载体包装细胞系的制作方法

专利名称：：载体包装细胞系的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种增加靶细胞中载体转导的方法。本发明提供一种重组工程化的包装(packaging)细胞系，其能够表达一种或多种有助于结合到靶细胞和靶细胞活化的膜蛋白。或者，本发明提供重组工程化的细胞，其内源性将一种或多种此类膜蛋白表达入包装细胞系。通过使用此类细胞系而包装入病毒颗粒中的载体将包含含有这些蛋白的外包膜。这些颗粒将特异性适用于结合和靶向靶细胞以促进该靶细胞被所述载体转导。靶细胞也可在不存在外源补充的刺激分子的情况下同时被包装的载体活化或刺激。
背景技术：
：已证明慢病毒载体通常转导不分裂的细胞如神经元，这类载体在没有细胞分裂的情况下将基因递送到靶细胞的能力是基于慢病毒的载体的限定特征和优点之一(Naldini等，1996-1；Naldini等，1996-2)。然而，以一种协调的方式驱动一群分裂的细胞使其活化将有助于整个细胞群以高水平被同时转导(Humeau等，2004；Park等，2000)。最初慢病毒在T细胞中的转导效率在20-40％之间(Schroers等，2002；Costello等，2000；Ranga等，1998；Mitsuasu等，2000)，加入cPPT/CTS序列以增加前病毒序列的核易位率可将转导效率显著提高到60-75％(Manganini等，2002；Follenzi等，2000；Cavalieri等，2003)。以前的这些报道所用的转导方法包括spinoculation以对靶细胞浓缩载体从而增加基因转移的几率，或预刺激细胞(一般为3天)，然后一次或多次加入载体(Levine等.，1997；Levine等.，2000)。这些方法在培养系统为封闭式的临床环境中很难应用，后续操作也很困难。最近开发出的转导方法包括同时加入载体、细胞和T细胞刺激性分子CD3和CD28(驱动细胞分裂)(Lu等，2004；Humeau等，2004)。以前已证明，加入载体之前用CD3和CD28预刺激细胞时，与CD3和CD28的接触可增加转基因表达(Costello等，2000)。这种组合性转导和培养起始方法产生最大为99％的转导效率，并将达到该转导水平所需的时间减少至3天(Lu等，2004)。这些研究强调了细胞刺激在达到治疗受益所需的足够高的转导效率中的重要作用。转导所需的培养时间的减少还有助于保留被转导细胞的天然效力。慢病毒的一个独特性质是它们不需要细胞细胞分裂就可实现基因插入。这有助于基因治疗中的静息(quiescent)细胞靶，包括巨噬细胞、初级造血祖细胞和循环的初级T淋巴细胞，本发明可靶向这些细胞，如下文详述。因为这些细胞靶保留了在体内发挥长期功能的特殊效力，所以它们在临床上尤其有用。离体用细胞因子或其它刺激分子进行广泛刺激可导致细胞在体内的效力发生改变(Maurice等，2002；Soares等，1998)。因此，采用基于HIV的载体时，在静息T细胞中诱导G0至G1b的瞬时转变可有助于载体的整合而不促进导致原始特征丧失的扩增(Dardalhon等，2000)。类似地在造血干细胞中，最小的刺激将促进有效的基因转移而不诱导血液重建潜能的丧失。虽然本领域最近开发的转导方法与早先的方法相比代表了重大改进，但用外源共刺激分子进行细胞活化这一需要与发展可注射入体内以促进有效的体内转导的基因治疗载体是相悖的。对于是否能够成功地在体内同时给予刺激分子和载体作为治疗方案还不确定。此外，即使是在离体基因转移的应用中，培养过程中对外源刺激分子的需要也引起了其它的质量控制和安全问题。上述文献的引用不意于认可其中任何一篇是相关的现有技术。对这些文献的日期的描述或对其内容的引用均基于申请人可获得的信息，不构成对这些文献的日期或内容正确性的认可。发明概述本发明提供改进的包装(packaging)和生产(producer)细胞系，以及包含它们的组合物和方法，以改进逆转录病毒和慢病毒的转导和靶向。在一些实施方式中，本发明涉及慢病毒转导系统，该系统提供具有改进的结合和刺激特性的慢病毒颗粒以促进被颗粒靶向的细胞的转导和增殖。在其它实施方式中，本发明提供转导非分裂细胞的方法，而不只是依赖高滴度的病毒颗粒和/或用外源补充的刺激因子来刺激。因此，本发明的优点在于其可应用于离体或体外，不需要可溶性刺激因子或辅助性细胞提供的因子。此外，本发明可用于体内，直接注射以递送载体或病毒颗粒的“有效负荷”(″payloads″)到对象中。在第一方面，本发明提供了一种通过将能够结合靶细胞和/或刺激所述细胞的细胞周期转换的分子掺入到载体包膜中而改进慢病毒的转导和靶向的方法。已证明，刺激细胞周期转换的能力可增加转导，在一些体外和离体转导方法中，这种能力是CD3和CD28配体的功能。例如，本领域其它研究人员已将抗人CD3/CD28耦合的珠子用于T细胞转导中(Lu等，2004和Levine等，1997和2000)。其它研究小组已工程化了含有重组包膜蛋白的逆转录病毒载体，这些重组包膜蛋白模拟共刺激分子例如IL-2和IL-7(Maurice等，1999和Verhoeyen等，2003)或单链抗-CD3抗体(Maurice等，2002)。本发明部分地基于这样一种认识，即，将细胞表面蛋白和分子掺入到逆转录载体的包膜表面将在不存在外源共刺激分子的情况下调节转导效率。本发明提供了一种制备慢病毒载体的新构思，所述载体含有优化的包膜，便于在所选择的靶细胞中的结合和后续转导或基因转移。这不是通过产生含有重组包膜蛋白的载体(Verhoeyen等，2003；Maurice等，1999和2002)来实现的，而是通过设计和采用工程化的、在载体表面上表达感兴趣的膜相关蛋白的生产细胞系来实现的。随后在该细胞系中产生的载体将具有膜相关蛋白，这些蛋白具有结合和活化靶细胞的能力，从而对于向这些细胞的基因转移来说是优化的。这些包膜蛋白可以是在生产细胞或其它细胞中天然存在的，作为非限定性例子，包括单独的CD49d、CD54、CD80和CD86或其中两种、三种或所有四种的组合。因此，本发明减少或消除了加入外源分子进行共刺激的需要，有利于在缺少外源提供的因子的情况下提供转导的细胞。这可扩展转导的细胞的可能用途和应用。本发明还提供了用于离体转导和体内基因递送的简化的、更适合临床应用的方法。本发明也可用于减少用包装的颗粒转导靶细胞时一些伴随的问题。作为一个示范性实施方式，可将慢病毒载体工程化为含有最大程度模拟形成于天然细胞宿主的天然HIV包膜且差别仅在于病毒包膜蛋白的包膜。通过在载体颗粒中包含蛋白例如但不限于CD86和CD54(单独或组合)，这些颗粒可有利地被用于刺激靶CD4T细胞(通过CD86)和/或通过细胞-载体相互作用而增加载体与细胞的结合(通过CD54)。因此，可以想像到用体内天然结合于靶细胞的细胞来包装载体。例如，T细胞含有结合并活化淋巴组织中的其它T细胞的分子。因此，T细胞或相关T细胞系可直接用作或经修饰后用作包装细胞，然后用作载体生产细胞产生可用于结合T细胞的载体。另一个例子是用间质干细胞(MSC)生产/包装载体来靶向和转导造血祖细胞，因为在体内MSC为这些细胞提供支持基质。除了非修饰性细胞的可能用途之外，本发明提供一种重组逆转录病毒包装细胞，其包含第一核酸分子，该分子在所述细胞中表达或能够表达至少一种膜相关性非病毒配体。所述配体在有些实施方式中是非内源的(或相对所述细胞是异源的，或在所述细胞中非正常表达)，虽然在本发明实施中也可采用包含能增加内源性膜相关性非病毒配体的核酸构建物的重组细胞。