重组牛凝血酶的制作方法

专利名称：重组牛凝血酶的制作方法
技术领域：
本发明总体上涉及生产重组蛋白的方法，更具体地说是从宿主细胞中生产不需要Xa因子活化的、前体分子形式的重组牛凝血酶的方法，凝血酶是一种特异性的丝氨酸蛋白酶，是酶中胰蛋白酶样家族的一个成员。在血液稳定中发挥着中心作用，调控促凝血和抗凝血两个途径(Fenton，J.W.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，370468-495，1981)。作为凝血因子，凝血酶催化不溶性纤维的形成，从而启动血液凝结级联反应。在抗凝血的情况下，凝血酶和内皮细胞表面上的血栓调节素相互作用，这种相互作用引起下一步C蛋白(protein C)的活化(Esmon et al.，J.Biol.Chem.，257859-864，1982)。除了凝血酶在血液平衡中的调节作用外，已知它够够和广泛的多种细胞类型发生相互作用。这些相互作用导致广泛的一系列作用，包括血小板聚集、促进生长、轴突退缩、趋化反应(Bizios，et al.，J.Cell.Physiol.，128485-490，1986)。
凝血酶以酶原形式表达和分泌，以无活性原凝血酶(prothrombin)前体的形式循环。酶通过一个级联反应活化成功能状态，其中级联反应包括涉及Xa因子切割的一个关键加工步骤(

图1)。活化级联反应的终产物(γ-凝血酶)是通过二硫桥共价连接的36-残基“A链”和256-残基“B链”(图2)。已知凝血酶还具有重要的翻译后加工修饰。血清蛋白的活化形式具有单一的N-连接糖基化位点，但是原凝血酶形式包含一个额外的糖基化基团，和10个γ-羧化位点。
凝血酶除了具有关键性生理调节因子的作用外，还是生物技术工业用酶。该蛋白酶用在用于切割融合肽的多种商业来源的微生物表达系统中，还用于去除纯化“标签”和分析“标签”。该蛋白酶的吸引力在于其催化效率和切割位点特异性。这在某种程度上另人惊讶，因为凝血酶和已知能够切割广泛的一系列多肽底物的一种丝氨酸蛋白酶，即胰蛋白酶相关。凝血酶比胰蛋白酶和丝氨酸蛋白酶家族的其他成员更为特异。该酶识别四个氨基酸序列LVPR和其他多个位点。在商业系统中，切割序列LVPRGS使用最为频繁。
目前用于商业加工的凝血酶来源于牛血浆。既然凝血酶是生物技术工业用酶，因此需要建立更有效的商业性生产方法来适应这一逐渐增长的需要。重要的是，由于可转移性海绵状脑病的危险性，特别是牛海绵状脑病(BSE)或称之为“疯牛病”的危险性，使用动物来源材料(ASM’s)生产凝血酶受到规章制度的限制，因此需要使用重组形式的凝血酶。
因而，需要经济性生产的重组凝血酶来顺应使用动物来源材料(ASM’s)生产凝血酶受规章制度限制的情况，适应对凝血酶逐渐增长的需要。本发明通过提供两种凝血酶前体分子，原凝血酶和前凝血酶-2(prethrombin-2)满足了这些需要。原凝血酶和前凝血酶-2活化生成的凝血酶和动物来源凝血酶在一定温度和pH值范围内的动力学特征和酶稳定性方面都是基本相同的，但是不需要Xa因子的活化。意料之外的是，可以对重组原凝血酶进行纯化，随后使之在体外发生自我活化，而重组的前凝血酶-2前体以完全活化酶的形式分泌和纯化。
本发明提供了一种编码重组牛凝血酶前体分子的分离核酸，其中所述的前体分子是人工改造形式的原凝血酶，所述的核酸在CHO细胞(SEQ ID NO5)或大肠杆菌细胞(SEQ ID NO1)中表达。
本发明进一步提供了编码重组牛凝血酶前体的分离核酸，其中所述的前体分子是人工改造形式的前凝血酶-2，所述的核酸在CHO细胞(SEQ ID NO7)或大肠杆菌细胞(SEQ ID NO3)中表达。
本发明进一步提供了编码具有SEQ ID NO6所示氨基酸序列之多肽的多核苷酸，其中所述的多肽是重组牛凝血酶前体分子原凝血酶，所述的多肽在CHO细胞中表达。
本发明进一步提供了编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列之多肽的多核苷酸，其中所述的多肽是重组牛凝血酶前体分子原凝血酶，所述的多肽在大肠杆菌细胞中表达。
本发明进一步提供了编码具有SEQ ID NO8所示氨基酸序列之多肽的多核苷酸，其中所述的多肽是重组牛凝血酶前体分子前凝血酶-2，所述的多肽在CHO细胞中表达。
本发明进一步提供了编码具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列之多肽的多核苷酸，其中所述的多肽是重组牛凝血酶前体分子前凝血酶-2，所述的多肽在大肠杆菌细胞中表达。
本发明进一步提供了纯化所述牛凝血酶前体分子的方法和使用这些方法的方法。
图1.原凝血酶的活化程序。凝血酶是以无活性“原-形式”前体分子(原凝血酶)形式分泌的血清蛋白(这里未列出前原(prepro)-形式)。通过预先存在的、游离-循环的凝血酶以及Xa因子的作用，原凝血酶分子经切割产生具有完全功能和活性的、由两条肽链(分别为A链和B链)组成的凝血酶，两条肽链通过一个二硫键相连。蛋白酶切割位点表示为。前凝血酶-2是凝血酶的最小单链前体。
图2.具有野生型(Xa因子)活化序列的重组凝血酶构建体。草图说明了2-链蛋白。天然“A”链由36个氨基酸组成(这里示为具有55个残基的“重组版本”)。B链由259个氨基酸残基组成。如关键框中所述标出了二硫键连接、催化残基和糖基化位点。另外，该图右下方示出了三个凝血酶物种的基因结构。
图3.设计用来扩增和修饰编码凝血酶几个前体之cDNA序列的引物。
图4.用于在大肠杆菌中表达的前凝血酶-2表达序列盒修饰。完整的表达序列盒(示为5′至3′)扩增为NdeI-BamHI片段。通过重叠延伸诱变(OEM)PCR引入内部突变。变化用粗体和下划线注明。
图5.从Genbank数据库中的核苷酸序列翻译的氨基酸序列，但是包含cDNA克隆后测得的氨基酸变化。注意从牛肝脏cDNA中克隆的基因和Genbank数据库序列相比，发现有三个氨基酸变化。在图中用粗体注明了这些变化。对43个氨基酸的前导序列(或信号肽)加了下划线。分子的“pro”部分或“活化”肽(残基#44～314)表示为斜体。推断的N-连接糖基化位点(天冬氨酸残基)位于残基144和419。对Xa因子切割位点(天然活化)加了波浪状下划线。星号表示终止密码子。观察到的具体氨基酸变化如下精氨酸95变为赖氨酸；组氨酸230变为丝氨酸；组氨酸248变为天冬氨酸。
图6.对从本发明来源序列中克隆的序列进行证实的初步构建过程。
图7.Xa因子活化的重组前凝血酶-2表达序列盒的氨基酸序列。注意Xa因子切割位点以粗体表示。
图8.可替代活化的DNA接头序列。示出了各寡核苷酸衔接物的核苷酸和产生的翻译产物。衔接物以SacI-StuI片段的形式直接克隆到pSFH2250骨架(backbone)中。可能的情况下，通过引入单一的限制性位点来区分可替代的切割序列盒，用于随后的诊断目的。
