专利名称：毒理基因组学指数预警饮用水源水致癌风险的方法
技术领域：
本发明是一种检测饮用水源水涉癌基因组毒性水平，计算涉癌毒理基因组学指数crTGI (cancer-related toxicogenomics index)参数值,预警控制致癌风险的系列生物信息学技术集成。更具体的说就是通过检测长江南京饮用水源水对小鼠肝脏的涉癌基因组毒性水平，评价饮用水源水对人体的致癌风险。
背景技术：
毒理基因组学技术的应用研究于1997年起始于美国，为检测饮用水源水等环境样品对人体致癌的威胁，展现出希望。毒理基因组学技术基于可检测10_18浓度污染物毒性的高灵敏、高精准、高通量的基因芯片技术，基于可整合大量基因组参数信息的计算生物学 技术。毒理基因组学技术的应用研究于2003年进入高峰，美国环保署(EPA)提出检测评价环境样品对人体致癌风险的突破，将依靠毒理基因组学的检测与分析技术的发展。美国EPA目前正在探索已知污染物对基因组毒性的检测及整合的分子计算毒理学研究。2006年中国颁布最新的《生活饮用水卫生标准》[GB5749-2006]中，控制有机有毒污染物为53种；美国2011年饮用水标准[EPA820-R-11-002]中，控制的有机有毒污染物为174种；而长江水源水中的有机有毒污染物种类，已经远远超出中国及美国控制标准中的数量。导致长江南京饮用水源水中有机有毒污染物种类，超出中国及美国饮用水标准的原因是，长江受到15万家的工业排放，20多个大中城市的污水排放，及两岸农田径流中有机农药污染的排放等等。已发现，长江南京饮用水源水对水蚤、鱼、小鼠、大鼠、及人体细胞等生物材料，均存在显著的分子遗传毒性威胁。饮用水源水等环境样品中污染物对人体致癌威胁的检测评价，至今仍然是国际性难题，因为(I)饮用水源水中污染物种类繁多，涉及致癌风险的因素复杂，难以检测出各种污染物及其复杂因素的毒性效应；(2)饮用水源水不能用于人体流行病学试验及参数检测；(3)饮用水源水生态毒性检测结果，不能直接说明对人体潜在的致癌风险。本项发明技术(I)检测饮用水源水对小鼠的涉癌毒理基因组学指数(crTGIs)水平，指示饮用水源水中所有污染物对涉癌基因组的毒性，而不需检测单一污染物的浓度与毒性；(2)以环境强致癌物苯并芘(BaP)对小鼠的涉癌基因组毒性为基准，将饮用水源水的crTGIs，转化为BaP毒性的当量浓度；(3)根据美国环保署制定的BaP对人体致癌风险浓度的标准，评价饮用水源水BaP当量浓度，对人体的致癌风险，具有国际的可比性。本项crTGI发明技术，不需检测饮用水源水中各种单项污染物参数，不需检测流行病学的人体参数，简便经济，具有国际前沿的突破性及可比性。
发明内容
本发明的目的是，提出一种检测计算饮用水源水对小鼠肝脏的涉癌毒理基因组学指数(crTGIs)的方法；转化涉癌毒理基因组学指数crTGIs为苯并芘(BaP)的毒性当量浓度。评价饮用水源水BaP毒性当量浓度，对人体的致癌风险度。本发明的技术方案，毒理基因组学指数(crTGI)预警饮用水源水致癌风险的方法，其特征是步骤如下(I)应用基因芯片，检测水源水对小鼠的涉癌毒理基因组学指数(crTGIs)，指示水样中所有污染物潜在的致癌毒性；(2)以强致癌污染物苯并芘(BaP)为阳性毒性对照，将水源水涉癌毒理基因组学指数(crTGIs)数值，转化为BaP毒性的当量浓度；根据美国EPA控制BaP对人体致癌风险的标准阈值浓度，评价水源水BaP当量浓度的致癌风险度，具有国际可比性与公认性；(3)联合国及中国政府承诺为各国居民提供安全饮用水的年限是2015年；而美国EPA的“毒理基因组学技术”及“分子计算毒理学”技术，尚不能解决“饮用水源致癌风险评价”的现实问题。本项crTGI技术则可以为评价“饮用水源致癌风险”提出毒理基因组学的依据。检测计算饮用水源水涉癌毒理基因组学指数(crTGI)方法和具体步骤为第一步受试小鼠染毒处理饮用水源水水样采集后冰浴,饮用水源水水样经0. 45 ii m滤膜过滤；以饮用水源水样品、3. 8 y g/L的BaP (苯并(a)芘)”化学溶液(阳性对照)、清洁水(阴性对照)分别饲喂3组小鼠，进行染毒试验；受试小鼠为雄性昆明种(Musmusculus, ICR), 3-4周龄，体重18±2g，清洁级。