非病毒配体可以是天然存在的细胞表面分子，其能够结合靶细胞的细胞表面分子。所述第一核酸分子可以被瞬时导入所述细胞或预先被稳定地导入细胞。稳定转导的分子包括在本发明实施方式中。在有些实施方式中，所述至少一种膜相关性非病毒配体通过结合于所述细胞表面分子而在细胞-细胞粘着中起作用，和/或在结合于细胞的细胞表面分子之后发挥作用来活化或刺激细胞进入细胞周期转换，导致或不导致生长和/或增殖。在本发明一些实施方式中，细胞包含至少两种此类配体，例如一种配体在细胞-细胞粘着中起作用，一种活化或刺激细胞周期转换。在本发明其它实施方式中，所述配体是共刺激分子，该共刺激分子结合T细胞表面分子，以在所述T细胞的CD3/TCR复合体被天然或人工配体结合或被特异性抗体(Ab)结合时激活T细胞增殖。其它非限制性配体是那些从造血细胞上发现的配体。包装细胞的重组以及包装特性提示，该细胞包含表达或能够表达逆转录病毒载体包装所需的一种或多种病毒因子的至少一种异源核酸分子。所述一种或多种因子是以反式起作用而允许逆转录病毒核酸包装入病毒粒子或病毒颗粒的因子。在一些实施方式中，这些因子是一种或多种病毒结构蛋白，如基质、衣壳或核衣壳蛋白，和/或一种或多种病毒辅助蛋白。如本领域一般技术人员所认可的，包装细胞和将被包装的载体可看作一种包装系统，其中，反式作用所需的包装组分可由来自于包装细胞和来自于载体的核酸序列的组合表达。所述至少一种异源核酸分子可瞬时导入所述细胞或预先被稳定导入细胞。稳定导入的分子包括在本发明的实施方式中。病毒因子可支持慢病毒载体的包装。任何一种或多种因子的组合都可由包装细胞中的核酸序列编码，不以这种方式编码的任何因子由载体中的核酸序列编码。在某些实施方式中，所述因子包括病毒包膜蛋白和其它反式因子，例如慢病毒载体中的各种辅助蛋白，以及GAG或POL蛋白。在其它实施方式中，本发明的包装细胞表达或能够表达能包装慢病毒载体以产生能转导特定的靶细胞的颗粒的病毒包膜蛋白。在其它实施方式中，包装细胞表达或能够表达结合靶细胞的细胞表面分子的病毒配体。在本发明一个示范性实施方式中，病毒因子是保持或介导病毒或载体颗粒与靶细胞膜融合的蛋白。换句话说，该因子的作用是介导含有所述病毒配体的细胞膜与靶细胞的细胞膜融合。非限制性例子包括靶向或结合于结合素-1的因子，例如野生型单纯疱疹病毒(HSV)-1包膜蛋白。其它非限制性例子是病毒和非病毒因子，如靶向或结合CD34+、CD33+和/或CD14+细胞的因子，如靶向CD155/PVR或CD112(CD34+细胞上存在的结合素-2)的CD226(DNAM-1)蛋白。包装细胞的重组以及包装特性也提示，不存在待包装的载体序列时，细胞不产生病毒颗粒。载体序列可看作该细胞中的第二核酸分子，来自于慢病毒的、具有长末端重复(LTR)区域和/或慢病毒包装或二聚化信号的载体是本发明的实施方式。在其它实施方式中，本发明靶细胞包括但不限于，抗原呈递细胞(APC)、造血谱系细胞、干细胞、淋巴细胞(包括T细胞和B细胞，如淋巴结生发中心的T细胞和B细胞)、神经元、上皮细胞、肿瘤细胞、树突状细胞、成纤维细胞和非造血干细胞。包装细胞的膜相关性非病毒配体在掺入载体包膜之后，用于将病毒粒子颗粒导向这些靶细胞。在有些实施方式中，所述配体是跨膜蛋白，但是它们也可以是位于包装细胞膜的外表面上的蛋白。所述配体可以是高等真核细胞的蛋白、基于高等真核细胞蛋白的合成或嵌合(融合)分子、单链抗体或其结合片段、或微生物蛋白。本发明还提供包含本发明的包装细胞的组合物。这种组合物包括包装细胞和待包装载体的组合。载体可已被引入所述细胞。在有些实施方式中，本发明的载体是已被除去编码辅助蛋白的核酸的载体，例如但不限于，缺少能够表达慢病毒辅助蛋白的功能序列的慢病毒载体。这些蛋白可通过包装细胞以反式形式提供。其它组合物包括包装细胞和用于所述细胞增殖的合适培养基和/或孵育装置。在第二方面，本发明提供制备本发明的包装细胞的方法。所述方法包括引入核酸分子，所述核酸分子在所述包装细胞中表达或能够表达如本文所述逆转录病毒包装和/或复制所需的病毒基因产物；和引入至少一种核酸分子，其在所述包装细胞中表达或能够表达至少一种如本文所述的膜相关性非病毒配体。在第三方面，本发明提供生产或包装本发明的病毒载体颗粒的方法。所述方法包括将编码或包含逆转录病毒载体的核酸分子引入如本文所述的重组包装细胞中。然后在一定条件下培养这种细胞，在所述条件下所述细胞将所述载体包装入包含至少一种如本文所述的膜相关性非病毒配体的颗粒中。在第四方面，本发明提供一种逆转录病毒载体包装细胞，通过引入编码如本文所述的病毒包装因子的核酸分子使所述包装细胞成为重组细胞。所述细内源性表达能够结合到靶细胞或组织的细胞表面分子的至少一种膜相关配体。在有些实施方式中，所述细胞是非贴壁性细胞(例如，能够在悬浮状态下增殖)和/或在体内与靶细胞或组织相互作用或结合的细胞。非限制性实施方式包括骨髓基质细胞，其包装以造血干细胞作为靶细胞的载体。或者，所述细胞可以是表达结合到CD34+细胞表面的整合蛋白的细胞。在其它实施方式中，包装细胞可表达选自SDF-I、VLA-4、VLA-5或LFA-1的配体，因此，被包装的载体结合的造血干细胞为a)CD34+和CD38-/CXCR4+或b)CD34+和CD38low/CXCR4+。本发明还提供包含所述包装细胞的组合物，任选与本文所述的载体组合，以及制备所述细胞的方法和如本文所述的使用所述细胞包装载体的方法。在第五方面，本发明提供包含由本发明的细胞、组合物和方法产生的病毒颗粒的载体。这些颗粒将具有含有如本文所述配体和来自包装细胞的其它分子的外部。定义本文所用术语“重组”指用遗传工程和/或分子生物学技术来生产生物产品，如蛋白质或核酸。在要表达重组核酸分子的情况下，该术语一般指含有天然情况下不存在的序列的非天然存在的分子。当然，这种分子可用于表达天然存在的或合成的生物分子。在重组细胞的情况下，该术语一般指表达或能够表达非内源性蛋白的细胞，或表达或能够表达非内源水平的内源蛋白的细胞。术语“病毒颗粒”或“载体颗粒”或“病毒粒子”或其变体指通常包裹或包含本文所述病毒或载体核酸的大分子复合物。这些颗粒通常包裹在脂质双层膜中，所述脂质双层膜是在由本发明生产和包装细胞以及方法产生病毒颗粒的过程中获得的。附图简述图1显示通过采用在表达CD54的细胞中包装的病毒载体，能够增加初级人CD4+T淋巴细胞中的基因转移(转导水平)。在细胞膜中表达或不表达CD54蛋白的细胞中产生了基于HIV的慢病毒载体。在存在或不存在retronectin的情况下转化细胞之后，通过采用基于TaqManTM的PCR介导的检测来评价靶细胞中的(载体)拷贝数来比较载体的基因转移。n＝3。图2显示分离自正常人血液成份部分清透(apheresis)成分的CD4+-富集的T细胞在暴露于以下三种条件之一时的细胞生长曲线仅培养基(nada)，可溶性抗-CD3抗体(CD3)或抗CD3/28抗体包被的珠子(B)。感染复数(MOI)为20时，将三种条件下各组的细胞暴露于5种不同载体制剂之一仅载体缓冲液(NV)，未修饰的对照载体(CV)，或在细胞表面表达CD54的细胞中包装的载体(54)、或在细胞表面表达CD86(86)或CD54和CD86两者(54/86)的细胞中包装的载体。在21天的时间内，用Z2库尔特粒度仪监测细胞扩增。n＝3。