图9.表达质粒-大肠杆菌可替代活化表达构建体。
图10.细菌克隆和表达载体骨架。
图11.IMAC操作序列。分别用作N端IMAC(NdeI)和C端(BamHI)多聚组氨酸(6×)添加物的“标签”操作序列。
图12.表达质粒-CHO细胞表达构建体。
图13.在大肠杆菌中表达的、凝血酶活化的原凝血酶核苷酸序列SEQ ID NO1。
图14.在CHO细胞中表达的、人工改造的原凝血酶的氨基酸序列SEQ ID NO6。
图15.在大肠杆菌中表达的、人工改造的原凝血酶的氨基酸序列SEQ ID NO2。
图16.在大肠杆菌中表达的、人工改造的前凝血酶-2的氨基酸序列SEQ ID NO4。
图17.在CHO细胞中表达的、人工改造的前凝血酶-2的氨基酸序列SEQ ID NO8。
图18.大肠杆菌人工改造的前凝血酶-2表达序列盒(凝血酶活化的)核苷酸序列SEQ ID NO3。
图19.哺乳动物人工改造的前凝血酶-2，包括天然的前原凝血酶(preprothrombin)前导序列(用凝血酶可去除的3′多聚组氨酸序列标签活化的凝血酶)表达序列盒核苷酸序列SEQ ID NO7。
图20.在CHO细胞中表达的、能够为凝血酶活化的原凝血酶核苷酸序列SEQ ID NO5。
图21.用在哺乳动物细胞表达序列盒(cassette)中的寡核苷酸/PCR引物。
为了实现本发明目的，如这里所公开和声明的，下列术语定义如下。
信号肽序列编码分泌肽的DNA片段。信号肽序列还称为前导序列和/或先导序列。分泌肽是能够指导成熟多肽或蛋白质从细胞分泌的氨基酸序列。分泌肽典型特征是在新合成的蛋白质氨基末端典型地(但非排他性地)具有疏水氨基酸核心。在分泌过程中分泌肽从成熟蛋白质切割。这种分泌肽含有加工位点，该分泌位点使得在分泌途径中分泌肽和成熟蛋白质得以切割开。加工位点可以编码在分泌肽中，也可以通过体外诱变加到肽上。
Pro序列编码肽原、并用于指导蛋白质或肽加工或作为蛋白质或肽加工信号的DNA片段。Pro序列以pre序列为先导，可以在加工过程中和蛋白质相分离。
“分离核酸”是从至少一种杂质核酸分子中鉴定及分离的核酸分子，这些杂质核酸分子通常和天然来源的核酸相结合。这种分离的核酸分子和天然存在形式不同，因此，能够将分离的核酸分子和天然细胞中存在的核酸分子相区分。
凝血酶能够切割纤维蛋白原中特定的键，生成能够自我组装形成纤维凝块之纤维单体的两条链的、二硫键连接的、糖基化多肽。
表达载体包含编码感兴趣蛋白质的DNA序列、促进蛋白质表达的启动子及其他序列，如转录终止子和多聚腺苷酸化信号的DNA分子。表达载体进一步包含能够在宿主细胞中复制的遗传信息，复制可以是自主复制或整合到宿主基因组中复制。使表达载体在宿主细胞中自主复制的这种遗传信息对于本领域的熟练技术人员来说是清楚的，包括已知的哺乳动物和细菌复制起点。如这里更具体加以描述的，细菌和哺乳动物表达载体通常含有细菌复制起点。通常用于重组DNA的表达载体有质粒和某些病毒，这些载体可以既含有质粒元件又含有病毒元件。它们还可以包括一个或多个选择标记。
转染或转化通过导入纯化DNA、稳定并可遗传得改变接受细胞或微生物基因型的过程。通过接受有机体中表型的改变与否可以典型地检测这种转染或转化过程。术语“转化”通常用于描述微生物，而“转染”用于描述来源于多细胞有机体的细胞中的这一过程。
DNA构建体通过人为介入进行修饰，包含以自然界中不存在的方式组合及并置在一起之DNA片段的DNA分子或这种分子的克隆，可以是单链的，也可以是双链的。DNA构建体包含指导编码感兴趣多肽的DNA序列转录和翻译的、可操作性相连的元件。这些元件包括启动子、增强子和转录终止子。如果编码感兴趣多肽的DNA序列含有一个分泌信号序列，就认为包含适当元件的DNA构建体能够指导多肽的分泌。
这里用到的融合多肽或融合蛋白包括和异源肽或蛋白质相融合的多肽、蛋白质片段、变体或衍生物。融合位点处通常包含一个能够被特异性酶，如凝血酶切割的切割位点。异源肽和蛋白质包括，但不局限于便于融合肽检测和分离的表位；跨膜受体蛋白或其组成部分，如细胞外结构域；或跨膜或细胞内结构域；能够和跨膜受体蛋白结合的配体或其组成部分；具有催化活性的配体或其组成部分；促进寡聚化的蛋白质或肽，如亮氨酸拉链结构域；增加稳定性的蛋白质或肽，如免疫球蛋白恒定区(Fc融合蛋白)。
C蛋白衍生物指重组产生的、与野生型人C蛋白不同的、活化时保留有蛋白水解作用、酰胺水解作用、酯水解作用和生物学作用(抗凝血、抗炎、纤维蛋白溶解活性)等基本特征。这里用到的人C蛋白衍生物的定义还包括活化的形式。
本发明的一个目的是提供利用重组方法生产凝血酶的方法。本发明的一个特征是使用包含编码原凝血酶的DNA序列的一个表达载体。本发明的另一个特征是使用包含编码前凝血酶-2的DNA序列的一个表达载体。本发明还有一个特征是使用宿主细胞中的表达载体生产人工改造的凝血酶前体，这种凝血酶前体或者在体外自我活化，或者以活化的形式分泌，因而不需要Xa因子的加工。
这里用于克隆或表达载体中核酸(DNA)的适当宿主细胞包括原核细胞、酵母或更高等的真核细胞。适当的原核细胞包括但不局限于真细菌类，如格兰氏阴性或格兰氏阳性生物有机体，例如大肠杆菌K12菌株MM294(ATCC 31.446)；大肠杆菌X1 776(ATCC 31.537)；大肠杆菌菌株W3 110(ATCC 27.325)和K5 772(ATCC 53.635)。其他适当的原核宿主细胞包括肠杆菌，如埃希杆菌属，例如大肠杆菌、肠细菌、欧文菌、克雷伯杆菌、变形杆菌；沙门菌属，例如伤寒沙门菌；沙雷菌属，例如粘质沙雷菌；志贺杆菌属；杆菌属，如枯草杆菌和地衣杆菌(如1989年4月12日出版的DD266,710中公开的地衣杆菌41P)；假单胞菌属，如绿脓假单胞菌和链霉菌属。这些例子都是示例性的，不具有限制性。
本发明的一个实施方案是在大肠杆菌中克隆和表达重组牛凝血酶前体，用于评价重组酶作为生化工业中目前使用的动物来源酶的潜在替代品的可能性。在微生物系统中生产酶，然后在体外利用凝血酶加以活化。蛋白质以包涵体的形式产生，包涵体需要重新折叠以获得能够自我活化的正确折叠物质。核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
牛凝血酶cDNA编码含有625个氨基酸的肽，该肽含有43个残基的前导序列(分泌信号肽)和582个残基的原凝血酶肽。利用牛肝脏cDNA作为模板，通过PCR进行序列扩增来实现编码牛前原凝血酶基因的cDNA的克隆。通过对多个独立扩增及克隆的DNA序列进行分析，阐明了PCR相关的序列改变的潜力。设计图3中的引物来扩增编码包括前原凝血酶、原凝血酶和前凝血酶-2分子在内的多个凝血酶前体的cDNA。由于全长cDNA序列(前原凝血酶)长度约为2.1Kb，为了促进扩增和克隆反应，还扩增了该序列中的较小“片段”。这些cDNA“片段”还为共有序列衍生物提供了额外的独立扩增序列。