受试小鼠随机分为三组，每组10只，笼中饲养，温度为20-24°C，湿度为40-60%，昼夜12h/12h ;小鼠自由饮水，自由摄食标准化饲料；第二步应用基因芯片检测涉癌基因组表达水平小鼠饲喂90天处死，每只小鼠取0. 2g肝脏组织，切成〈O. 5cm小块，放入2mLRNAlater (Takara Bio)离心管，置于液氮中保存；采用转录组基因芯片，识别I. 4万个基因的转录表达检测受试小鼠的基因组转录表达水平。每组小鼠随机分为3个平行样，每个平行样由3只小鼠肝脏样品混匀后提取总RNA样品，经系列前处理之后，应用基因芯片检测转录毒性；基因芯片检测的过程包括(A)总RNA抽取分离；(B) cDNA合成；(C) cDNA纯化；(D) cRNA合成及标记、(E) cRNA纯化；(F) cRNA片段化；(G)片段化cRNA与基因芯片分子杂交、洗脱、染色及扫描，获得分子杂交的信号图；将分子杂交的信号图，转换为基因差异表达的参数水平，其中差异表达参数水平fold彡1.5，且？〈0. 05的基因，定义为差异表达基因(DEGs);共鉴定出585个DEGs ;从GO数据库中，检索585个DEGs的生物学意义，筛选出涉癌的DEGs，即为涉癌基因(cancerrelated gene);涉及一种癌症的所有DEGs,称之为该种癌症的涉癌基因组(cancerrelated genome);涉及所有癌症的DEGs,也可统称为所有癌症的涉癌基因组(cancersrelated genome)；检测计算长江饮用水源水诱发小鼠肝脏涉癌基因转录表达水平结果；第三步计算饮用水源水涉癌毒理基因组学指数(crTGIs)，采用公式I ;CrTGIs=E (sGELsi+bGELsi)-----------------------公式 I式I 中sGELsi，是饮用水源水诱发小鼠一种癌症风险的涉癌基因组表达水平；、
bGELsi，是BaPs化学溶液诱发小鼠同一种癌症风险的涉癌基因组表达水平；计算结果crTGIs=5. 3 (见表2左侧的倒数第一行)。
计算BaP试液涉癌毒理基因组学指数(crTGIb)，采用公式2，结果如下
crTGIb= E (bGELsi+bGELsi)-----------------------------公式 2式2 中bGELsi,是BaP试液诱发小鼠一种癌症的涉癌基因组表达水平。每一种癌症bGELsi的自比值的总和，即为BaPs涉癌毒理基因组学指数(crTGIb)值。第四步转化饮用水源水的crTGIs为BaP毒性的当量浓度(A)计算饮用水源水crTGIs的BaP当量致癌风险sLCR (lifetime cancer risk)米用公式3。sLCR= (crTGI sXbLCR)+crTGIb-------------------------公式 3。式3 中crTGIs=5. 3，是长江南京饮用水源水诱发小鼠的涉癌毒理基因组学指数，见表2。crTGIb=13,是BaP试液诱发小鼠的涉癌毒理基因组学指数，见表2。bLCR=7. 56 X 10_5是3. 8 ii g/L的BaP试液致癌风险度的标准值。计算结果长江南京饮用水源水的致癌风险度sLCR=3. 08 X 10'(B)计算长江南京饮用水源水的致癌风险度sLCR的BaP当量浓度(sBEC)用公式4。sBEC=sLCR+bSF-----------------------公式 4 ；式4中sLCR=3. 08X1(T5，来自公式3的计算结果。bSF=l. 9896 X 1(T5，是 BaP 的 5 个浓度与 5 个 LCR 值斜率[EPA/540/1-89/002]标准值；计算结果长江南京饮用水源水BaP当量浓度SBEC=L 55 U g/L。本发明的有益效果是，不需检测单一污染物的浓度及毒性参数；不需人体流行病学的试验及参数检测；突破了 “分子计算毒理学”尚不能检测评价环境样品致癌风险的局限。
图I为本发明的流程图。