图3显示分离自正常人血液成份部分清透(apheresis)成分的CD4+-富集的T细胞在暴露于以下三种条件之一时的细胞生长曲线仅培养基(nada)，可溶性抗-CD3抗体(CD3)或抗CD3/28抗体包被的珠子(B)。MOI为20时，将三种条件下各组的细胞暴露于5种不同载体制剂之一；仅载体缓冲液(NV)，未修饰的对照载体(CV)，由组合了CD54(54)或CD86(86)或两者(54/86)的293F细胞的瞬时转染产生的载体。在21天的时间内，用Z2库尔特粒度仪监测细胞扩增。n＝3。图4显示相较于表面仅表达CD54的293细胞，与表面表达CD86和CD54的293细胞共培养之后，通过检测活化标记CD25表达的增加，检测到分离自正常人血液成份部分清透产品的初级CD4+富集的T细胞活化的增强。不存在刺激性抗-CD3抗体或抗-CD3抗体浓度为5μg/ml-20μg/ml的情况下被孵育细胞。培养开始后4天检测CD25的表达(频率和平均荧光)。n＝3，显示了与平均值的标准误差。图5显示相较于表面仅表达CD54的293细胞，与表面表达CD86和CD54的293细胞共培养之后，通过检测活化标记CD69表达的增加，检测到分离自正常人血液成份部分清透产品的初级CD4+富集T细胞活化的增强。不存在刺激性抗-CD3抗体或抗-CD3抗体浓度为5μg/ml-20μg/ml的情况下孵育细胞。培养开始后4天检测CD69的表达(频率和平均荧光)。n＝3，显示了与平均值的标准误差。图6显示暴露于表达GFP作为标记基因的未修饰或经修饰的慢病毒载体之后，对于分离自正常人血液成份部分清透产品的初级CD4+富集T细胞转导的影响。细胞不暴露于刺激性分子(nada)，或暴露于可溶性抗CD-3抗体(CD3)或抗-CD3/28抗体包被的珠子(B)。然后在MOI为20时将三种条件下的各组暴露于几种载体之一，这几种载体包括未修饰的对照载体(CV)，或表达CD54(54)或CD86(86)或二者(54/86)的细胞系产生的载体。除检测到的GFP表达水平(表示为经修饰的细胞的百分数)之外，还显示了相对的CD25和CD69蛋白水平。n＝3，显示了与平均值的标准偏差。图7显示暴露于表达GFP作为标记基因的未修饰或经修饰的慢病毒载体之后，对于分离自正常人血液成份部分清透产品的初级CD4+富集T细胞转导的影响。细胞不暴露于刺激性分子(nada)，或暴露于可溶性抗CD-3抗体(CD3)或抗-CD3/28抗体包被的珠子(B)。然后在MOI为20时将三种条件下的各组暴露于几种载体之一，这几种载体包括未修饰的对照载体(CV)，或瞬时表达CD54(54)或CD86(86)或二者(54/86)(的细胞)产生的载体。除检测到的GFP表达水平(表示为经修饰的细胞的百分数)之外，还显示了相对的CD25和CD69蛋白水平。n＝1。发明实施方式详述本发明提供逆转录病毒包装细胞和含有它们的载体包装系统。所述细胞和系统可用于制备包装的载体颗粒，这些载体颗粒可用于转导多种靶细胞。如上所述，本发明有多种实施方式。非限制性实施方式包括所用细胞类型、所包装的载体类型、所表达的配体类型、用于表达配体的构建物和方法、以及被包装的载体靶向的细胞类型。当然，本领域一般技术人员可以理解的是，包装细胞包含至少一种异源核酸分子，该核酸分子表达或能够表达载体包装所需的一种或多种病毒因子。所述一种或多种因子以反式发挥作用以允许将病毒核酸载体包装到病毒粒子或病毒颗粒中。因此，在一个实施方式中，本发明提供包含第一核酸分子的重组逆转录病毒包装细胞，所述核酸分子能够在所述包装细胞中表达结合于靶细胞细胞表面分子的至少一种膜相关性非病毒配体。在有些实施方式中，所述细胞在不存在第二核酸分子的情况下不产生病毒颗粒，所述第二核酸分子表达病毒因子，或者表达、或者是载体序列。在另一个实施方式中，本发明提供一种逆转录病毒载体包装细胞，其内源性表达能够结合靶细胞或组织的细胞表面分子的至少一种膜相关性配体。可采用多种细胞来实施本发明。实施方式包括哺乳动物细胞，虽然也可采用支持逆转录病毒和慢病毒载体包装的其它类型的真核细胞。细胞类型包括悬浮细胞，以及例如但不限于COS、TE671、HT1080、Mv-1-Lu和人293细胞系等细胞。也可用上述细胞的衍生物或天然存在的细胞的衍生物。在其它实施方式中，包装细胞表达病毒包装所需的一种或多种反式作用病毒蛋白。在有些实施方式中，逆转录病毒包装细胞包括i)能够表达病毒或非病毒配体的异源核酸分子，所述病毒或非病毒配体结合靶细胞的细胞表面分子并且任选地发挥作用以介导含有所述病毒配体的细胞膜与靶细胞结合或融合和/或刺激从Gp至G1b的细胞周期转换；或ii)能够表达CD226(DNAM-1)、野生型单纯疱疹病毒(HSV)-1包膜蛋白、或其它病毒包膜蛋白的异源核酸分子。当逆转录病毒包装细胞包含ii)时，靶细胞是造血干细胞；CD34+、CD33+、CD14+或表达结合素1或结合素样蛋白的细胞；T细胞；淋巴结生发中心的树突状细胞或B细胞；或成纤维细胞。在其它实施方式中，本发明的包装细胞衍生自体内与靶细胞或组织相互作用的细胞。反式作用蛋白的非限制性例子包括结构蛋白、包膜(env)蛋白、辅助蛋白、有助于与靶细胞膜融合的蛋白，和任何逆转录病毒或慢病毒的Gag和/或Pol蛋白，这些病毒包括但不限于，莫洛尼鼠白血病病毒、鲁斯肉瘤病毒、RD114、BaEV、GALV、SSAV、FeLV-B、兼嗜性(amphotropic)鼠白血病病毒(MLV-A)、人免疫缺陷型病毒、禽类白细胞增生病毒和NZB病毒。GAG和/或POL蛋白也可以是经修饰的、合成的、或嵌合的GAG/POL构建物。包膜蛋白的例子包括但不限于，兼嗜性包膜、亲嗜性(ecotropic)包膜或异嗜性(xenotropic)包膜，或可以是包括兼嗜性和亲嗜性部分的包膜。所述蛋白也可以是上述任何逆转录病毒和慢病毒的蛋白。或者，env蛋白可以是经修饰的、合成的或嵌合的env构建物，或获自非逆转录病毒，例如水泡性口膜炎病毒和HVJ病毒。具体的非限制性例子包括莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)、鲁斯肉瘤病毒和猫科的内源性病毒RD114的包膜；长臂猿白血病病毒(GALV)包膜；狒狒内源性病毒(BaEV)包膜；猿猴肉瘤相关病毒(SSAV)包膜；兼嗜性鼠白血病病毒(MLV-A)包膜；人免疫缺陷型病毒包膜；禽类白细胞增生病毒包膜；内源的嗜异性NZB病毒包膜；和副粘病毒科的包膜，例如但不限于，HVJ病毒包膜。被包装的载体类型包括基于任何病毒的载体。一些非限制性例子是衍生自逆转录病毒的载体，所述逆转录病毒包括禽网状内皮组织增生病毒(鸭感染性贫血病毒、脾坏死病毒、Twiehaus株网状内皮组织增生病毒、C型逆转录病毒、网状内皮组织增生病毒Hungary-2(REV-H-2))和猫白血病病毒(FeLV)。逆转录病毒基因组已被修饰以用作载体(Cone&Mulligan，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816349-6353，(1984))。