指定大肠杆菌表达系统来接受NdeI(5′限制性位点)至BamHI(3′限制性位点)基因序列盒。结果是设计PCR产物往扩增产物中引入了这些位点。在某些情况下，这些位点在扩增序列中天然存在，因此必须将这些天然位点去除。对于将来的人工改造目的来说具有单一的内部限制性位点也是有益的。根据发表的序列(genbank登记号#J00041)，在cDNA中存在有天然的BamHI和BglI限制性位点，在克隆过程中去除了这些位点。另外，为了根据分泌目的的需要对信号序列进行人工改造，还引入了单一的XhoI位点。因为这些位点是随后人工改造和克隆目的所必需的，去除和/或引入这些位点(不改变氨基酸序列)。因此，合成的、用于扩增基因中较小片段的引物用来引入这些“沉默”的核苷酸改变。具体地说，这些改变包括往5′区引入XhoI位点；为了修饰分子的3′末端，去除天然存在的BamHI位点和两个BglI位点中的一个位点(3′区)。
将独立扩增到的cDNA序列和“片段”直接克隆到TA克隆载体上，并分析克隆序列。将克隆的序列进行比对，获得一个共有序列。对来源于独立扩增的多个克隆的共有序列和Genbank序列进行比较，结果说明存在有多个核苷酸差异。在这些核苷酸差异中，和发表序列相比较，仅有三个氨基酸发生了改变(位置如图5中粗体所示)。改变的三个残基均存在于蛋白质的“pro”部分中，其中一个差异(R95K)是保守改变。从氨基酸的化学角度来说，另外两个氨基酸改变是相当大的改变。在两种情况下，都是碱性氨基酸(组氨酸)发生了改变；在其中一种情况下，改变产生中性(极性)残基(H230S)。在第三种情况下，碱性残基转化成了一个酸性残基(H248D)。对于cDNA中的每个核苷酸位置来说，至少有三个(最多有5个或更多)独立扩增片段覆盖了该位置，用于衍生共有序列。产生的构建体如图6所示。
本发明的另一个实施方案是对重组版本的牛凝血酶前体——前凝血酶-2进行人工改造。核酸如SEQ ID NO3所示，氨基酸序列如SEQID NO4所示。前凝血酶-2是凝血酶的最小单链前体。它是包含314个氨基酸的蛋白质，经过Xa因子的切割可以天然地转化为“A”链和“B”链。为了有效建立人工改造版本的前凝血酶-2以用作表达研究，利用实施例2中的PCR方法构建了“基础”表达序列盒。构建体含有天然cDNA序列，只是去除了其内部的BamHI和BglI位点，去除了天然存在的3′区StuI限制性位点，引入了5′区StuI位点和SacI位点。通过将其他一些序列引入旁侧扩增引物中，获得进一步的表达改变，如加入纯化和检测“把手”。
利用图3中所述引物扩增编码原凝血酶的cDNA序列，产生野生型前凝血酶-2 PCR表达序列盒(859kb)。将独立扩增、克隆(TA载体介导)、测序验证和亚克隆的前凝血酶-2表达序列盒置于适当的表达宿主背景下进行表达。前凝血酶-2蛋白的表达水平在所有天然大肠杆菌蛋白的表达水平之上。随后利用HPLC分析法进行定量分析，结果表明这些菌株的表达水平为每升细菌培养物产生4克前凝血酶-2。
本发明的进一步实施方案还包括主要有助于纯化步骤的分子修饰。包括加入诸如IMAC和多聚组氨酸之类的纯化“把手(handle)”。使用PCR引物，使用前凝血酶-2“基础(base)”表达序列盒作为扩增模板进行扩增，引入特定的纯化“把手”。
本发明的另一个实施方案包括往编码序列中掺入“活化位点序列盒”，使可替代的切割序列盒可以容易且有效地交换。这使人们能够对天然Xa因子活化序列进行置换和可替代分析。值得注意的是，虽然前凝血酶-2表达序列盒中存在有两个Xa因子切割位点，图8，仅第二个或“下游”的切割位点是活化(将“A”链和“B”链相切割)分子所必需的。使用PCR重叠延伸诱变技术构建“活化切割位点”，往第二个Xa因子切割序列的上游(5′)引入单一的SacI限制性位点(图4)。往第二个Xa因子切割序列的下游引入单一的StuI限制性位点，使寡核苷酸衔接物以包含可替代切割位点的SacI-StuI片段形式合成。利用PCR诱变技术去除序列盒3′区中天然存在的StuI位点。在不改变氨基酸序列的前提下引入所有的改变。图4所示为完整的核苷酸序列和修饰的前凝血酶-2表达序列盒的翻译产物。
另外，在适当末端包含单一SacI和StuI限制性位点的合成寡核苷酸引入可替代切割位点。具有4个不同蛋白酶切割位点的5个片段取代到了序列中。这些包括两个版本的凝血酶切割位点和肠激酶、鼻病毒A2蛋白酶和鼻病毒3C蛋白酶的位点(图9)。包含替代实验所产生的修饰序列的表达载体如图10所示。所有的可替代活化的分子在大肠杆菌中都表达良好。
本发明的另一个实施方案是能够被凝血酶自身所活化(体外自我活化)的凝血酶前体。将这种菌株中表达的物质进行分离，并进行重新折叠加工。用非常低水平的凝血酶“种(seed)”对正确折叠的酶进行处理，测定其活化重组人C蛋白的能力。因此，重组凝血酶前体在细菌细胞中得以产生，分离，利用凝血酶作为“种”加以活化，并以动物来源酶相类似的方式活化重组C蛋白。
来自细菌表达工作的一项重要观察结果是由于众所周知大肠杆菌不能够进行复杂的翻译后修饰，翻译后修饰对酶活性并不是关键的。而且，重组凝血酶的细菌表达也说明了凝血酶活化的凝血酶前体能够得以活化，具有酶活性。
除了原核细胞外，诸如丝状真菌或酵母之类的真核生物也是凝血酶前体载体的合适克隆或表达宿主。酿酒酵母是通常用到的低等真核宿主微生物。其他包括裂殖酵母[Beach and Nurse，Nature 290140-3(1981)；1995年5月2日出版的EP 139,383]；Muyveromyces宿主[美国专利No.4,493,529；Fleer et al.，Bio/Technology 9(10)968-75(1991)]，如乳酸克鲁维酵母(MW98-8C，CBS683，CBS4574)[deLouvencourt et al.，J.Bacteriol.154(2)737-42(1983)]；K.fiagilis(ATCC12,424)，K.bulgaricus(ATCC 16,045)，K.wickeramii(ATCC 24,178)，K.waltii(ATCC 56,500)，K.drosophilarum(ATCC 36,906)[Van denBerg et al.，Bio/Technology 8(2)135-9(1990)]，耐热克鲁维酵母和马克思克鲁维酵母；yarrowia(EP 402,226)；巴氏毕赤酵母(EP 183,070)[Sreekrishna et al.，J.Basic Microbiol.28(4)265-78(1988)]；Candid；Trichoderma reesia(EP 244,234)；粗糙脉孢菌[Case et al..，Proc.Natl.Acad Sci.USA 76(10)5259-63(1979)]；许旺酵母菌，如许旺酵母(1990年10月31日出版的EP 394,538)；和丝状真菌，如链孢霉属、青霉属、Tolypocladium(1991年1月10日出版的WO 91/00357)，和曲霉属宿主，如构巢曲霉[Bellance et al.，Biochem.Biophys.Res.Comm.112(1)284-9(1983)；Tilburn et al.，Gene 26(2-3)205-21(1983)；Yeltonet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81(5)1470-4(1984)]和黑曲霉[Kellyand Hynes，EMBO J.4(2)475-9(1985)]。甲基营养酵母选自汉逊酵母、假丝酵母、克勒克酵母、毕赤酵母、酿酒酵母、Torulopsis和Rhodotruia。C.Antony，The Biochemistry of Methylotrophs 269(1982)中示例性地列出了这类酵母中的特定物种。