具体实施例方式本发明的具体实行方案及简单原理，通过以下案例加以说明第一步受试小鼠染毒处理采样瓶为2. 5L棕色玻璃瓶，事先反复用无离子水、2M硝酸清洗。水样采集后冰浴，密封带回实验室。饮用水源水样品经0. 45 ii m滤膜过滤，-20 °C保存备用。以饮用水源水样品、3. 8 u g/L的BaP化学溶液(阳性对照)、清洁水(阴性对照)分别饲喂3组小鼠,进行染毒试验。受试小鼠为雄性昆明种(Mus musculus, ICR),3_4周龄，体重18±2g，清洁级。受试小鼠随机分为三组，每组10只，笼中饲养，温度为20-24°C，湿度为40-60%，昼夜12h/12h。小鼠自由饮水，自由摄食标准化饲料。第二步应用基因芯片检测涉癌基因组表达水平小鼠饲喂90天处死，每只小鼠取0. 2g肝脏组织，切成〈O. 5cm小块，放入2mLRNAlater (Takara Bio)离心管，置于液氮中保存。，采用Affymetrix公司产GeneChipMouse Genome 430A 2. 0基因芯片(转录组芯片，每张芯片上有2. 6万个探针，可识别I. 4万个基因的转录表达)检测受试小鼠的基因组转录表达水平。每组小鼠随机分为3个平行样，每个平行样由3只小鼠肝脏样品混匀后提取总RNA样品，经系列前处理之后，应用基因芯片检测转录毒性。基因芯片检测的过程包括(A)总RNA抽取分离；(B) cDNA合成；(C) cDNA纯化；(D) cRNA合成及标记、(E) cRNA纯化；(F) cRNA片段化；(G)片段化cRNA与基因芯片分子杂交、洗脱、染色及扫描，获得分子杂交的信号图。以上基因芯片检测的过程是现有技术。 将分子杂交的信号图，转换为基因差异表达的参数水平(fold)，其中差异表达参数水平fold彡I. 5，且P〈0. 05的基因，定义为差异表达基因(DEGs);共鉴定出585个DEGs ;从60数据库中，检索585个DEGs的生物学意义，筛选出涉癌的DEGs，即为涉癌基因(cancer related gene);涉及一种癌症的所有DEGs,称之为该种癌症的涉癌基因组(cancer related genome);涉及所有癌症的DEGs,也可统称为所有癌症的涉癌基因组(cancers related genome)。检测计算长江南京饮用水源水诱发小鼠肝脏涉癌基因转录表达水平结果，见表I。从表I可以看出，应用基因芯片检出长江南京饮用水源水诱发受试小鼠肝脏基因组产生的585个DEGs中，以及应用基因芯片检出BaP试液诱发受试小鼠肝脏基因组产生的768个DEGs中，共发现其中20个DEGs是涉癌基因。长江南京饮用水源水和BaP试液同时诱发了 5个涉癌基因的差异表达，它们是Vcaml, Duspl, Cyp7al, Egln3和Itgav，占BaP试液诱发涉癌基因总数的38%，表明长江南京饮用水源水诱发的差异表达的涉癌基因数量，占有相当的份额。长江南京饮用水源水共诱发12个涉癌基因的差异表达；BaP试液共诱发13个涉癌基因的差异表达；两者涉癌基因之间的差异为68%，表明长江南京饮用水源水潜在的致癌毒性强度与致癌的种类，不同于BaP试液。表I.长江南京饮用水源水诱发小鼠肝脏涉癌基因转录表达水平检测结果
权利要求
1.毒理基因组学指数(crTGI)预警饮用水源水致癌风险的方法，其特征是步骤如下(I)应用基因芯片，检测水源水对小鼠的涉癌毒理基因组学指数(crTGIs)，指示水样中所有污染物潜在的致癌毒性； (2)以强致癌污染物苯并芘(BaP)为阳性毒性对照，将水源水涉癌毒理基因组学指数(crTGIs)数值，转化为BaP毒性的当量浓度；根据美国EPA控制BaP对人体致癌风险的标准阈值浓度，评价水源水BaP当量浓度的致癌风险度。
2.根据权利要求I所述的毒理基因组学指数(crTGI)预警饮用水源水致癌风险的方法，其特征是检测计算饮用水源水涉癌毒理基因组学指数(crTGI)方法和具体步骤为 第一步受试小鼠染毒处理 饮用水源水水样采集后冰浴，饮用水源水水样经0. 45 ii m滤膜过滤；以饮用水源水样品、3. 8 u g/L的BaP (苯并(a)芘)”化学溶液(阳性对照)、清洁水(阴性对照)分别饲喂3组小鼠，进行染毒试验；受试小鼠为雄性昆明种(Mus musculus, ICR), 3-4周龄,体重18±2g,清洁级。受试小鼠随机分为三组，每组10只，笼中饲养，温度为20-24°C，湿度为40-60%，昼夜12h/12h ;小鼠自由饮水，自由摄食标准化饲料； 第二步应用基因芯片检测涉癌基因组表达水平 小鼠饲喂90天处死，每只小鼠取0. 