可用作本发明载体的逆转录病毒或逆转录病毒科成员的非限制性例子包括慢病毒，如人免疫缺陷型病毒(HIV-1和HIV-2)、猫免疫缺陷型病毒(FIV)、猴免疫缺陷病毒(SIV)、梅迪/维斯那病毒、羊关节炎/脑炎病毒、马传染性贫血病毒(EIAV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)；禽C型逆转录病毒，如禽类白细胞增生病毒(ALV)；HTLV-BLV逆转录病毒，如牛白血病病毒(BLV)、人嗜T淋巴细胞病毒(HTLV)和猴嗜T淋巴细胞病毒；哺乳动物B型逆转录病毒，如小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)；哺乳动物C型逆转录病毒，如鼠白血病病毒(MLV)、猫肉瘤病毒(FeSV)、鼠肉瘤病毒、长臂猿白血病病毒、豚鼠C型病毒、猪C型病毒、绒毛猴肉瘤病毒和蝰蛇逆转录病毒；泡沫病毒(泡沫病毒群)，如人泡沫病毒(HSRV)、猫合胞体形成病毒(FeSFV)、人合胞病毒(humanfoamyvirus)、猴泡沫病毒(simianfoamyvirus)和牛合胞病毒(bovinesyncytialvirus)；D型逆转录病毒，如梅森-菲舍猴病毒(MPMV)、松鼠猴逆转录病毒和叶猴病毒。术语“载体”或“质粒”指能够在不同细胞或遗传环境之间运送核酸序列的核酸分子。非限制性载体包括能够自主复制和表达其中存在的核酸序列的载体。载体也可任选地包含与所用的细胞系统相容的可选择性标记。用于实施本发明的一种载体类型是以游离体存在的载体，它是一种能够在染色体外复制的核酸。另一种载体类型是能够稳定整合到它所转入的细胞的基因组中的载体。本发明的载体可包含编码“有效负荷”的遗传物质，所述“有效负荷”在包装细胞中表达和/或在载体递送入靶细胞之后在靶细胞中表达。载体被包装入颗粒也允许“有效负荷”或由编码“有效负荷”的遗传物质表达而产生的生物物质掺入将被递送到靶细胞中的被包装颗粒中。本发明中的一种“有效负荷”是由载体“基因组”编码的治疗性物质。当然，多肽或核酸(如RNA)“有效负荷”除在靶细胞中表达之外，也可在包装细胞中表达，并在被包装颗粒中物理性存在，或者不在靶细胞中表达而在包装细胞中表达，并在被包装颗粒中物理性存在。在一些实施方式中，“有效负荷”对所用的包装细胞无毒性或者毒性极小。编码治疗性物质的遗传物质的非限制性例子包括，编码肿瘤坏死因子(TNF)基因如TNF-α的多核苷酸；编码干扰素如干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ的基因；编码白介素如IL-1、IL-1β和白介素2-14的基因；编码GM-CSF的基因；编码腺苷脱氨酶或ADA的基因；编码细胞生长因子如淋巴因子(淋巴细胞的生长因子)的基因；编码表皮生长因子(EGF)和角质化细胞生长因子(KGF)的基因；编码可溶性CD4的基因；因子III；因子IX；细胞色素b；葡萄糖脑苷脂酶；T细胞受体；LDL受体、ApoE、ApoC、ApoAI和参与胆固醇运输和代谢的其它基因；α-1抗胰蛋白酶(α1AT)基因；胰岛素基因；次黄嘌呤转磷酸核糖基酶基因；CFTR基因；负选择性标记或“自杀”基因，如病毒胸苷激酶基因，如单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，细胞巨化病毒胸苷激酶基因，和水痘-带状疱疹病毒胸苷激酶基因；抗体的抗原结合结构域的Fc受体，抑制病毒复制的反义序列，如抑制乙肝病毒或非甲非乙肝炎病毒复制的反义序列；反义c-myb寡核苷酸；以及编码抗氧化剂的基因，抗氧化剂例如但不限于，锰-超氧化物歧化酶(Mn-SOD)、过氧化氢酶、铜-锌超氧化物歧化酶(CuZn-SOD)、细胞外超氧化物歧化酶(EC-SOD)，和谷胱甘肽还原酶；多药耐药性(MDR)基因；编码核酶的多核苷酸；反义多核苷酸；编码作为血管紧张素转换酶、血管平滑肌钙通道或肾上腺素能受体的竞争性抑制剂的分泌型多肽的基因，和编码破坏中枢神经系统的淀粉样蛋白斑的酶的多核苷酸。也可使用编码以下物质的遗传物质组织纤维蛋白溶酶原激活剂(tPA)；泌尿纤维蛋白溶酶原激活剂(尿激酶)；水蛭素；苯丙氨酸羟化酶基因；神经元一氧化氮合酶；内皮一氧化氮合酶；血管活性肽；血管生成肽；抗-血管生成肽；多巴胺基因；抗肌萎缩蛋白基因；β-球蛋白基因；α-球蛋白基因；HbA基因；原癌基因如ras、src和bcl基因；肿瘤抑制基因如p53和Rb；LDL受体；heregulin-α蛋白基因，用于治疗乳腺癌、卵巢癌、胃癌和子宫内膜癌；以及对T细胞抗原受体的β链内所含的表位具有特异性的单克隆抗体。然而应理解，本发明的范围不限于任何具体的治疗物质。在本发明的一些实施方式中，有效负荷可以是编码凝固因子(可用于治疗血友病，例如，因子VIII或因子IX)的基因，或可编码具有其它治疗效果的一种或多种产品的基因。合适基因的例子包括编码细胞因子如TNF、白介素(白介素1-12)、干扰素(α、β和γ干扰素)的基因，编码T细胞受体蛋白和用于结合抗体的Fc受体的基因。本发明的载体可用于治疗多种疾病，包括但不限于，感染性疾病，如病毒感染病如HIV和疱疹感染，遗传性疾病，如癌症、腺苷脱胺酶缺陷、镰状细胞性贫血、地中海贫血、血友病、糖尿病、α-抗胰蛋白酶缺陷，脑疾病如阿耳茨海默病，和其它疾病如生长疾病和心脏疾病，例如胆固醇代谢通路发生改变和免疫系统缺陷造成的疾病。在其它实施方式中，本发明的载体可包括负选择性标记，如病毒胸苷激酶基因如单纯疱疹病毒胸苷激酶(TK)基因。此类载体可体内施用于人患者的癌症细胞(具体是肿瘤细胞)或离体使用。然后，载体转导肿瘤细胞。载体转导肿瘤细胞之后，给予患者相互作用制剂，如更昔洛维或阿昔洛维，它们与负选择性标记所表达的蛋白相互作用以杀伤所有被编码负选择性标记的载体转导的、正在复制的细胞(即癌症或肿瘤细胞)。本发明载体被设计以结合并感染特定的靶细胞。在一些实施方式中，靶细胞是抗原呈递细胞(APC)、造血谱系细胞、干细胞、造血干细胞、淋巴细胞、神经元和内皮细胞，或肿瘤细胞。当靶细胞是造血干细胞时，包装细胞任选地是骨髓基质细胞。造血干细胞靶可以是CD34+和CD38-/CXCR4+，或CD34+和CD38low/CXCR4+。其它干细胞包括从胎儿组织如骨髓或肝分离出的CD34+细胞，CD34+前体人胚胎干细胞(hESC)，造血来源或上述其它来源的CD133+干细胞，或侧群(sidepopulation，SP)表型的细胞。配体任选地是SDF-I、VLA-4、VLA-5或LFA-1。本发明还包括用整合蛋白作为配体来靶向CD34+细胞。可用多种天然存在或工程化的膜相关性配体来实施本发明，所述膜相关性配体结合靶细胞的细胞表面分子并有助于靶细胞的病毒颗粒转导。所述配体可发挥功能以介导含有所述配体的细胞膜与靶细胞细胞膜融合。实施方式包括已知在细胞-细胞粘着中起作用的任何配体分子，或对靶细胞具有活化或刺激(包括进入或转换全部或部分细胞周期、或细胞增殖或细胞生长)活性的任何配体分子。包括已知当CD3/TCR复合物被天然配体或特异性抗体(Ab)结合时对T细胞增殖具有增效作用的共刺激分子。因此，当所述T细胞的CD3/TCR复合物被天然或人工配体或特异性Ab结合时，结合T细胞表面分子以活化T细胞增殖的共刺激分子可用于实施本发明。在一些实施方式中，包装细胞表达至少两种此类配体，如但不限于，一种配体有助于细胞-细胞粘着，另一种配体有助于靶细胞刺激。在其它实施方式中，所述膜相关性非病毒配体是造血细胞的膜相关性非病毒配体或是跨膜蛋白。膜相关性配体的其它非限制性例子是抗体，包括嵌合的、人源化的、单克隆、单链形式的抗体，及其片段，它们作为如上所述的膜相关性配体发挥作用。非限制性例子包括结合LFA-1、CD18、CD11b、CD11c、CD11d或CD43的抗体或抗体片段。