用于表达糖基化凝血酶前体的适当宿主细胞来源于多细胞有机体。无脊椎动物细胞的例子包括昆虫细胞，如果蝇S2、夜蛾high5；和植物细胞。举例来说，有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和COS细胞。更具体的离子包括SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾细胞系[293或亚克隆在悬浮培养基中生长的293细胞，Graham et al.，J.Gen Virol.，36(1)59-74(1977)]；中国仓鼠卵巢细胞/±DHFR(DG44，K1，DuxB11)[CHO，Urlaub and Chasin，Proc.Natl.Sci.USA，77(7)4216-20(1980)]；小鼠塞托利细胞[TM4，Mather，Biol.Reprod.23(1)243-52(1980)]；人肺细胞(W138.ATCC CCL 75)；人肝脏细胞(Hep G2，HB 8065)；和小鼠乳腺瘤细胞(MMT 060562，ATCC CCL 51)。适当宿主细胞的选择属于本领域人员的技术范围。
因而，本发明的另一个实施方案是表达牛凝血酶前体分子的哺乳动物细胞培养物。在哺乳动物系统中表达的最主要好处是能够获得更多的复杂翻译后修饰。使用真核表达系统的另一个好处是形成可溶性和正确折叠的产物。另外，在哺乳动物细胞中表达的蛋白质分泌到培养基中，进而进行有效的纯化。
优选的哺乳动物宿主细胞系是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。更具体地说，DHFR突变细胞系称为DXB11，表达系统(EASE)使得能够在DHFR选择的基础上快速产生大量表达培养物。利用图22中所示的PCR引物进行PCR扩增，产生人工改造版本的原凝血酶(1.890Kb)和前凝血酶-2(.983Kb)表达序列盒，并直接将之克隆到EASE表达载体(pDC312)。图13描述了构建的表达载体。原凝血酶和前凝血酶-2表达载体转染DXB11亲本细胞系，产生能够分泌凝血酶前体的CHO细胞系。
利用涉及苯基琼脂糖凝胶柱及随后IMAC步骤的两步方法来纯化原凝血酶。通过凝胶光密度计分析检测，纯化的蛋白质纯度高于85％。使用涉及SP琼脂糖柱及随后肝素亲和层析步骤的两步方法来纯化前凝血酶-2。产生的蛋白质纯度高于85％。
测定原凝血酶前体在体外活化的能力。出乎意料的是，在孵育反应物中不加入外源凝血酶的情况下纯化的原凝血酶前体也能够得以活化。因此，重组蛋白是自我活化的。
对于前凝血酶-2表达序列盒来说，天然的前原凝血酶前导序列和前凝血酶序列相融合。细胞中表达的物质中约有50％分泌到培养基中。另外，前凝血酶-2前体分子在培养基中活化，不需要体外凝血酶的激活。核酸序列如SEQ ID NO7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO8所示。
利用S2238底物分析以及凝血酶ELISA监测表达水平。另人吃惊的是，由于培养基上清液中没有完全完整的前体，因此前凝血酶-2前体的活化发生在分泌时。
进行标准动力学分析，检测从原凝血酶和前凝血酶-2前体分子制备的活化凝血酶的催化特征。从两个前体分子制备的凝血酶和商品化的天然凝血酶的Km值及对S2238底物的特异性之间没有显著差异。
另外，利用显色底物比较了个体温度稳定性和pH稳定性。在广泛的温度和pH范围内重组酶和动物来源酶是相当的。另外，进行了实验来评价纯化的重组凝血酶前体分子活化C蛋白的能力。来源于重组凝血酶前体分子的活化凝血酶激活重组C蛋白，其方式和动物来源酶相当类似。
由于发明中已经作了一般描述，参照下面的实施例人们将更易于理解这些相同性。实施例是示例性的，而非限制性的。
实施例1在细菌细胞中表达凝血酶前体分子细菌菌株用于该项工作的各种细菌菌株的基因型如表1所述。
表1
DH5α是常用的“克隆”宿主，它易于制备感受态，因为它是限制缺陷型、修饰阳性(r-，m+)菌株，依次对于未修饰的DNA来说是可修正的。因此，在体外合成的DNA(用于产生衔接物的寡核苷酸)在转化限制阳性表达宿主之前可以先经过这一宿主。在该项研究中，RV308用于温度诱导性λ表达系统的宿主。RQ228是具体用于T7和T7lacc表达系统的表达宿主。HMS174(DE3)也是用在该项研究中的商品化T7表达宿主。
培养基和生长条件摇瓶细菌培养物常规培养于LB培养基(Miller1972)。L琼脂为每升LB培养基加入15g Bacto琼脂(Difco)。适当情况下，加入下列浓度的抗生素(Sigma和BRL)氯霉素(25μg/mL)、四环素(12.5μg/mL)、氨苄霉素(100μg/mL)、卡那霉素(50μg/mL)、萘定酮酸(20μg/mL)、新霉素(75μg/mL)和链霉素(50μg/mL)。对于T7表达系统诱导实验来说，IPTG在水中配制成0.5M的母液，以终浓度为0.1mM至1mM加入培养基中。
实施例2DNA方法使用Wizard纯化试剂盒(Promega公司)或质粒DNA Spin柱纯化试剂盒(Qiagen)分离质粒DNA。对DNA进行琼脂糖凝胶电泳，利用Klenow将带有突出5′端的限制性片段“补平”，连接DNA片段，如Maniatis等所述和/或根据当前方案指南利用氯化钙方法转化大肠杆菌。通过Struhl(Struhl，K.1985)的方法或使用Qiagen DNA凝胶试剂盒根据生产商建议，在低熔点琼脂糖中分离个体限制性片段。
克隆和表达载体在该项工作中使用的各种表达载体骨架如图11所示。各种构建体的关键特征也存在于表中，包括它们具有的特异性启动子系统，以及使用这些骨架时诱导表达的方法。
