面，提供了产生具有额外特征的转基因非人类动物的方法，所述的动物包含编码SV40大T抗原的核酸序列，后面称之为c-kit/无限增殖转基因，包括步骤为将第一个转基因非人类动物和第二个包含编码SV40大T抗原之载体的转基因非人类动物相杂交，尤其是和商业来源的无限增殖小鼠(H-2Kb-tsA58Charles River实验室)相杂交。其中第一个转基因非人类动物包含的载体具有a)编码嵌合荧光蛋白的核酸序列；和b)促进载体向非人类动物基因组中整合的序列，该序列能够抑制所述动物c-kit蛋白的功能性表达，促进嵌合荧光蛋白的表达。
术语“子代”或“后代”包括携带有本发明载体的所述转基因动物相交配的产物。还包括从所述转基因动物获得的胚系细胞，这些胚系细胞自身用于产生后代，这些后代包含本发明中稳定整合到基因组中的载体。
在本发明的一个进一步方面中，所述的核酸载体用于促进c-kit表达细胞从本发明中非人类转基因动物或从分离的生物样品的分离，尤其是从组织样品，如转染有所述载体的小肠；造血干细胞；上皮细胞和内分泌细胞，如朗氏岛的细胞、肾上腺髓质细胞、甲状腺细胞、松果体细胞和垂体细胞的分离。因此，本发明的一个目的是提供从转基因动物中分离c-kit表达细胞的方法，所述方法包括以下步骤；使包含c-kit表达细胞的组织解离；分离c-kit质粒靶向载体，从所述解离组织分离荧光标记细胞。可以使用本领域中已知的技术，从解离组织中分离荧光标记细胞，优选使用细胞分选仪进行分离步骤，更优选的细胞分选仪是流式细胞仪。在前面提到的方法中，包含c-kit表达细胞的组织选自Cajal间质细胞、造血干细胞、上皮细胞和内分泌细胞，如朗氏岛的细胞、肾上腺髓质细胞、甲状腺细胞、松果体细胞和垂体细胞。优选的是，收集的细胞由Cajal间质细胞组成。
细胞分离的方法包括，但不局限于外科切除或解剖、解离、荧光活化的细胞分选(FACS)、淘选、激光捕捉显微解剖(LCM)。从转基因动物标本中分离和纯化细胞的方法在Serafini于2001年2月14日提交的、题目为“转基因动物系标本(活体库)”的PCT申请WO02/64749中作有介绍，将其整体在此引入作为参考。
在某些实施方案中，使用外科切除或解剖来分离表达嵌合荧光蛋白的细胞。在解剖前，对转基因动物进行灌注。
优选使用包含α-鹅膏蕈碱或其他转录阻断剂的灌注液进行灌注，防止细胞分离过程中发生基因表达变化。
在其他的实施方案中，从解剖和解离的啮齿类动物小肠组织中分离表达嵌合荧光蛋白的细胞。这种解剖和解离的方法在本领域中是熟知的。参见Epperson，2000，J.Physiol.Cell.Physiol.279C529-C539；Brewer，1997，J.Neurosci.Methods 71(2)143-55；Nakajima et al.，1996，Nerosci.Res.26(2)195-203；Masuko et al.，1992，Neuroscience49(2)347-64；Baranes et al.，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93(10)4706-11；Emerling et al.，1994，Development 120(10)2811-22；Martinou 1989，J Neurosci.9(10)3645-56；Ninomiya，1994，Int.J.Dev.Neurosci.12(2)99-106；Delree，1989，J.Neurosci.Res.23(2)198-206；Gilbert，1997，J.Neurosci.Methods 71(2)191-98；Huber，2000，J.Neurosci.Res.59(3)372-78。所有文献以整体形式在此引入作为参考。
在其他的实施方案中，通过透光度光直接显影从组织片中分离表达嵌合蛋白的细胞，并使用Nakajima et al.，1996，Neurosci.Res.26(2)195-203；Masuko et al.，1992，Neuroscience 49(2)347-64的方法对这些细胞进行培养，这些文献以整体形式在此引入作为参考。
在其他的实施方案中，使用蛋白酶，如木瓜蛋白酶(Brewer，1997，J.Neurosci.Methods 71(2)143-55；Nakajima et al.，1996，Neurosci.Res.26(2)L195-203)或胰蛋白酶(Baranes，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93(10)4706-11；Emerling et al.，1994，Development 120(10)2811-22；Gilbert，1997，J.Neuroosci.Methods 71(2)191-98；Ninomiya，1994，Int.J.Dev.Neurosci.12(2)99-106；Huber，2000，J.Neurosci.Res.59(3)372-78；这些文献以整体形式在此引入作为参考)解离表达嵌合荧光蛋白的细胞。还可以使用胶原酶解离细胞(Delree，1989，J.Neurosci.Res.23(2)198-206；以整体形式在此引入作为参考)。解离的细胞在饲养层上生长。在一个实施方案中，解离的细胞是培养在商业来源的平滑肌细胞培养基，如Clonetic的SM或SMGM(Cambrex公司，NJ，美国)中的cajal间质细胞。
在另一个实施方案中，标记有嵌合荧光蛋白的组织可以使用Martinou的方法进行显微解剖和解离(1989，J.Neurosci.9(10)3645-56；以整体形式在此引入作为参考)。