其它非限制性例子是作为如上所述配体的微生物成分。结合LFA-1、CD18、CD11b、CD11c、CD11d或CD43的微生物蛋白代表了非限制性例子。配体的具体示范性非限制性例子包括CD28；CD28BP(见Lazetic等，J.Biol.Chem.，277(41)38660-38668(2002))；B7-H1、B7-H2(也称为ICOS-L，B7RP-1，GL50)、B7-H3、B7-H4、和其它相关B7分子；PD-1结合分子，如PD-L2和PD-L1；结合OX40/CD134)的OX40配体(CD154)；结合4-1BB/CD137的4-1BB配体；LFA-1(CD11a和CD18的复合物)结合分子，如ICAM-1/CD54、ICAM-2/CD102、ICAM-3/CD50、ICAM-4/LW或ICAM-5/端脑特异性膜蛋白(telencephalin)；结合LFA-1、CD11a、CD18、CD11b、CD11c、CD11d或CD43的抗体或微生物分子；CD2(LFA-2)的分子，如CD15、CD48、CD58或CD59；CD5的配体，如CD72；和CD58(LFA-3)的配体，如CD2。当然，这些配体的任何组合也可用于实施本发明。其它示范性和非限制性例子包括结合靶T细胞以及其它细胞表面的配体，所述其它细胞包括B细胞(例如，通过CD40)，表达CD34的造血祖细胞(例如通过CD62L)，和对逆转录病毒和/或慢病毒感染/复制敏感的其它细胞。用作配体的细胞表面分子的其它例子包括LFA-3(也称为CD58)；FasL(Fas配体)；CD70；B7-H1(也称为PD-L1)；B7-H2；B7-H3(也称为B7RP-2)；B7-H4；CD2；CD3或CD3/TCR复合物；CD11a；CD26；CD27；CD28；CD30L；CD32；CD38；CD40L(也称为CD154)；CD45；CD49；CD50(也称为ICAM-3)；CD54(也称为ICAM-1)；CD80(也称为B7.1)；CD86(也称为B7.2)；CD100；CD122；CD137L(也称为4-IBB配体)；CD153；CTLA-4(也称为CD152)；ICOS；OX40L(也称为CD134)；PD-1；PD-L2(也称为B7-DC)；SLAM(也称为CD150)；TIM-1；TIM-2；TIM-3；TIM-4；和2B4(也称为CD244)。一些配体可任选地与MHCII类共表达。当然，这些配体的任何组合也可用于实施本发明。可用已知的任何合适的或方便的方法来获得或制备编码可用于本发明的配体或病毒因子的核酸，所述方法包括已知序列的PCR扩增。一种类型的配体分子是刺激或共刺激分子，如结合CD28的B7-1(以前称为B7，也称为CD80)和B7-2(也称为CD86)。B7-1和B7-2是相关的同型二聚糖蛋白，是免疫球蛋白超家族的一部分。其它刺激或共刺激分子是抗-CD28抗体或其功能性部分，包括结合CD28的Fab部分。在一些实施方式中，包装细胞表达CD86但不表达CD54作为配体。另一种类型的配体是细胞-细胞粘着分子。这些分子包括各种ICAM分子，包括细胞内粘着分子(ICAM)ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3，淋巴细胞功能相关抗原(LFA)LFA-1和LFA-3。ICAM相关性成员均结合于T细胞整合蛋白，LFA-1。除在APC包括树突状细胞、巨噬细胞和B细胞上表达之外，ICAM-1和ICAM-2还在内皮(细胞)表达，因此介导细胞粘着和本发明被包装载体的可能的转导。ICAM-3只在白细胞上表达，因此可作为靶被本发明的配体结合。在一些实施方式中，包装细胞表达CD86但不表达ICAM-1(CD54)、ICAM-2或ICAM-3作为配体。已观察到，ICAM-1、-2和-3之间的相互作用与LFA-3(CD58)和LFA-2(CD2)与LFA-1(CD11a和CD18)之间的第二结合作用具有协同性。因此，这些ICAM分子可与CD58、CD11a和CD18、或CD2共表达，以允许靶向含有结合CD58、CD11a和CD18、或CD2的表面分子的细胞。在一些实施方式中，LFA-1、LFA-2或LFA-3不与CD86共表达。本发明实施中还可采用存活分子作为配体。存活分子定义为在细胞应答(范围包括从细胞死亡的刺激到诱导)中起作用的分子。存活分子可以是暴露在细胞表面的蛋白，或者其它细胞表面大分子如糖或脂。这些细胞表面分子也称为细胞表面的受体。可用于实施本发明的存活分子包括Fas配体。其它分子包括TNF受体、TNF、和CD70(一种II型跨膜蛋白，是结合于CD27的TNF家族的成员)。CD27在休眠的T细胞和B细胞上表达，而CD70在活化的T细胞和B细胞上表达。CD70与其受体CD27结合，诱导T细胞共刺激，这种相互作用可能对于从未引发的(unprimed)T细胞库中募集T细胞很重要。在其它某些条件下，TNF激活TNF受体导致类似的反应。其它非限制性细胞表面结合分子是FLT-3配体、TPO和Kit配体受体的抗体或配体，它们使表达这些受体的细胞(如造血干细胞)更容易接受载体转导。其它非限制性细胞表面结合分子是GM-CSF和IL-4受体的抗体或配体，它们使以下细胞更容易接受载体转导树突状细胞或它们的前体，如单核细胞，CD34阳性干细胞，或它们在树突状细胞谱系上的分化的祖细胞。其它的细胞表面结合分子包括在细胞表面上发现的、结合于其它细胞表面的分子。细胞表面结合分子的其它例子包括多肽、核酸、糖、脂和离子，均任选与其它物质复合。在一些实施方式中，所述分子与在血细胞表面上发现的因子结合，如CD1a，CD1b，CD1c，CD1d，CD1e，CD2或CD2R，CD3γ，CD3δ，CD3ε，CD4，CD5，CD6，CD7，CD8α，CD8β，CD9，CD10，CD11a，CD11b，CD11c，CDw12，CD13，CD14，CD15，CD15u，CD16a，CD16b，CDw17，CD18，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD24，CD25，CD26，CD27，CD28，CD29，CD30，CD31，CD32，CD33，CD34，CD35，CD36，CD37，CD38，CD39，CD40，CD41，CD42a，CD42b，CD42c，CD42d，CD43，CD44，CD44R，CD45或CD45R或CD45RO或CD45RA或CD45RB或CD45RC，CD46，CD47，CD48，CD49a，CD49b，CD49c，CD49d，CD49e，CD49f，CD50，CD51，CD52，CD53，CD54，CD55，CD56，CD57，CD58，CD59，CD60a，CD60b，CD60c，CD61，CD62E，CD62L，CD62P，CD63，CD64，CD65，CD65s，CD66a，CD66b，CD66c，CD66d，CD66e，CD66f，CD68，CD69，CD70，CD71，CD72，CD73，CD74，CD75，CD75s，CD77，CD79a，CD79b，CD80，CD81，CD82，CD83，CD84，CD85，CD86，CD87，CD88，CD89，CD90，CD91，CDw92，CDw93，CD94，CD95，CD96，CD97，CD98，CD99，CD100，CD101，CD102，CD103，CD