PCR和衔接物寡核苷酸设计并合成的寡核苷酸如图3所示。该表还区分了寡核苷酸的特定用途。根据来源于原Genbank提交号为#J00041的牛凝血酶已知序列设计一套引物。这些特定寡核苷酸的设计能够PCR扩增到牛凝血酶cDNA的多个版本和片段。这些版本包括全长的前原凝血酶、原凝血酶和前凝血酶-2前体分子。这些引物还用于扩增这些版本中每个版本的内部片段。其目的是提供用于和预期序列相比较的其他独立扩增序列，以及对序列进行某些修饰，如插入和/或去除特定的限制性位点。使用PCR引物产生克隆cDNA的共有序列，构建用于下一步克隆和表达工作的初步框架。然后，使用PCR引物对序列进行其他的人工修饰(即限制性位点改变、氨基酸改变、纯化把手等)。图12所示为分别在表达序列盒的5′和3′末端添加把手的特定核苷酸序列。所有寡核苷酸(用于两个接头添加克隆和用于PCR引物)的合成和0.2μmol规模纯化由Genosys公司完成。
PCR扩增和cDNA克隆将PCR引物稀释至保存浓度为50μM。PCR反应在Perkin Elmer Geneamp PCR系统9600热循环仪中运行。如下进行PCR扩增模板可以是从琼脂板上单菌落获取的新鲜分离的细胞，或稀释的纯化质粒DNA(用水稀释至终浓度1ng/μL)。在使用初始cDNA(Clontech)进行克隆的情况下，直接使用购买的cDNA(1μg)作为扩增模板。在直接使用细胞的情况下，99.9℃加热10min将细胞裂解，然后进行如下的32个循环94℃30秒，58℃30秒，72℃75秒。有规律的循环程序结束后72℃延伸10min，样品于4℃保存待用。使用TA克隆试剂盒(pCRII或Pcr2.1Topo载体)，根据生产商指示完成PCR产物的直接克隆。通过测序分析来证实PCR或合成DNA寡核苷酸直接连接(即衔接物克隆)产生的所有构建体的序列完整性。在牛凝血酶cDNA的初步克隆中，至少获得了三个独立的扩增克隆，以代表各碱基位置。这为鉴定克隆的编码DNA序列中共有序列提供了手段。
实施例3使用蛇毒液激活重组凝血酶基本上如DiBella等(J.Biol.Chem.，270(1)163-169，1995)所述进行该过程。将蛇毒液(E.carinatus蛇毒液，Sigma#V-8250)用p-APMSF预处理，灭活胰蛋白样蛋白酶(Laura et al.，1980)。通过BCA分析测定受处理蛇毒液制剂中的蛋白质浓度。包含25mM磷酸钠(一价的)、pH7.4和0.4M NaCl的反应混合物中，使用前凝血酶-2和蛇毒液重量比为5∶1的比例启动激活反应。反应物于37℃孵育。每隔30min取出一小份，使用S2238光谱分析法根据生产商的建议(Chromogenix公司)进行分析。在这些条件下，典型的激活在2～3hr时达到最大。
实施例4凝血酶S2238底物活性分析S2238显色底物购自Chromogenix公司，根据生产商提供的方案使用。简单地说，将牛凝血酶溶解在包含0.1mg/mL BSA的Tris缓冲的盐溶液(20mM Tris/150mM NaCl)/10mM EDTA，pH8.3中至最终TBS浓度约为1mg/mL，制备对照样品。使用280nm处的E1％＝19.5估算蛋白质浓度(Winzor和Scheraga，1964)。用TBS/EDTA/BSA缓冲液将重组凝血酶或对照样品稀释至蛋白质终浓度为1μg/mL。往塑料槽中加入包含100μM S2238的TBS/EDTA/BSA缓冲液，于设定为405nm的分光光度计中、37℃预平衡10min，然后往各孔中加入约100μL各样品。5min内测定405nm处光吸收的增加，每15分钟获得一组数据。每分钟光吸收的变化除以1.67来计算NIH活性单位。这一数值除以用在分析中的蛋白质浓度，计算酶的特异活性(以NIH单位/mg蛋白质)表示。
实施例5利用凝血酶的自我活化利用凝血酶的活化和上述利用蛇毒液的反应相类似。包含20mMTris pH8.3、0.15M NaCl、10mM EDTA的反应混合物中，使用前凝血酶-2和牛凝血酶重量比为100∶1的比例启动激活反应。反应物于37℃孵育。每隔30min取出一小份，使用S2238光谱分析法进行分析。在这些条件下，典型的激活在1～1.5hr时达到最大。
实施例6纯化重组大肠杆菌前凝血酶-2将数升所需的表达质粒/宿主装在摇瓶容器中(250mL/1升烧瓶)，37℃摇培。根据OD600监测生长，加入IPTG(100μM)之前取样，继续培养(4～6小时)，最后收获。通过6500rpm离心10min获得细胞沉淀。弃除培养基，细胞沉淀重悬于7M胍-HCl/10mM TrispH8.0中，将细胞裂解。通过高速离心(20krpm)分离不含前凝血酶-2包涵体的不溶级分，弃除溶解的级分。如Dibella等所述对包涵体进行磺酸盐化。
纯化重组的、磺酸盐化的前凝血酶-2。
将磺酸盐化的前凝血酶-2溶解在7M胍-HCl/10mM Tris pH8.0中，加到半制备性的Vydac C-18柱(1.0×25cm)上，线形流速为75cm/hr。用源于0～75％缓冲液B(缓冲液A＝23％CAN/0.1％TFA，缓冲液B＝90％CAN/0.1％TFA)的4倍柱体积(CV)梯度溶液洗脱柱。合并包含前凝血酶-2的级分(通过分析性HPLC测定)，并冻干。
实施例7十二肽(DDP)释放分析简单地说，具有凝血酶样活性的样品和存在于20mM Tris/150mMNaCl pH8.0中、终浓度为2mg/mL的人C蛋白一起孵育。反应终体积为2mL。用1N柠檬酸将反应物调整至pH6.0，于40℃孵育指定的时间。以同样的方式，使用约180μg酶活性设定牛凝血酶样品对照，酶活性预先溶解在20mM Tris/150mM NaCl pH8.0中至终浓度为2mg/mL。取出小份反应物(25μL)，用25μL 0.1％TFA猝灭。使用Shandon Hypercarb柱(3.2×100mm)分析样品对十二肽的释放，其中Shandon Hypercarb柱和HP1090 HPLC相连，HPLC带有设定在216nm处的外部Applied Biosystems检测器。使用化学合成的可靠的十二肽绘制标准曲线，根据标准曲线对释放的十二肽进行定量。
实施例8哺乳动物细胞培养物用在这些实验中的哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，具体地说是DXBII细胞系。这种特定的细胞系是二氢叶酸还原酶(DHRF)突变体。该突变使得能够利用不含黄嘌呤/胸腺嘧啶(-HT)的培养基选择包含DHFR的细胞，加入氨甲喋呤增加扩增滴度。
细胞悬浮培养在无血清的培养基中，该培养基为包含4mM L-谷氨酰胺(BRL)和1×HT补充物(BRL)的Excell302(JRH)。转染后，细胞置于包含4～8mM L-谷氨酰胺和1×葡聚糖硫酸盐(Sigma)的选择性Excell302中。某些情况下，加入配制在DMSO(Sigma)中的适当MXT(Sigma)母液至50、150或300nM。