标记细胞的显微解剖之后进行密度梯度离心。通过荧光活化的细胞分选方法(FACS)对细胞进行纯化。在其他的实施方案中，可以通过仅使用光散射参数的细胞分选方法对细胞进行纯化，从而不必进行标记(Martinou，1989，J.Neurosci.9(10)3645-56)。
在本发明的一个具体实施方案中，通过关键基因，即嵌合荧光蛋白和标记基因，即SV40大T抗原的表达，识别来源于转基因动物标本中转基因动物的杂合细胞群体的细胞亚群。可以使用任何便于操作的方法实现目标细胞亚群的选择和/或分离。例如，如果标记物是外部可接近的细胞表面相关蛋白或其他包含表位的分子，就可使用免疫吸附淘选技术或荧光免疫标记和荧光活化的细胞分选(FACS)相偶联。
使用Mouawad等(1997，J.Immunol.Methods，204(1)，51-56；以整体形式在此引入作为参考)所述的流式细胞仪方法检测表达标记基因产物的细胞。该方法的依据是使用与标记基因序列所编码的标记酶特异结合的单克隆抗体，进行见解免疫荧光染色。该方法可以用于哺乳动物中酶表达的体外和体内定量。使用这种方法，可以对表达关键基因和/或标记基因的细胞进行定量，研究基因调控，包括转染死亡率、启动子效率、增强子活性和其他调控因子(Mouawad et al.，1997，J.Immunol.Methods，204(1)，51-56)。
在另一个特定实施方案中，使用荧光活化的细胞分选仪(FACS)从转基因小鼠的组织中分离携带有嵌合荧光蛋白的个体细胞。参见Hadjaantonakis and Naki，2000，Genesis，27(3)95-8，以整体形式在此引入作为参考。在本发明的某些实施方案中，嵌合荧光蛋白包含一个自体荧光(AFP)受体，包括但不局限于野生型绿色荧光蛋白(wtGFP)和其变体，包括增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和增强型黄色荧光蛋白(EYFP)、ZsGreen、ZsYellow、DsRed、AmCyan或AsRed。
在本发明的某些实施方案中，通过在抗细胞表面标记物的抗体上淘选来分离细胞。在优选的实施方案中，抗体是单克隆抗体。使用本领域中已知的、Camu and Henderson，1992，Nez rosci.Methods44(1)59-79；KashTwagi et al.，2000，41(1)2373-7；Brocco and Panzetta，1997，75(1)15-20；Tanaka et al.，1997，Dev.Neurosci.19(1)106-11；和Barres et al.，1998，Neuron 1(9)791-803中所述的方法对细胞进行分离和鉴定，这些文献以整体形式在此引入作为参考。
在其他的实施方案中，使用激光捕捉显微解剖(LCM)来分离细胞。对神经系统进行激光捕捉显微解剖的方法是本领域中所熟知的。参见Emmert-Buck et al.，1996，Science 274，998-1001；Luo et al.，1999，Nature Med.5(1)117-122；Ohyama et al.，2000，Biotechniques29(3)530-36；Murakami et al.，2000，Kidney Int.58(3)1346-53；Goldsworthy et al.，1999，Mol.Carcinog.25(2)86-91；Fend et al.，1999，Am.J.Pathol.154(1)61-66；Schutze et al.，1998，Nat Biotechnol.Aug；16(8)737-42，这些文献以整体形式在此引入作为参考。
在一个特定的实施方案中，使用本发明中的c-kit/无限增殖转基因小鼠系标本来分离表达关键基因，即本发明中嵌合荧光蛋白的cajal间质细胞，这些细胞位于小肠中，产生对于肠蠕动重要的定步组分(慢波(slow waves))。
本发明的转基因动物系和从本发明的转基因动物系中分离的细胞可用于靶证实、药物发现、药效学分析、行为分析、发育分析、电生理学分析和基因表达分析等，但优选靶证实和药物发现。本发明因此提供了鉴定参与c-kit表达细胞功能的潜在药物靶的方法，所述的方法包括用靶向特异基因沉默手段(means)对使用上述任意方法获得的c-kit表达细胞进行处理，测定所述基因沉默手段对所述细胞功能的影响。
在第一个方面中，可以通过本领域中已知的任意方法来分析表达本发明中嵌合荧光蛋白的分离细胞，鉴定潜在的药物靶。相应地，在本发明的一个方面中，使用本领域中已知的任意方法来分析细胞的基因表达谱，举例来说，但不具有限制性，这些方法通过从分离细胞中分离mRNA，将mRNA和芯片相杂交，鉴定分离细胞中表达或不表达的基因。对用或不用目标化合物处理的细胞中的基因表达进行比较，或从经或不经特定处理的动物体内获得的细胞中的基因表达进行比较。另外，还可以通过Northern印迹分析、PCR、Rnase保护等对从分离细胞中获得的mRNA进行分析，确定编码特定蛋白产物的mRNA存在与否，依赖于细胞处理的这些mRNA的存在或水平。
在另一个方面中，从分离细胞中获得的mRNA可以用于生成cDNA文库，事实上，可以从不同的分离细胞群产生这种细胞类型特异性cDNA文库的集合。这种cDNA文库可用于分离基因表达，分离和鉴定细胞类型特异性基因，剪接变体和非编码RNA。在另一个方面中，从经或不经处理的本发明的转基因动物体内分离、或从具有或不具有疾病状态的本发明的转基因动物体内分离的细胞中制备的这种细胞类型特异性文库，可用于进行减法杂交，鉴定和未处理转基因动物相比，特定处理或疾病状态情况下更高或更低水平表达的基因。
这些分析数据可用于产生动物中，或特定组织中，或解剖区域，如小肠中不同细胞群基因表达分析的数据库。使用这一数据库和生物信息工具，如层级和非层级聚类分析和主成分分析，对细胞绘制“指纹图谱”，用作健康和疾病模型动物或组织的具体指征。