104，CD105，CD106，CD107a，CD107b，CD108，CD109，CD110，CD111，CD112，CD113，CD114，CD115，CD116，CD117，CD118，CDw119，CD120a，CD120b，CD121a，CDw121b，CD122，CD123，CD124，CDw125，CD126，CD127，CDw128a，CDw128b，CD129，CD130，CD131，CD132，CD133，CD134，CD135，CDw136，CDw137，CD138，CD139，CD140a，CD140b，CD141，CD142，CD143，CD144，CDw145，CD146，CD147，CD148，CDw149，CD150，CD151，CD152，CD153，CD154，CD155，CD156a，CD156b，CD156c，CD157，CD158，CD159a，CD159b，CD160，CD161，CD162，CD162R，CD163，CD164，CD165，CD166，TCRζ，CD167a，CD168，CD169，CD170，CD171，CD172a，CD172b，CD172g，CD173，CD174，CD175，CD175s，CD176，CD177，CD178，CD179a，CD179b，CD180，CD181，CD182，CD183，CD184，CD185，CDw186，CD191，CD192，CD193，CD195，CD196，CD197或CDw197，CDw198，CDw199，CD200，CD201，CD202b，CD203c，CD204，CD205，CD206，CD207，CD208，CD209，CDw210，CD212，CD213a1，CD213a2，CDw217，CDw218a，CDw218b，CD220，CD221，CD222，CD223，CD224，CD225，CD226，CD227，CD228，CD229，CD230，CD231，CD232，CD233，CD234，CD235a，CD235b，CD235ab，CD236，CD236R，CD238，CD239，CD240CE，CD240D，CD240DCE，CD241，CD242，CD243，CD244，CD245，CD246，CD247，CD248，CD249，CD252，CD253，CD254，CD256，CD257，CD258，CD261，CD262，CD263，CD264，CD265，CD266，CD267，CD268，CD269，CD271，CD272，CD273，CD274，CD275，CD276，CD277，CD278，CD279，CD280，CD281，CD282，CD283，CD284，CD289，CD292，CDw293，CD294，CD295，CD296，CD297，CD298，CD299，CD300a，CD300c，CD300e，CD301，CD302，CD303，CD304，CD305，CD306，CD307，CD309，CD312，CD314，CD315，CD316，CD317，CD318，CD319，CD320，CD321，CD322，CD324，CDw325，CD326，CDw327，CDw328，CDw329，CD331，CD332，CD333，CD334，CD335，CD336，CD337，CDw338，和CD339。小写字母(例如“a”或“b”)表示该CD分子是复合的CD分子，所述复合的CD分子由多个基因产物组成或者属于结构相关蛋白家族。符号“w”表示还没有完全确证的、推定的CD分子。更完全的CD分子列表可见http://mpr.nci.nih.gov/prow/。当然，这些配体的任何组合都可用于实施本发明。其它非限制性例子的分子与淋巴细胞、T细胞和白细胞上发现的因子结合，如CD2，CD3γ，CD3δ，CD3ε，CD5，CD6，CD7，CD8α，CD8β，CD9，CD11a，CD18，CD25，CD26，CD27，CD28，CD29，CD30，CD37，CD38，CD39，CD43，CD44，CD45R，CD46，CD48，CD49a，CD49b，CD49c，CD49d，CD49e，CD49f，CD50，CD53，CD54，CD56，CD57，CD58，CD59，CDw60，CD62L，CD68，CD69，CDw70，CD71，CD73，CDw75，CDw76，CD84，CD85，CD86，CD87，CD89，CD90，CD94，CD96，CD97，CD98，CD99，CD100，CD101，CD103，CD107a，CD107b，CDw108，CDw109，CD118，CD119，CD120b，CD121a，CD122，CDw124，CDw127，CDw128a，CDw130，CD132，CD134，CDw137，CD140a，CD140b，CD143，CD146，CD148，CD152，CD153，CD154，CD155，CD161，CD162，CD165，CD166，和TCRζ。当然，这些配体的任何组合都可用于实施本发明。很多构建物和方法可用于表达本发明的病毒因子和配体。非限制性构建物包括含有适于在所用包装细胞中调控配体表达的启动子的构建物。这些包括可操作性连接于编码本文所述的病毒因子和配体的核酸序列的诱导型和组成型启动子。本发明的实施可采用能够表达本文所述配体和病毒因子的、基本为纯化形式的质粒表达载体。因此，编码配体和病毒因子的序列被用于产生相应的重组蛋白。能够指导这些序列表达的辅助性载体在本文中也可称为“表达载体”或“表达质粒”。表达载体含有位于调控区域的启动子序列，该序列(与插入的序列可操作性相连)有助于插入的核酸序列在宿主中的转录。所述序列可编码本发明的配体或“有效负荷”。载体可含有诱导型启动子序列，以减少组成型表达启动子序列的细胞所承受的选择压力。表达载体通常含有复制起始位点以及允许对被转化细胞进行表型选择的特定基因。可操作性连接指核酸序列之间的共价连接，从而产生功能性元件之间的联合，如调控区的相应元件与上述启动子和编码序列的连接。可用于本发明的载体可以是与真核细胞相容的载体。真核细胞表达载体是本领域已知的，其含有用于表达编码本发明配体和病毒因子的序列的启动子。这些表达载体也可含有进行精确和有效的聚腺苷酸化所需的不同的序列元件，以及任选用于产生成熟的mRNA的剪接信号。它们也可任选地含有病毒复制子以增加所编码基因的表达水平。采用诱导型启动子也可实现高水平表达，所述启动子包括但不限于，金属硫蛋白(metallothionine)IIA启动子和热休克启动子。本发明还提供一种制备重组逆转录病毒包装细胞的方法。所述方法包括将以下物质引入细胞，1)能够在所述包装细胞中表达逆转录病毒包装和/或复制所需的病毒基因产物的核酸分子，和2)能够在所述包装细胞中表达至少一种膜相关性非病毒配体的至少一种核酸分子，所述膜相关性非病毒配体结合靶细胞的细胞表面分子。另一种方法包括将以下物质引入细胞，1)能够在所述包装细胞中表达逆转录病毒包装和/或复制所需的病毒基因产物的核酸分子，和2)能够在所述包装细胞中增加至少一种膜相关性非病毒配体表达的至少一种核酸分子，所述膜相关性非病毒配体结合靶细胞的细胞表面分子。在一些实施方式中，本发明还提供稳定转染以长期、大量地产生重组配体和病毒因子。稳定转染指遗传物质整合入细胞基因组，从而在细胞复制和分裂的后续周期中所述遗传物质不会丢失。