实施例9设计哺乳动物表达序列盒表达系统从Immuex获得，称作表达增强序列元件或EASE系统。据报道该系统在短的时段内能够形成一个稳定、高表达的CHO细胞“库(pool)”(Aldrich et al.，Cytotechnology，281-9，1999)。EASE载体是专有的，全序列是未知的。载体带有一个多克隆位点区，该多克隆位点区含有亚克隆感兴趣基因的限制性位点。由于细菌表达序列盒存在于NdeI-BamHI限制性片段上，因此使用基因3′端的BamHI位点。通过PCR在基因5′端引入SalI，将表达序列盒以SalI-BamHI片段的形式亚克隆到EASE载体中。原凝血酶和前凝血酶-2表达构建体的构建过程中用作PCR引物的寡核苷酸在(图22)中列了出来。PCR反应在Perkin Elmer Cetus GeneAmp9600热循环仪中进行，使用以下参数起始模板于98℃变性10min，然后94℃30秒，56℃30秒和72℃3分钟，共30个循环。最后一个循环完成后72℃延伸10分钟，然后将反应物保存于4℃，直至进一步加工。
利用上述的特定克隆位点(SalI-BamHI序列盒)和Kozak序列构建哺乳动物表达序列盒。Kozak序列是一个短的区域，据报道在真核细胞的翻译起始过程中是重要的。Kozak区的共有序列如下GCCG/ACC。共有Kozak序列的两个区(Kozak，1981)都包括在内，以测定它们的表达之间是否有显著差异。将COOH-端序列以“标签”形式掺入，以用作诊断目的(表达分析)，并为纯化目的提供潜在的“把手”。
实施例10转染(电穿孔)/选择/扩增利用GenePulser II(Biorad)，按照下列方案完成转染对于每次转染来说，使用限制性酶(PvuI)将10μgDNA线形化，限制性酶能够在氨苄霉素抗性基因中切割，而不在对于哺乳动物细胞选择或表达来说至关重要的载体部分切割。于37℃将DNA消化过夜，然后用乙醇沉淀，洗沉淀，使DNA沉淀物在通风橱中干燥20分钟。
从已经传代至少三次、但从冷冻小瓶开始不超过30代的亲本细胞培养物制备细胞。细胞在添加有L-谷氨酰胺至终浓度为4mM、并含有1×HT补充物的Excell 302培养基(JRH)中于37℃、5％CO2的条件下培养。转染2～3天之前，将亲本细胞系传代培养，接种至终密度为.25×10e6/mL。转染当天收集的细胞密度在.7～1.0×10e6/mL。离心(1500rpm)收获细胞，重悬于一定量的培养基中，使细胞终密度为1×10e7/800μL。将800μL细胞加到狭缝为0.4cm的电穿孔样品池中。将样品池置于冰上10分钟。
将GenePulsarII设定为350伏和925μF。将样品插入，根据生产商建议施加电脉冲。移出样品，置于冰上10分钟。记录施加的确切电压和持续时间，以指示施加脉冲的有效性。电穿孔后在冰上孵育完毕之后，从样品池中取出样品，置于T75烧瓶中，于37℃、5％CO2的条件下静置孵育48小时。回收后，对样品进行计数，将样品置于选择压力之前验证生存力。
初步选择EASE载体包含DHFR基因，因此根据这一标记进行选择。在产生细胞系的过程中使用两个选择/扩增计划。在两个计划中，细胞都在“大量悬浮培养基”中培养(从250mL烧瓶中的20mL培养物)，并不试图获得单克隆细胞，或纯合的群体。一个计划设计通过将回收的细胞培养在不含HT补充物的Excell 302+L-谷氨酰胺中培养来进行初步选择。这种选择称作“-HT”或“基础”选择。在这种情况下，细胞大批量(维持活细胞密度为.2×10e6/mL)培养在适当的容器和器皿中，直至群体生存力＞90％。这时将细胞系深低温保藏，分析表达情况，并考虑扩增方法。
第二个选择计划设计将转染后挥手的群体直接置于多个水平的MTX选择压力下。这些水平是50、150和300nM。如上所述再次培养细胞，直至达到稳定的细胞生存力，优选＞90％，但是某些情况下细胞在该水平之下达到稳定。
扩增方案根据任意给定的细胞群体都具有杂合性的假设进行扩增。在染色体水平上具有杂合性。因此通过将群体置于递增水平的选择试剂的压力之下，群体中具有更多拷贝抗性标记基因的细胞是选择的、会最终在选择条件下培养出来的那些细胞。抗性标记应该和感兴趣基因(这里为凝血酶基因)通过基因工程手段相连接，因此扩增导致更多拷贝的表达序列盒，进一步导致更高的表达水平。扩增不是一个通用的过程，并不是任意给定的抗性标记都有可能实现扩增。根据MXT标记的扩增已经很好地确立，但是新霉素抗性不适于扩增。
扩增方案在大量培养物中进行，通过将密度为5×10e5细胞/mL的稳定“亲本”细胞系接种在20mL烧瓶容器中，利用合适的选择培养基来实施。每3～4天将培养物传代培养，每次传代时测定细胞生存力和活细胞密度。将培养物培养至初始的接种密度，通过收获和重悬细胞减小培养物的总体积。最后，抗性细胞群得以生长，新的选择条件下细胞稳定时将体积增加。培养物一旦稳定，就可以进行表达分析，样品可以长时间保存。
实施例11摇瓶表达分析所有的表达分析都在摇瓶规模培养的大量培养物上进行。表达后，主要进行4～12％Bis-Tris SDS-PAGE(Invitrogen)，然后进行Western印迹分析。根据已经建立的方法，使用凝血酶和抗-His抗体。在存在活性凝血酶的某些情况下，使用ELISA试剂盒测定滴度。
条件培养基直接使用，或使用Microcon-30微量浓缩器(Amicon)将之浓缩。对于细胞间分析，通过离心(1500rpm)收集细胞，用1×PBS洗后重悬于TPER裂解缓冲液(Pierce)中。通过再次离心将细胞裂解物和细胞碎片相分离，如下所述通过SDS-PAGE和Western印迹分析法对裂解物进行分析。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳使用MOPS电泳缓冲液，通过4～12％Bis-Tris NuPAGE凝胶对样品进行分析。样品稀释在4×NuPAGE LDS(十二烷基硫酸锂)还原样品缓冲液中。然后使用加热部件将样品于85℃加热10分钟。将各加热样品的待测小份加到凝胶上，恒压200伏进行电泳。用通过胶体蓝或银染对凝胶进行染色。使用低分离量标准品(BioRad)磷酸化酶b(97kDa)、BSA(66kDa)、卵清蛋白(45kDa)、碳酸酐酶(31kDa)、胰蛋白酶抑制剂(22kDa)和溶菌酶(14kDa)。
实施例12原凝血酶纯化通过涉及首先苯基-琼脂糖凝胶捕获后进行Ni-NTA固化金属亲和层析(IMAC)的两步方法来获得纯化的重组原凝血酶。通过收集包含来源于CHO细胞系的重组牛原凝血酶的条件培养基完成这一纯化过程。通过离心(Sorval1/GSA rotor/8000rpm/10分钟)将细胞和用过的培养基相分离。
如下进行苯基琼脂糖凝胶(Hi sub)纯化步骤往3L条件培养基，pH6.4中加入固体NaCl(至终浓度2M)，直接装到1.6×16.5cm(33mL)苯基琼脂糖凝胶(high sub)上。装满后，用3.5倍柱体积的20mM磷酸盐，pH7，2M NaCl洗柱，接着用2倍柱体积的2～0.5MNaCl梯度洗柱，然后用5倍柱体积的0.5～0M NaCl梯度洗柱。最后还用2倍柱体积的0.5M NaCl洗柱。所有的洗脱缓冲液包含pH7.0的20mM磷酸盐缓冲液。使用抗-凝血酶抗体和抗-His抗体，通过Western印迹分析法对两个梯度步骤中获得的级分进行分析。将包含重组原凝血酶的级分合并，用作下一步纯化。