在一个优选的实施方案中，用在上文所述分析中的分离细胞由来源于c-kit/无限增殖转基因动物的cajal间质细胞组成。因此，本发明的一个目的是提供鉴定参与慢波形成的潜在药物靶的方法，所述方法包括用靶向特异基因沉默手段对使用上述任意方法获得的cajal间质细胞进行处理，测定所述基因沉默手段对所述细胞形成慢波的影响。在一个具体的实施方案中，cajal间质细胞从本发明的转基因动物体内分离，更优选从c-kit/无限增殖转基因动物体内分离。这里所用的靶向特异基因沉默手段通常指本领域中抑制潜在药物作用靶蛋白的基因表达的已知方法，该方法包括使用反义序列或段干扰RNA(siRNA)。
可以设计反义寡核苷酸，用来和核酸、前体mRNA或成熟mRNA的互补序列相杂交，干扰靶向DNA序列所编码多肽的生成，总的表现为降低或抑制多肽的表达。反义序列的构建及其应用在Peyman andUlman，Chemical Reviews，90543-584，(1990)；Crooke，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32329-376，1992)和Zamecnik and Stephenson，P.N.A.S，75280-284，(1984)中作有介绍。核酶的构建及其应用在Gibsonand Shillitoe，Molecular Biotechnology 7(2)125-137，(1997)中作有介绍。
可以设计短干扰RNA，用来和编码潜在药物作用靶蛋白的mRNA相杂交，总的表现为降低或抑制蛋白质的表达。SiRNA的构建及其应用在Elbashir，2001 Nature 411494；Brummelkamp，2002 Science296550；和Sui，2002 PNAS 99(8)5515中作有介绍。本发明的优选实施方案中提供了鉴定参与慢波形成的潜在药物靶(drug target)的方法，所述方法包括使从c-kit/无限增殖转基因动物体内分离的cajal间质细胞和靶特异性siRNA相接触，测定所述siRNA对所述细胞形成慢波的影响。
通过测定所述细胞中的Ca-摆动来测定慢波的形成。可使用各种技术实时测定离子流，例如传统的电生理技术，当可以使用电生理技术时，新的高通量(high throughput)筛选方法正在建立。尤其是使用完整细胞膜片钳技术来记录(转染有siRNA)ICC的膜电势或电流。类似的，利用离子敏感的荧光染料，如fluo-3、fluo-4、fluo-5N、fura红测定离子流，从而利用荧光计和荧光成像技术来进行实时分析，其中荧光成像技术包括带有或不带有激光共聚焦的荧光显微方法和成像分析公式联用。
另一个方法是化合物的高通量筛选分析，其中化合物作为激动剂或调节剂发挥活性、从而影响分离ICC中钙瞬间电流。该分析方法借助于称作荧光成像板读数仪((FLIPR)，Molecular Device公司)的仪器。在其最常见的构型中，它能够激发并测定荧光染料所发射的荧光。它使用氩离子激光产生荧光物质在488nm处的高能激发，使用光学系统快速扫描96-/384-孔板，使用灵敏的冷CCD相机捕捉所发射荧光。它还含有一个96-/384-孔移液吸头，使仪器能够将受试试剂的溶液转移到96-/384-孔板的孔中。设计FLIPR分析，在加入化合物之前、过程中或之后实时测定细胞群产生的信号，同时对所有96-/384-孔进行测定。可以使用FLIPR分析法筛选并鉴定对ICC具有活性的化合物，其中ICC从c-kit/无限增殖转基因动物体内分离得到。
举例来说，但决不具有限制性，可以监测细胞电生理、生理(例如，细胞中15个生理参数的变化，如细胞内或细胞外钙或其他离子浓度、pH变化、第二信使的存在或量上的变化、细胞形态、细胞活性、凋亡指标、分泌因子的分泌、细胞复制、接触抑制等)、形态等的变化。因此本发明的一个进一步方面是提供筛选调控ICC中慢波形成的化合物的方法，所述方法包含使根据本发明方法获得的cajal间质细胞和受试化合物相接触，测定所述受试化合物对所述细胞形成慢波的影响。在一个特定的实施方案中，所述细胞从包含本发明载体的转基因动物体内分离，更优选的是，所述细胞从c-kit/无限增殖转基因动物体内分离得到。
参照下面的实验细节可以更好地理解本发明，但是本领域的熟练技术人员也明白这些实验细节仅是本发明的示例，后面的权利要求书会更为全面地描述本发明。另外，整篇申请中引用了多种出版物。这些出版物的内容在本申请中引用作为参考，以更全面地描述本发明所述的技术领域。
实施例1 建立用于产生转基因小鼠的ZsGreen1/NoLS c-kit构建体引言Cajal间质细胞(ICC)产生对于肠蠕动重要的定步标记(慢波)。定步标记的分子机制尚不清楚。由于在解离过程中ICC的唯一标记物，即c-kit丢失，过去分离ICC的尝试都是不成功的。因此，我们将产生一种转基因小鼠，这种小鼠和WlacZ模型1类似，只是携带有位于c-kit启动子控制下的ZsGreen1基因，而非LacZ。核仁定位信号(NoLS)将和ZsGreen1相融合，产生一个浓缩的、亮荧光信号。这种定位的荧光报告基因将能够示踪活组织中的c-kit表达性ICC，和解离后的c-kit表达性ICC。
方法使用表1中提到的引物和退火温度，通过PCR(30”94℃，(30”94℃，1’Tm，1’ 72℃)25×)获得不同的NoLS(TCOF-12、RLP313、RPS254或Fxr2h5)和c-kit第一个外显子的一部分。分别用EcoRI和BamHI、SacI和EcoRI、SacI和BamHI对NoLS、c-kit和载体pZsGreen1-N1进行消化，并使它们相连接。将构建体(参见图1)转化到感受态E.coli中(one shot cells，Invitrogen)，DNA分离后瞬时转染COS-7(DOTAP，Roche)细胞。使用共聚焦显微镜和FACS对各构建体的亚细胞靶向效率和细胞毒性进行定量。固定后，使用TOPRO-3核染料(Molecular Probe)，用溶于PBS中的0.1μM TOPRO-3将细胞孵育5分钟对细胞核进行染色。