或者，可瞬时转染细胞，从而遗传物质不稳定，可在细胞复制和分裂的后续周期中从细胞中丢失。可用被合适表达控制元件(例如，启动子和增强子序列，转录终止子，聚腺苷酸位点等)控制的cDNA和任选的可选择性标记转化包装细胞。所述可选择性标记赋予细胞选择抗性，允许细胞稳定地将质粒整合入其染色体，并生长以形成可扩增成细胞系的克隆。本发明还关注在同一种载体中存在一种以上配体和/或病毒因子编码序列，并处于一个或独立的(任选地为多个)调控元件如启动子控制之下的情况。因此，用于在包装细胞中产生本发明的重组配体和/或病毒因子蛋白的辅助性载体构建物的所有可能组合均被考虑在内。被包装的载体靶向的细胞类型(或靶细胞)包括但不限于，初级细胞，包括血细胞，其包括所有形式的成核血细胞及其祖细胞和前体；肝细胞；内皮细胞；淋巴细胞；和肿瘤细胞，包括恶性和非恶性肿瘤细胞。当给予这些细胞时，可通过离体或体内技术将包装的载体给予动物，如人。此外，本发明提供一种产生或包装病毒载体的方法。所述方法包括1)向本发明包装细胞中引入编码或包含逆转录病毒载体的核酸分子，和2)在所述细胞将所述载体包装成颗粒的情况下培养所述细胞，所述颗粒含有所述包装细胞的一种或多种膜相关性非病毒配体。所述配体如本文所述，因此可结合靶细胞的细胞表面分子。在一些实施方式中，编码或包含逆转录病毒载体的核酸分子是引入包装细胞的“第二”核酸。现在已总体描述了本发明，通过参考以下实施例将能够更容易地理解本发明，除非另有具体说明，实施例只是用于阐释本发明，不用于限制本发明。实施例实施例1慢病毒载体膜中掺入的CD54介导的转导增强VRX494是最小的基于HIV的慢病毒载体，含有cppt/CTS序列、937碱基的反义有效负荷(靶向HIV包膜基因)和GFP标记基因(在其它实施方式中可除去)。后两种核酸序列都在LTR启动子控制下表达。根据发表的用于产生G蛋白准型(pseudotyped)病毒颗粒的方法(Lu等，2004)，VRX494是在存在一个辅助性质粒的情况下由293FT细胞的瞬时转染而产生的(因此是基于293的包装细胞)。为了检测CD54在包装细胞表面上的表达是否导致其在载体膜上的表达并因此增强转导，制备了表达CD54的构建物(VRX588)。在存在或不存在VRX588的情况下制备VRX494，产生在病毒颗粒包膜表面含有或不含有CD54的载体。在各个间隔收集含有载体的上清，富集并离心。在缓冲液中重建载体团块，然后根据已发表的方法(Lu等.，2004)滴加在HeLa-tat细胞上。CD4+T淋巴细胞通过MACS阳性筛选分离自人PBMC。在CD3/CD28刺激性珠(3珠/细胞)存在下，纯化的细胞以1×106/孔的浓度在T细胞培养基中(Xvivo15，加有10mMNAC，5％人血清，100单位/毫升IL-2，和庆大霉素)培养过夜，所述CD3/CD28刺激性珠可能影响CD11a/CD18(LFA-1)的构象使其对载体颗粒上的CD54(ICAM-1)的结合更敏感。在存在或不存在retronectin时，以MOI20一式三份进行转导。在载体存在下，37℃5％CO2中孵育培养物3天。洗去未使用的载体，然后以0.5×106细胞/毫升重新装板。通过在合适的容器中扩大培养基体积，使细胞维持在此浓度至第7天。在第7天，收集培养物，在PBS中洗涤两次，计数，干燥并将细胞团块分成106细胞/瓶，用于测定每细胞平均载体拷贝数(使用根据SOP的TaqManPCR)。存在retronectin(已知该化合物可增强转导)时，与不存在CD54的对照相比，CD54的存在使靶初级CD4T淋巴细胞中的(载体)拷贝数增加约7倍。不存在retronectin时，相对于没有CD54的对照，CD54增加靶拷贝数10倍。在存在或缺少retronectin时，在CD54阳性载体转导的细胞之间获得了相似的转导水平(图1)。这说明retronectin对于转导效率有相对较小的阳性作用，而CD54的存在具有较大作用。实施例2用包装的、载体膜上表达有CD86的慢病毒载体转导后增强的细胞刺激和扩增通过用编码CD54蛋白、CD86蛋白或二者的表达构建物转染293F细胞，以修饰293F细胞使其含有所述蛋白。在几个点用流式细胞仪检测被转染的细胞，以确定在细胞表面表达正确的蛋白。用抗-CD54-PE或抗-CD86-PE和碘化丙锭染色细胞以检测细胞活力。同种型对照抗鼠IgG1-PE和抗鼠IgG2a用来检测基线染色。为了评价细胞刺激和扩增，将冷冻的CD4+T细胞(分离自人血液成份部分清透产物，然后通过CD4+富集(采用Miltenyi设备)进行CD4T细胞纯化)培养在X-vivo15培养基中，该培养基含有5％人AB血清、50μg/ml庆大霉素、100U/mlIL-2和1.6mg/mLN-乙酰半胱氨酸(NAC)。以1×106细胞/毫升的浓度将细胞接种在以下三种条件之一中无添加、浓度为5mg/ml的抗-CD3抗体(OKT-3克隆)、或浓度为3珠/细胞的抗-CD3/CD28微珠。对于这三种条件的每一种，检测了无载体、对照载体或膜中含有CD54、CD86或同时含有这两种蛋白的对照载体。在第1天和第2天，温和重悬所有孔中的细胞以打碎任何细胞团块。第3天，洗涤细胞两次，并用库尔勒粒度仪计数和测量大小。第7天，再次计数细胞和测量大小，并分析绿色荧光蛋白(GFP，由所用的慢病毒载体表达的标记基因)的表达。同时还检测了活化标记CD25和CD69的表达，采用抗-CD25-PE或抗-CD69-PE和碘化丙锭，IgGK1-PE同种型对照作为基线染色。进行了两组试验。第一组使用上述293细胞系产生的载体。第二组使用用简单的瞬时共转染技术在细胞中产生的载体，没有事先建立细胞系。这些试验的扩增结果分别示于图2和3。相对于用正常(未修饰的)载体处理的细胞，表面表达CD86的慢病毒载体结合可溶性抗CD-3抗体处理的细胞显示出显著增强的生长。CD54没有显示出在增强或阻滞细胞生长中起作用。在用293F细胞系产生的载体或通过瞬时转染产生的载体处理的细胞之间，未观察到显著差异。相对于只表达CD54的293细胞，表达CD86和CD54的293细胞共培养物增强了CD4+T细胞上活化标记CD25和CD69的表达(示于图4&5)。这些结果支持一种发现，即暴露于表达CD86的细胞的细胞扩增增加是细胞活化的结果。最后，在第7天，对于上述293细胞系产生的载体和瞬时转染产生的载体，载体表面CD86的表达增强了GFP表达水平(图6和7)。虽然之前已证明CD54联合CD86可增加每细胞中载体插入的拷贝数，但这个试验中，与仅有CD86相比较，CD54未显示出对被载体转化的细胞的总百分数有影响。单独的CD86的存在将转导百分数从小于10％增加到约30％。所有这些数据非常有说服力地证明，在载体颗粒的表面中掺入刺激性配体确实能够增强细胞刺激和生长。本文引用的所有文献，包括专利、专利申请和出版物，不管之前是否具体纳入，均全文纳入本文作为参考。现在已充分描述了本发明，本领域一般技术人员将理解，可在广泛范围的等价参数、浓度和条件下实施本发明而不脱离本发明的精神和范围，并且不需要过多试验。虽然结合本发明具体实施方式描述了本发明，但应理解，可对本发明进行进一步改动。本发明包括总体上按照本发明原则的对本发明所进行的任何改动、使用或变动，包括不在本发明公开范围内但属于本发明所属领域已知或常规技术的任何改动、使用或变动，以及适于本文上述基本特征的任何改动、使用或变动。参考文献1.BarbeauB.