IMAC层析步骤如下所述进行在装到4mL(1.1×4cm)Ni-NTAsuperflow(Qiagen)柱上之前，往苯基主流中加入咪唑至终浓度为17mM。整个过程的流速为0.8mL/min。上样完成后，用3.5倍柱体积(cv)的20mM磷酸盐，pH7，0.5M NaCl，15mM咪唑和0.1％聚乙二醇(PEG)8000洗柱。在20mM磷酸盐，pH7，0.05M NaCl和0.1％PEG 8000存在的条件下用8cv的15～300mM咪唑梯度洗脱目标蛋白质。收集梯度洗脱过程中的级分(2mL)，通过还原SDS-PAGE和Western印迹法进行分析。根据SDS-PAGE鉴定的带有IMAC标签的重组原凝血酶的量和纯度将级分合并。所有的层析步骤都在冷室(4～8℃)中的Pharmacia HPLC上进行。
实施例13前凝血酶-2纯化表达前凝血酶-2的细胞系不分泌完整的前体分子。在这种情况下，使用两步方法分离活性形式的牛凝血酶。该方法包括离子交换捕获(如SP琼脂糖凝胶Fast Flow)后进行肝素亲和步骤。和原凝血酶纯化的情况一样，物质从条件培养基中分离，其中的细胞通过离心(Sorval1/GSA rotor/8000rpm/10分钟)和培养基相分离。
SP琼脂糖凝胶Fast Flow层析步骤如下所述进行包含活性凝血酶的澄清条件培养基(900mL)用50mL 20mM磷酸盐缓冲液，pH6.5进行稀释。用蒸馏水将样品稀释直终体积为2000mL，将导电性(20C)CONG 13.9mmhos降低至6.6mmhos，最终pH6.5。将该物质直接装到1.6×13cm(26mL)SP琼脂糖凝胶Fast Flow柱上。整个加样过程中流速为3mL/min。上样完成后，用5倍柱体积的20mM磷酸盐缓冲液，pH6.5洗柱。在存在有20mM磷酸盐缓冲液，pH6.5的条件下用10倍柱体积的0～0.6M NaCl梯度洗脱目标蛋白质。在梯度洗脱过程中收集级分(10mL)，通过S2238酶活性和还原性SDS-PAGE进行分析。根据活性和纯度将级分合并。
肝素亲和步骤如下所述进行从SP琼脂糖凝胶获得的合并级分(70mL)用86mL 20mM磷酸盐缓冲液，pH7.4和335mL蒸馏水稀释，使最终导电性为6.9mmhos，最终pH6.9。以3mL/min的流速将稀释物质(470mL)装到1mL预装的肝素Hi-Trap(Pharmacia)上。用20倍柱体积的20mM磷酸盐缓冲液，pH6.5洗柱，然后用50倍柱体积的0～0.7M NaCl梯度洗脱。在梯度洗脱过程中收集级分(4mL)，通过S2238酶活性和通过银染使凝胶显色的还原性SDS-PAGE进行分析。包含最高特异活性的级分用于进行动力学研究。
实施例14S2238活性分析使用S2238活性分析法测定牛凝血酶的活性。该方法的原理是测定凝血酶水解底物S-2238，H-D-苯丙氨酰基-L-精氨酸-邻-nitrolanaline二盐酸的能力。更具体地说，凝血酶催化邻-nitroanalide(pNA)从肽底物S-2238中的水解。在设定为405nm的Beckman DU620分光光度计中测定释放pNA的速率。
实施例15C蛋白活化分析法该方法用于测定用在C蛋白活化中的牛凝血酶的相对特异性。使用反向HPLC方法测定活化过程中两个活化肽，即十二肽(残基#158～169)和十八肽(残基152～169)，以及另外两个肽的形成。凝血酶特异性定义为活化过程中产生的活化肽的面积和肽的总面积之间的比值。相对特异性定义为受试凝血酶的特异性和牛凝血酶参照标准品的特异性之间的比值。
重组C蛋白活化使用活化缓冲液作为稀释剂将十二肽(DDP)和十八肽(ODP)冻干粉配制成200μg/mL的贮备液。这些贮备液等体积组合在一起，产生能够注射到仪器上的100μg/mL ODP和100μg/mL DDP标准品。使用活化缓冲液将一小瓶重构至1mg/mL来制备hPC标准品。使用重构缓冲液将酶粉末重悬至1～2mg/mL来制备牛凝血酶样品。重组凝血酶不需要重构。在OD260和OD280处读取凝血酶样品的吸光度。使用吸光度数据和显色底物分析数据来证实反应物中酶的确切浓度。望重构的hPC中加入5个单位的牛凝血酶。样品于37℃孵育6小时，同时加以搅拌。孵育后，立即将样品保存于-70℃，直至能够注射到HPLC仪器上。使用Zorbex 300SB-C18反向柱，在60℃、流速为1.5mL/min(4.6×15cm，颗粒大小3.5μm)的条件下完成HPLC分析。通过测定216nm处的吸光度检测酰胺键。使用TFA/CAN二元梯度来洗脱柱。
重组C蛋白衍生物分子的活化本领域的熟练技术人员能够认识到本发明的牛凝血酶前体分子还可用于活化C蛋白的衍生物或类似物。例如，人C蛋白衍生物S11G:Q32E:N33D和H10Q:S11G:Q32E:N33D。
人C蛋白衍生物S11G:Q32E:N33D在第11位包含一个甘氨酸残基，取代了该位置上正常情况下存在的丝氨酸残基；第32位包含一个谷氨酸残基，取代了该位置上正常情况下存在的谷氨酰胺残基；第33位包含一个天冬氨酸残基，取代了该位置上正常情况下存在的天冬酰胺残基。
人C蛋白衍生物H10Q:S11G:Q32E:N33D在第10位包含一个谷氨酰胺残基，取代了该位置上正常情况下存在的组氨酸残基；在第11位包含一个甘氨酸残基，取代了该位置上正常情况下存在的丝氨酸残基；第32位包含一个谷氨酸残基，取代了该位置上正常情况下存在的谷氨酰胺残基；第33位包含一个天冬氨酸残基，取代了该位置上正常情况下存在的天冬酰胺残基。
序列表<110>Eli Lilly and Company<120>重组牛凝血酶<130>X-15323<150>60/340,134<151>2001-12-14<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1755<212>DNA<213>工程化牛原凝血酶<400>1atggccaaca agggcttcct ggaggaggtg cggaagggca acctggagcg agagtgcctg 60gaggagccat gcagccgcga ggaggccttc gaggccctgg agtctctcag tgccacggat 120gcgttctggg ccaagtacac agcttgtgag tcagcgaaaa atcctcgaga aaagctcaat 180gaatgtctgg aaggaaactg cgctgaaggt gtggggatga actaccgagg gaacgtgagc 240gtcacccggt caggcatcga atgccagctg