2g肝脏组织，切成〈O. 5cm小块，放入2mLRNAlater (Takara Bio)离心管，置于液氮中保存；采用转录组基因芯片，识别I. 4万个基因的转录表达检测受试小鼠的基因组转录表达水平；每组小鼠随机分为3个平行样，每个平行样由3只小鼠肝脏样品混匀后提取总RNA样品，经系列前处理之后，应用基因芯片检测转录毒性； 基因芯片检测的过程包括(A)总RNA抽取分离；(B) cDNA合成；(C) cDNA纯化；(D)cRNA合成及标记、(E)cRNA纯化；(F)cRNA片段化；(G)片段化cRNA与基因芯片分子杂交、洗脱、染色及扫描，获得分子杂交的信号图； 将分子杂交的信号图，转换为基因差异表达的参数水平，其中差异表达参数水平fold≥1.5，且？〈0. 05的基因，定义为差异表达基因(DEGs);共鉴定出585个DEGs ;从GO数据库中，检索585个DEGs的生物学意义，筛选出涉癌的DEGs，即为涉癌基因(cancerrelated gene);涉及一种癌症的所有DEGs,称之为该种癌症的涉癌基因组(cancerrelated genome);涉及所有癌症的DEGs,统称为所有癌症的涉癌基因组(cancers relatedgenome)； 检测计算长江饮用水源水诱发小鼠肝脏涉癌基因转录表达水平结果； 第三步计算饮用水源水涉癌毒理基因组学指数(crTGIs)，采用公式I ; crTGIs= E (sGELsi^bGELsi)-------------------------------------公式 I 式I中 sGELsi，是饮用水源水诱发小鼠一种癌症风险的涉癌基因组表达水平； bGELsi，是BaPs化学溶液诱发小鼠同一种癌症风险的涉癌基因组表达水平； 计算BaP试液涉癌毒理基因组学指数(crTGIb)，采用公式2，结果如下 crTGIb= E (bGELsi+bGELsi)------------------------------------公式 2 式2中 bGELsi，是BaP试液诱发小鼠一种癌症的涉癌基因组表达水平。每一种癌症bGELsi的自比值的总和，即为BaPs涉癌毒理基因组学指数(crTGIb)值； 第四步转化饮用水源水的crTGIs为BaP毒性的当量浓度 (A)计算饮用水源水crTGIs的 BaP当量致癌风险sLCR(lifetime cancer risk)采用公式3。
sLCR= (crTGI s XbLCR) + crTGIb-------------------------公式 3 式3中 crTGIs水源水诱发小鼠的涉癌毒理基因组学指数； crTGIb=13，是BaP试液诱发小鼠的涉癌毒理基因组学指数； bLCR=7. 56X 10_5是3. 8 y g/L的BaP试液致癌风险度的标准值； 计算结果饮用水源水的致癌风险度sLCR ； (B)计算饮用水源水的致癌风险度sLCR的BaP当量浓度(sBEC)用公式4。
sBEC=sLCR+bSF-----------------------公式 4 ； 式4中sLCR来自公式3的计算结果，bSF=l. 9896 X 10_5，是BaP的标准值。
全文摘要
毒理基因组学指数(crTGI)预警饮用水源水致癌风险的方法，步骤如下(1)应用基因芯片，检测水源水对小鼠的涉癌毒理基因组学指数(crTGIs)，指示水样中所有污染物潜在的致癌毒性；(2)以强致癌污染物苯并芘(BaP)为阳性毒性对照，将水源水涉癌毒理基因组学指数(crTGIs)数值，转化为BaP毒性的当量浓度；根据美国EPA控制BaP对人体致癌风险的标准阈值浓度，评价水源水BaP当量浓度的致癌风险度。
文档编号C12Q1/68GK102747155SQ20121023580
公开日2012年10月24日 申请日期2012年7月9日 优先权日2012年7月9日
发明者刘苏, 史薇, 吴兵, 尹金宝, 崔益斌, 张宗尧, 张宴, 张徐祥, 施鹏, 李梅, 李爱民, 王铸, 福得, 程树培, 贾舒宇, 赵福正, 陈亚军, 韦斯, 顾继东, 黄开龙 申请人:南京大学