结果1.共聚焦显微观察显示了细胞核的红色信号(TOPRO-3核染色)和构建体的绿色信号(ZsGreen1)。
和不具有核仁定位信号的pZsGreen1-N1不同，NoLS构建体RPS25、TCOF-1和Fxr2h诱导荧光蛋白在核仁的积累(图2)。长时间后，这些核仁定位的ZsGreen1重新转运至细胞质中(图3)。
转染后24h，RPS25良好地定位于核仁中，但是在32h时，RPS25返回到细胞质中。TCOF-1信号较弱，仅缓慢地定位于核仁中(32h)。虽然有些Fxr2h-ZsGreen1定位于核仁中，但仍有大部分存在于细胞质中。
四个构建体中，RLP31能够最好地将ZsGreen1定位。定位的发生早在8h，持续至转染后32h。另人奇怪的是，该信号并不定位在细胞核中，而是定位在邻近细胞核的部位。用抗-球蛋白(MolecularProbes)对RLP31转染的HeLa细胞进行免疫染色，结果表明ZsGreen1确实定位于高尔基体中，不非定位于核仁中，和以前的报道相一致3(图3)。
2.RLP31转染细胞的FACS分析表明有20％的转染效率。转染和未转染群体中死亡细胞的百分比分别是8％～10％和5％～7％(数据未列出)。
为了比较未转染HeLa细胞和稳定转染HeLa细胞的增殖效率，进行了Via Light HS分析。72h时，不同克隆间没有观察到显著的差异，说明RLP31-ZsGreen1蛋白没有毒性(图5)。共聚焦显微分析表明5个克隆中RLP31-ZsGreen1的表达水平是相当的(数据未列出)。
结论除了RLP31将ZsGreen1定位于高尔基体之外，所有的NoLS(RPS25＞TCOF-13Fxr2h)都将ZsGreen1定位于核仁中。使用pZsGreen1-N1-c-kit-RLP31构建体获得了持续时间最长的定位。其表达不导致显著的细胞毒性，能够使得转染细胞通过共聚焦显微镜进行观察，通过流式细胞仪进行细胞分选。通过同源重组，pZsGreen1-N1-c-kit-RLP31正用于产生转基因Kit W-GFP小鼠。
表1.引物(SEQ ID No.3)c-kit正向 GAGCTCAGAGTCTAGCGCAGCC 521bp Tm＝61℃(SEQ ID No.4)c-kit反向 GGACAAACGTCAGGTCCGTGG(SEQ ID No.5)c-kit嵌套正向 CATGGAGCTCAGAGTCTAGCGCAG84bp Tm＝65℃(SEQ ID No.6)c-kit嵌套反向 GCTGTGAATTCACGGAGCAGGAC(SEQ ID No.7)RPS25正向 GACGACAAGAAGAAGAAAGATGCCG 302bp Tm＝58℃(SEQ ID No.8)RPS25反向 GCTCTGTGCTTTGAAACCAGCTTGA(SEQ ID No.9)RPS25嵌套正向 GACCCAGAATTCAAATCTGGTGGC53bp Tm＝66℃(SEQ ID No.10)RPS25嵌套反向TTGTFCGGATCCTCCCGAACTTTG(SEQ ID No.11)RLP31as1引物GCATCGAATTCCGCTTGTCCAGAAAACGTAAGGATCCTGAGG(SEQ ID No.12)FXR2H正向CGCCGTACTGATGAAGACAGGACTG 296bp Tm＝60℃(SEQ ID No.13)FXR2H反向GGAGCTTGCTGACAGAGTCACCCT(SEQ ID No.14)FXR2H嵌套正向GAATCAGAATTCAGACCCCAGAGACG 44bp Tm＝65℃(SEQ ID No.15)FXR2H嵌套反向CAGTCGGATCCCCACGATTACGG(SEQ ID No.16)TCOF-1正向GTGCTGGTGGCAAGGGGAAG 263bp Tm＝59℃(SEQ ID No.17)TCOF-1反向TCACACGGCAGGCTCGGCTG(SEQ ID No.18)TCOF-1嵌套正向GAAAGAATTCAAGAAAAAAAAAGACAAG 125bpTm＝58℃(SEQ ID No.19)TCOF-1嵌套反向GTATGGATCCCACACGGCAG
表2-所用的NoLS和c-kit序列
参考文献1.F.Bernex，P.De Sepulveda，C.Kress，C.Elbaz，and C.Delouis.WlacZ/+和WlacZ/WlacZ小鼠胚胎中c-kit表达细胞的空间和时间模式.Development 122(10)3023-3033，1996.
2.J.Dixon，K.Hovanes，R.Shiang，and M.J.Dixon.进化保守基序的测序分析、鉴定和小鼠tcof1的表达分析为该基因和人类同源物TCOF1的潜在功能提供了进一步的证据.Human Molecular Genetics6(5)727-737，1997.
3.I.K.Quaye，S.Toku，and T.Tanaka.大鼠核糖体蛋白L31的核仁定位所需的序列.European Journal of Cell Biology 69(2)151-155，1996.
4.Kubota，T.D.Copeland，and R.J.Pomerantz.人核糖体蛋白S25的细胞核和核仁靶向和HIV-1调控蛋白共有的特征.Oncogene18(7)1503-1514，1999.