tggagaagtc gctacccaca taagccagaa 300atcaactcta ccacccaccc gggggctgac ctgcgggaga atttttgccg caacccggat 360ggcagcatta ctgggccctg gtgctacacc acatccccga ctctgcggag agaagagtgc 420agcgtcccgg tgtgcggcca ggaccgagtc acagtggagg tgatcccccg gtcaggaggc 480tccactacca gtcagtcgcc tttactggaa acatgcgtcc cggaccgcgg ccgggagtac 540cgagggcggc tggcggtgac cacaagcggg tcccgctgcc ttgcctggag cagcgaacag 600gccaaggccc tgagcaagga ccaggacttc aacccggccg tgcccctggc ggagaacttc 660tgccgcaacc cagacgggga cgaggagggc gcctggtgct acgtggccga ccagcctggc 720
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Gly Arg Glu Tyr Arg Gly Arg Leu Ala Val Thr Thr Ser Gly Ser Arg180 185 190CysLeu Ala Trp Ser Ser Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Lys Asp Gln195 200 205Asp Phe Asn Pro Ala Val Pro Leu Ala Glu Asn Phe Cys Arg Asn Pro210 215 220Asp Gly Asp Glu Glu Gly Ala Trp Cys Tyr Val Ala Asp Gln Pro Gly225 230 235 240Asp Phe Glu Tyr Cys Asp Leu Asn Tyr Cys Glu Glu Pro Val Asp Gly245 250 255Asp Leu Gly Asp Arg Leu Gly Glu Asp Pro Agp Pro Asp Ala Ala Leu260 265 270Val Pro Arg Thr Ser Glu Asp His Phe Gln Pro Phe Phe Asn Glu Lys275 280 285Thr Phe Gly Ala Gly Glu Ala Asp Cys Gly Leu Arg Pro Leu Phe Glu290 295 300Lys Lys Gln Val Gln Asp Gln Thr Glu Lys Glu Leu Phe Glu Ser Tyr305 310 315 320Leu Val Pro Arg Ile Val Glu Gly Gln Asp Ala Glu Val Gly Leu Ser325 330 335Pro Trp Gln Val Met Leu Phe Arg Lys Ser Pro Gln Glu Leu Leu Cys340 345 350
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权利要求
1.编码重组牛凝血酶前体分子的分离核酸，其中所述的前体分子是原凝血酶，所述的分离核酸如SEQ ID NO5所示。
2.编码具有SEQ ID NO6所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸，其中所述的多肽是重组牛凝血酶前体分子原凝血酶。
3.编码重组牛凝血酶前体分子的分离核酸，其中所述的前体分子是前凝血酶-2，所述的分离核酸如SEQ ID NO7所示。
4.编码具有SEQ ID NO8所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸，其中所述的多肽是重组牛凝血酶前体分子前凝血酶-2。
5.编码重组牛凝血酶前体分子的分离核酸，其中所述的前体分子是原凝血酶，所述的分离核酸如SEQ ID NO1所示。
6.编码具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸，其中所述的多肽是重组牛凝血酶前体分子原凝血酶。
7.编码重组牛凝血酶前体分子的分离核酸，其中所述的前体分子是前凝血酶-2，所述的分离核酸如SEQ ID NO3所示。
8.编码具有SEQ ID NO4所示氨基酸序列的多肽的多核苷酸，其中所述的多肽是重组牛凝血酶前体分子前凝血酶-2。
9.权利要求1至8中的前体分子，其中所述的前体分子是自我活化的。
10.一种载体，其包含权利要求1～4任何一项中的核酸分子。
11.权利要求10的载体，其中所述的核酸分子可操作性地和控制序列相连接，所述控制序列能够被转化了所述载体的宿主细胞所识别。
12.包含权利要求11中的载体的宿主细胞，其中所述的宿主细胞是CHO细胞。
13.一种载体，其包含权利要求5～8任何一项中的核酸分子。
14.权利要求13的载体，其中所述的核酸分子可操作性地和控制序列相连接，所述控制序列能够被转化了所述载体的宿主细胞所识别。
15.包含权利要求14中的载体的宿主细胞，其中所述的宿主细胞是大肠杆菌。
16.纯化活化的凝血酶的方法，其中所述的方法包括以下步骤(a)在宿主细胞中表达SEQ ID NO8所示的重组牛凝血酶前体分子前凝血酶-2；(b)通过离子交换层析纯化所述的重组牛凝血酶前体分子；(c)通过肝素亲和层析进一步纯化所述的重组牛凝血酶前体分子；和(d)分析所述纯化的重组牛凝血酶前体分子的纯度和凝血酶活性。
17.权利要求16的方法，其中所述的宿主细胞是CHO细胞。
18.权利要求17的方法，其中所述的重组牛凝血酶前体分子在从所述CHO细胞中以前凝血酶-2形式表达时被活化。
19.生产活化蛋白质的方法，其中所述的方法使用权利要求1～8中的任意重组凝血酶前体分子。
20.权利要求19的方法，其中所述的活化蛋白质是C蛋白或其衍生物。
21.权利要求19的方法，其中所述的活化蛋白质包含天然Xa因子序列之外的活化序列。
全文摘要
本发明公开了从不需要Xa因子活化的前体分子生产重组凝血酶的方法。用包含指导凝血酶前体表达所需信息的DNA构建体转化或转染宿主细胞，从中生产蛋白质。还介绍了凝血酶前体的纯化方法。转化或转染的宿主细胞中产生的凝血酶前体是自我活化的，以活化形式分泌。
文档编号C12N9/64GK1604905SQ02824940
公开日2005年4月6日 申请日期2002年12月5日 优先权日2001年12月14日
发明者C·C·费耶, C·L·赫尔斯伯格 申请人:伊莱利利公司