5.F.Tamanini，L.L.Kirkpatrick，J.Schonkeren，L.van Unen，C.Contekoe，C.Bakker，D.L.Nelson，H.Galjaard，B.A.Oostra，and A.T.Hoogeveen.易损坏的X-相关蛋白FXR1R和FXR2P包含和HIV-1调控蛋白相当的功能性核仁靶向信号.Human Molecular Genetics9(10)1487-1493，2000.
实施例2.建立转基因小鼠模型构建了一个构建体，该构建体包含79个核苷酸的c-kit片段(外显子1的22nt的5′非编码序列agagtctagcgcagccaccgcg(SEQ ID No.24)和外显子1的57nt编码序列atgagaggcgctcgcggcgcctgggatctgctctgcgtcctgttggtcctgctccgt(SEQ ID No.25))、以前I.K.E.描述为NoLS定位信号的一个高尔基体信号肽序列和一个ZsGreen1编码序列。通过SacI-NotI消化可以将该片段从pZsGreen1-N1-c-kit-RLP31载体上分离。随后将该片段连接到小鼠c-kit基因外显子1的5′非编码区中的相同位置上(包含外显子1的gDNA片段的4262位置处MMCKITEX1)。为了使重组cDNA片段整合到小鼠c-kit基因的5′UTR中，设计了以下对策将目标cDNA克隆到中间载体pKI中。这使得我们能够获得剪接受体/剪接供体序列盒和多聚腺苷酸化信号，以及floxed PGKNeo标记。然后使中间载体中的SfiI序列盒随即交换为旁侧有SfiI的酵母标记，在酵母中通过同源重组导入包含c-kit基因的KOS基因组克隆。这样就将SfiI序列盒的5′区置到了基因的5′UTR中，我们能够尽可能多地删除天然基因。在包含Prm-CRE转基因的ES细胞中进行c-kit基因的最终靶向。在该ES细胞系中，精子发生Cre的表达受控于鱼精蛋白启动子。因此，当饲养产生于ES细胞系的嵌合小鼠时，靶等位基因传经雄性胚系，旁侧带有loxP位点的Neo序列盒切除，从而使Neo标记在嵌合体的饲养过程中切除。
2.1构建体已经克隆到了多个重叠的KOS克隆，并通过基因特异的测序进行了验证。通过限制性消化和部分测序产生并验证了cKit-nols-GFP敲入靶载体。通过电穿孔法将靶载体导入ES细胞中。
对gDNA文库进行筛选，结果从组装成小鼠毗邻序列区(图4)的c-kit基因座上分离到了数个基因组克隆(pkos/JNJ33/32和pkos/JNJ33/85)。在该序列中，包含c-kit/GFP融合体的pKI-PLUS选择序列盒插入到了核苷酸5583～5686的位置。将c-kit/GFP融合体构建体以BglII-SacII片段形式克隆到pKI-PLUS中的BglII-SacII上(图3)。
为了验证基因型，设计了以下对策
SOUTHERN利用5′端探针JNJ33-19+JNJ33-20进行Southern分析，验证基因型。可以使用小鼠基因组DNA作为模板，使用引物JNJ33-19+JNJ33-20(参见下文)来扩增该探针。对经KpnI消化的尾基因组DNA进行Southern印迹分析，会产生一个源于野生型等位基因的13kb和一个来源于靶向等位基因的8kb条带(Neo切除后的条带)。请注意如果ES细胞DNA用作对照，则JNJ33-19+JNJ33-20探针将用于检测来源于靶向(未切除)等位基因的条带，JNJ33-19+JNJ33-20是一个5′探针，KpnI在Neo序列盒的5′一侧进行切割。
PCRPCR基因型验证可用于区分野生型等位基因和靶向等位基因。引物JNJ33-2+JNJ33-25应该从WT等位基因中扩增得到一个238bp的产物(Neo切除后)。提供的ES细胞具有靶向的、未切除的等位基因，不能作为该分析的阳性对照。
引物序列Southern序列JNJ33-19 5′-CATTCAGAGATATTTAAAGTGCTC(SEQ IDNo.26)JNJ33-20 5′-CGTTTGGATTCTAAAAGTAAG(SEQ ID No.27)PCR基因型验证KI5′5′-GTTGAGATGGGACTGCAGGAA(SEQ ID No.28)JNJ33-2 5′-CAGCTCAGGTGAGCGAGGCG(SEQ ID No.29)JNJ33-25 5′-GAGGCGCTCGCGGCGCCTGGGA(SEQ IDNo.30)2.2 ES细胞和嵌合体分离了400个ES细胞克隆，准备用于Southern印迹筛选。
鉴定到了数个靶向ES细胞克隆，并在两个同源臂上都得到了证实。另外，还通过Neo Southern筛选了具有随即靶向载体插入的克隆。
产生了6个雄性嵌合体和3个雌性嵌合体。一个雄性5％嵌合体是第一个给出胚系转移的嵌合体。
实施例3.将c-kit-ZsGreen转基因小鼠和无限增殖小鼠(CharlesRiver)一起饲养为了获得带有大T抗原的荧光ICC，杂合的c-kit雌性小鼠和无限增殖转基因的纯合雄性小鼠(H-2Kb-tsA58)一起饲养。通过尾部活组织检查验证所产生后代的基因型。
PCR验证杂合动物的基因型根据Qiagen或酚小鼠尾部DNA方案从小鼠尾部提取基因组DNA。每次提取～100ng基因组DNA，典型1μg用作模板。根据PCR准备方案(50μL反应体系)在并上准备1×10×PCR缓冲液 5μL(含有15mM MgCl2的Boehringer)10mM dNTP(Invitrogen) 2μL50μM混合的引物 1μL5U/μL Taq聚合酶 0.2μLDdH2O 40.8μL每管加49μL总的混合物，加入1μL模板DNA程序1× @94℃；4min30×@94℃；30sec58℃；1min72℃；1min 30sec1× @72℃；5min寡聚c-kit-ZsGreenKI5’5’-GTTGAGATGGGACTGCAGGAA(SEQ ID No.28)JNJ33-2 5’-CAGCTCAGGTGAGCGAGGCG(SEQ ID No.29)JNJ33-25 5’-GAGGCGCTCGCGGCGCCTGGGA(SEQ ID No.30)
野生型动物对JNJ33-2+JNJ33-25显示出一条238bp的带，而c-kit-ZsGreen小鼠对KI5+JNJ33-2显示出一条300bp的带。
寡聚无限增殖小鼠组分Immo15’-AGCGCTTGTGTCGCCATTGTATTC(SEQ ID No.31)Immo25’-GTCACACCACAGAAGTAAGGTTCC(SEQ ID No.32)无限增殖组分携带者显示出一条～1000bp的带，而WT动物则不显示该带。
实施例4.产生ICC细胞系将c-kit-ZsGreen-无限增殖小鼠组分杂合小鼠的空肠解剖成肌肉条，并进行酶消化，以获得单个细胞。通过荧光活化的细胞分选仪(MOFLO)选择荧光细胞，开始原代细胞培养。将细胞于33℃培养会激活大T抗原，这些原代细胞培养物将可以无限增殖，随后分离单克隆细胞系。
4.1单细胞解离将任意性别的c-kit/无限增殖复合物杂合小鼠(对于细胞培养来说9～15天大小)引颈处死。取出小肠，并置于冷的Krebs-Ringer缓冲液中。洗去腔内容物，用一对细小的镊子将黏膜取下。解剖的肌肉条在包含(mM)125 NaCl、5.36 KCl、15.5 NaOH、0.336 Na2PO4、0.44KH2PO4、10葡萄糖、2.9蔗糖和11 HEPES(pH7.4)的无Ca的HanK’s溶液中平衡1h。对组织进行轻洗，于包含无Ca的HanK’s溶液、1.3mg/mL胶原酶(II型；Worthington)、2mg/mL牛血清白蛋白(Sigma)、2mg/mL胰蛋白酶抑制剂(Sigma)和0.55mg/mL三磷酸腺苷的酶溶液中静置过夜。第二天，组织于37℃孵育5min，用无Ca的HanK’s溶液重复洗涤，将酶去除。将组织小块研磨成离散的细胞。
Ref.Epperson A.et al.，Am.J.Physiol.Cell.Physiol.279C529-C539，20004.2细胞选择MOFLO通过荧光活化的细胞分选对细胞内GFP标记的Kit表达细胞进行选择，将产生高度富集有Kit+ICC的活细胞群。
单细胞悬液是关键的。因此，在上样到流式细胞仪之前将样品经40微筛加以过滤。1*106细胞/mL的浓度将以1000细胞/秒的效率进行分选。维持下列规格电压板为2700V，液滴延迟频率为97～98kHz，液滴延迟振幅为15V。可以随时根据需要进行进一步调整。可以根据纯度或回收方式优化MoFlo。Cyclone，一个自动控制的微孔滴定板控制器，可以完全程序化地进行分选，包括克隆(单细胞分选)。
通过免疫染色法kit+细胞和sv40+细胞的百分比，作为质控。带有内部ZsGreen荧光的细胞将被选择为kit+细胞(ICC)，用冷的甲醇固定10min后，使用抗SV40大T抗原的单克隆抗体(pab419-alexa594)进一步检测SV40大T抗原的存在。通过激光共聚焦显微镜检测红色(pab419-alexa594)和绿色(ZsGreen1，λ＝488)荧光。
4.3细胞培养随后将细胞培养在SM培养基中，据报道该培养基配方有利于ICC培养。
将产生的细胞悬液铺在包被有小鼠胶原的无菌玻璃盖片条上。使细胞适应10min后，加入培养基。培养基是添加有2％抗生素/抗麻醉剂(GIBCO)和小鼠干细胞因子(SCF 5ng/mL，Sigma)的SMGM(Clonetics)。往每mL培养基中添加10个单位的干扰素γ。细胞于33℃、90％O2-10％CO2条件下孵育，33℃是tsA58大T抗原表达的温度。24h后，将培养基换为含有SCF、而不含有抗生素/抗麻醉剂的SMGM，然后隔天换液，直至细胞能够用于其他实验。但细胞将长满时，使用胶原酶和蛋白酶(Boehringer Mannheim)的混合物将细胞传代，后期(6代之后)可以使用胰蛋白酶。培养物以小于1∶3的比例传代，使用Mycoplasma PCR ELISA试剂盒(Roche)验证Mycoplasma的存在与否。进一步的所有实验都在33℃、10％CO2条件下进行。3个月后，干扰素γ浓度可以降至1单位/mL，而对细胞生长没有副作用。
Ref.S.D.Koh，K.M.Sanders，and S.M.Ward.来源于小鼠小肠的、培养的cajal间质细胞的自发性电节律.Journal of Physiology 513(pt1)203-213，1998.
Whitehead et al，1993.来源于成年-2Kb-tsA58转基因小鼠结肠和slamm肠的、条件固化的上皮细胞系的建立.Proc.Natl.Acad.SciUSA 90，587-591.
实施例5.评价ICC细胞系和慢波形成过程中潜在靶点的参与一旦建立了ICC细胞系，就必须验证ICC在体外形成慢波的潜力。其次，如果ICC形成慢波，则验证参与慢波形成的候选基因。短干扰RNA(siRNA)是基于序列特异性靶向和RNA降解的基因调控类型，是下调特定靶基因的一种简单方式。电生理学研究可以证实它们是否参与慢波的形成。
5.1电生理实验将使用完整细胞膜片钳技术来记录(siRNA转染的)ICC的膜电势或电流。如果ICC培养物表现出自发性的慢波，则通过siRNA将一些候选基因敲除，观察慢波的频率和振幅来验证这些候选基因的功能。
使用标准的膜片钳放大器(EPC9 HEKA)可以放大电势或电流。使用Pulse软件(HEKA)将数据数字化。使用8孔Bessel滤器在1kHz处对数据进行过滤。培养的细胞在包含(mM)5 KCl、135 NaCl、2CaCl2、10葡萄糖、1.2 MgCl2和10 N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙磺酸(HEPES)，并用三羟甲基氨基甲烷(TRIS)调整至pH7.4的溶液中洗涤。用不同浓度的n-甲基-D-谷氨酰胺取代NaCl。还用MnCl2取代CaCL2。移取(pipette)溶液包含(mM)110K-葡萄糖酸盐、20KCl、5 MgCl2、2.7 K2ATP、0.1 Na2GTP、2.5肌酸磷酸二钠、5HEPES和0.1 EGTA，用TRIS调整至pH7.2。
使用Pulse Fit(HEKA)和Igar Pro软件对结果进行分析。
5.2 siRNA作为工具下调特异基因5.2.1体外转录和siRNA杂交在10mM Tris-HCl pH9.0、100mM NaCl、1mM EDTA中，通过煮沸2min，2～3h内缓慢冷却至室温使寡聚模板链和正义T7启动子序列(5′TAATACGACTCACTATAGG 3′)相杂交。使用MEGAshortscriptTMT7试剂盒(Ambion)，根据生产商的建议进行转录。在G-25旋转柱上，使用Heavy Phase-Lock凝胶(Eppendorf)进行酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)提取，及乙醇-80℃沉淀过夜来纯化siRNA链。在1mM Tris-HCl pH8.0、1mM EDTA pH8.0中，通过煮沸2min、2～3h内缓慢冷却至室温使互补siRNA链相杂交。在非变性20％聚丙烯酰胺TBE凝胶上进行双链和单链siRNA的电泳，评价杂交效率。
5.2.2细胞系和转染ICC在上述培养基中培养。根据Elbashir等(Nature 2001)的方法转染细胞。转染前24h，细胞用胰蛋白酶进行消化，用不含抗生素的生长培养基稀释至3×105细胞/mL。将细胞接种到24孔板中，每孔0.5mL。使用LipofectamineTM2000(LF2000；Invitrogen)，根据生产商的建议，用50pmol单链或25pmol双链siRNA转染细胞。具体地说，对于每孔，我们将2μL LF2000稀释在48μL无血清无抗生素的培养基中。稀释的LF2000在室温预孵育1min，然后和稀释在相同培养基中至终体积50μL的siRNA相混合。复合物于室温孵育20min，然后加到细胞中。对于siRNA剂量应答实验，使用6-孔板。细胞数增加4倍，试剂增加约5倍。
实施例6.筛选作为上述电生理实验的替换方案，通过FLIPR测定可能负责慢波的Ca波动。以这种方式，通过测定ICC细胞系中的Ca波动，也可以鉴定增加或减小慢波形成的振幅和/或频率的化合物。
Protocol Flipr膜电势分析试剂盒(Clontech)
试剂盒组成每个FLIPR膜电势分析试剂盒(cat.#R8034)都包括下列组分，足够做100个96-孔板或384-孔板。
-1瓶10×试剂缓冲液，组分B(含有200mM HEPES，pH6.0的10×Hank’BSS)-10小瓶FLIPR膜电势分析试剂，组分A-每小瓶足够做10个96-孔板或384-孔板不包括试剂盒中的其他所需材料-NaOH和HCl，用于调整pH-购自Molecular Devices的540～590 Bandpass FLIPR Filter试剂盒细胞操作将板置于FLIPR系统之前，膜电势分析试剂盒要求产生长满的细胞单层。
对于贴壁细胞来说，细胞接种过夜，对于96-孔板铺板体积为100μL/孔，对于384-孔板铺板体积为25μL/孔。
6.1制备上样缓冲液下面的步骤适用于10个96-孔板或384-孔板，利用如上所述制备的贴壁细胞进行。
1.1为了配制1×试剂缓冲液，吸取10mL 10×试剂缓冲液(组分B)，用蒸馏水稀释至100mL。用NaOH调整至pH7.4。
注意根据细胞类型和用途，FLIPR膜电势试剂盒提供的Hanks/HEPES缓冲液可能并不是理想的选择。如果该缓冲液不理想，不同的使用者为了达到最佳效果，可以采用其他的缓冲液。
1.2取出一小瓶膜电势分析试剂(组分A)加入10mL1×试剂缓冲液，将小瓶的内容物完全溶解。反复吹打混匀，直至内容物完全溶解。
1.3警告提供的组分对于适当的细胞上样是足够的。为了获得最佳结果，千万不要加入多余的试剂或改变体积。
将小瓶混合物稀释到90mL1×试剂缓冲液中来配制上样缓冲液。有必要对小瓶进行多次冲洗，以将内容物完全转移。
6.2使用上样缓冲液进行细胞上样从孵箱或离心机中取出细胞板。不要移出上清液。往各孔中加入等体积的上样缓冲液(96-孔板为100μL/孔，384-孔板为25μL/孔)。虽然Molecular Devices并不建议在染色上样之前洗细胞，在加入上样缓冲液之前可以洗去生长培养基和血清因子，只要终体积和所述相同。或者，细胞培养在无血清的条件下。
2.2注意在某些情况下，在室温下孵育可能效果更好。
2.2将细胞板于37℃孵育30min。
警告染色上样后不要洗细胞。
2.3配制化合物在分析过程中，在细胞板中将化合物配制成终浓度的2×、3×、4×或5×。需要快速进行测定，以显示快速的细胞动力学。由于有效混合的需要，建议体积比不小于1∶3至1∶4。为了避免将贴壁能力较弱的细胞吹起，应该往细胞板中加入较小的化合物体积。
2.4洗细胞洗液的需要量为150mL/96孔板或200mL/384孔板。用细胞洗液洗细胞3～4次。
6.3运行FLIPR膜电势分析3.1孵育前，取出位于FLIPR系统的滤门内的滤光片架。简单地说，将固定滤光片架的两个螺丝松开，将架放在洁净的或铺有毛巾的桌面上。滤光片#2位置应该是空的。顺时针将螺丝松开，移出一个环。小心将540～590 bandpass发射滤光片放在#2位置上，将环螺回原处，使V型槽口朝外。将滤光片架放在FLIPR系统中的正确位置上。
3.2在FLIPR软件的实验设置中选择滤光片#2。孵育后，将板直接转移FLIPR系统中，开始膜电势分析。膜电势分析可以在室温至生理温度的条件下运行。
3.3推荐使用的实验设置参数如下。注意加入速率比传统方案快，这是因为新的上样程序后增加了细胞的强度。
更快的加入速度导致更好的混合和板上更低的信号差异。
权利要求
1.能够整合到野生型c-kit等位基因中的c-kit质粒靶向载体，所述载体的特征是编码包含核仁定位信号的嵌合荧光蛋白。
2.权利要求1的c-kit质粒靶向载体，其中核仁定位信号选自TCOF-1、RLP31、RPS25和Fxr2h。
3.权利要求1的c-kit质粒靶向载体，其中核仁定位信号由RLP31组成。
4.权利要求1的c-kit质粒靶向载体，其中荧光蛋白选自EGFP、EYFP、EBFP、ZsGreen1、ZsYellow1、DsRed、AmCyan、AsRed。
5.权利要求1的c-kit质粒靶向载体，其中荧光蛋白由ZsGreen1组成。
6.权利要求1的c-kit质粒靶向载体，其包含SEQ ID No.1。
7.一种细胞，它被权利要求1～6任意一项的c-kit质粒靶向载体转染。
8.根据权利要求7的细胞，其中所述细胞是哺乳动物细胞。
9.根据权利要求8的细胞，其中所述细胞能够在适当的培养基中连续生长。
10.根据权利要求9的细胞，其中所述细胞选自COS-7、colon26。
11.根据权利要求9或10的细胞，其中所述细胞由COS-7组成。
12.一种转基因非人类动物，其包含权利要求1～6任意一项的c-kit质粒靶向载体。
13.从权利要求12中的转基因动物分离c-kit表达细胞的方法，所述方法包括以下步骤(a)解离包含c-kit表达细胞的组织；和(b)从所述解离组织中分离包含c-kit质粒靶向载体的荧光标记细胞。
14.根据权利要求13的方法，其中使用细胞分选仪进行分离步骤。
15.根据权利要求14的方法，其中细胞分选仪是流式细胞仪。
16.根据权利要求13的方法，其中包含c-kit表达细胞的组织选自Cajal间质细胞、造血干细胞、上皮细胞和内分泌细胞，如朗氏岛的细胞、肾上腺髓质细胞、甲状腺细胞、松果体细胞和垂体细胞。
17.根据权利要求16的方法，其中包含c-kit表达细胞的组织由Cajal间质细胞组成。
18.一种c-kit表达细胞，其可根据权利要求13～17任意一项的方法获得。
19.根据权利要求18的c-kit表达细胞，其用于建立原代细胞系。
20.鉴定参与慢波形成的潜在药物靶的方法，所述方法包括用靶特异基因沉默手段对可根据权利要求17的方法获得的Cajal间质细胞进行处理，测定所述基因沉默手段对所述细胞形成慢波的影响。
21.根据权利要求20的方法，其中基因沉默手段包括使用反义序列或短干扰RNA(siRNA)。
22.根据权利要求20的方法，其中的Cajal间质细胞分离自c-kit/无限增殖转基因。
23.根据权利要求20的方法，其中基因沉默手段由靶特异的siRNA组成。
24.筛选调节Cajal间质细胞(ICC)中慢波形成的化合物的方法，所述方法包括使可根据权利要求17的方法获得的ICC和受试化合物相接触，测定所述化合物对所述细胞形成慢波的影响。
25.根据权利要求24的方法，其中使用离子灵敏性荧光染料和荧光测定仪和荧光成像技术测定慢波的形成。
26.根据权利要求25的方法，其中离子灵敏性荧光染料是钙离子灵敏性染料，优选地选自fluo-3、fluo-4、fluo-5N和fura red。
27.根据权利要求25的方法，其中荧光成像技术由荧光成像板读数仪(FLIPR)组成。
全文摘要
本发明为分离c－kit表达细胞提供了一个工具。该工具由c－kit质粒靶向载体组成，该载体能够整合到野生型c－kit等位基因上，并编码包含核仁定位信号，如TCOF－文档编号C12N5/10GK1604967SQ02824941
公开日2005年4月6日 申请日期2002年12月12日 优先权日2001年12月12日
发明者M·M·W·沃特尔斯, K·A·A·斯曼斯, J·－M·范德温登 申请人:詹森药业有限公司