，FortinJ-F.，GenoisN.，和TremblayMJ.通过新的基于荧光的合胞体定量检测测定的LFA-1的构象状态对人免疫缺陷型病毒I型-诱导的合胞体形成的调节(Modulationofhumanimmunodeficiencyvirustype1-inducedsyncitiumformationbytheconformationalstateofLFA-1determinedbyanewluciferase-basedsyncytiumquantitativeassay).J.Virol.72，7125-7136(1998)。2.CavalieriS.等.缺少TCR活化的情况下被慢病毒载体转导的人T淋巴细胞保持完整的免疫能力(HumanTlymphocytestransducedbylentiviralvectorsintheabsenceofTCR-activationmaintainanintactimmunecompetence).Blood102，497-505(2003)。3.ConeR.D.，和MulliganR.C.对哺乳动物细胞的高效基因转移产生具有广泛哺乳动物宿主范围的无辅助性重组逆转录病毒(High-efficiencygenetransferintomammaliancellsgenerationofhelper-freerecombinantretroviruswithbroadmammalianhostrange).Proc.Natl.Acad.Sci81，6349-6353(1984)。4.CostelloE.，MunozM.，BuettiE.，MeylanP.R.A.，DiggelmannH.&ThaliM.通过HIV-1衍生的慢病毒载体对刺激的和未刺激的T淋巴细胞进行基因转移(GenetransferintostimulatedandunstimulatedTlymphocytesbyHIV-1-derivedlentiviralvectors).GeneTher.7，596-604(2000)。5.EndresM.J.，JafferS.，HaggartyB.，TurnerJ.D.，DoranzB.J.，O′BrienPJ.，KolsonD.L.，&HoxieJ.A.用CD4-趋化因子受体准型靶向HIV-和SIV-感染的细胞(TargetingofHIV-andSIV-infectedcellsbyCD4-chemokinereceptorpseudotypes).Science2781462-1464(1997)。6.FollenziA.，AlliesL.E.，BakovicS.，GenuaN.&NaldiniL.慢病毒载体进行的基因转移受核易位限制，被HIV-1pol序列拯救(GenetransferbylentiviralvectorsislimitedbynucleartranslocationandrescuedbyHIV-1polsequences).Nat.Gen.25，217-222(2000)。7.GiguereJ.F.，PaquetteJ.S.，BounouS.，CantinR.&TremblayMJ.对病毒粒子锚定的宿主细胞膜蛋白功能性的新看法CD28与HIV1型的对比(Newinsightsintothefunctionalityofavirion-anchoredhostcellmembraneproteinCD28versusHIVtype1).J.Immunol.169，2762-2771(2002)。8.HumeauL.，在根据CD4计数和病毒负荷分组的各组HIV感染患者的淋巴细胞中，慢病毒载体介导的对HIV-1复制的有效控制(Efficientlentiviralvector-mediatedcontrolofHIV-1replicationinlymphocytesfromdiverseHIVinfectedpatientsgroupedaccordingtoCD4countandviralload).Mol.Ther.出版中(2004)。9.Levine，B.L.，Bernstein，W.B.，Connors，M.，Craighead，N.，Lindsten，T.，Thompson，CB.，和June，CH.缺少外源饲养细胞的情况下，CD28共刺激CD4+T细胞长期增殖的影响(EffectsofCD28costimulationonlong-termproliferationofCD4+Tcellsintheabsenceofexogenousfeedercells).J.Immunol.1595921-5930.(1997)。10.Levine，B.L.，Bernstein，W.B.，Aronson，N.E.，Schlienger，K.，Cotte，J.，Perfetto，S.，Humphries，M.J.，Ratto-Kim，S.，Birx，D.L.，Steffens，C，Landay，A.，Carroll，R.G.，和June，CH.共刺激的CD4+T细胞的过继性转移诱导HIV感染中的外围T细胞扩增并降低CCR5表达(AdoptivetransferofcostimulatedCD4+TcellsinducesexpansionofperipheralTcellsanddecreasedCCR5expressioninHIVinfection).Nat.Med.847-53.(2002)。11.LuX.，用于第一个临床慢病毒载体的安全的两质粒制备，采用一步法在初级细胞中达到＞99％的转导效率(Safetwo-plasmidproductionforthefirstclinicallentivirusvectorthatachieves＞99％transductioninprimarycellsusingaone-stepprotocol).J.GeneMed.6，963-973(2004)。12.ManganiniM.人免疫缺陷型病毒1型pol基因衍生的序列(cPPT/CTS)增加慢病毒载体对人非分裂单核细胞和T淋巴细胞的转导效率(Ahumanimmunodeficiencyvirustype1polgene-derivedsequence(cPPT/CTS)increasestheefficiencyoftransductionofhumannondividingmonocytesandTlymphocytesbylentiviralvectors).Hum.GeneTher.13，1793-1807(2002)。13.MauriceM.，VerhoeyenE.，SalmonP.，TronoD.，RussellSJ.&CossetFX.展示T细胞活化多肽的表面工程化慢病毒载体对人初级血液淋巴细胞的有效基因转移(Efficientgenetransferintohumanprimarybloodlymphocytesbysurface-engineeredlentiviralvectorsthatdisplayaTcell-activatingpeptide).Blood.99，2342-2350(2002)。14.MitsuyasuR.T.等.人免疫缺陷型病毒感染的对象中，在CD4ζ基因修饰的自体CD4+和CD8+T细胞过继性转移之后延长的存活和组织运输(ProlongedsurvivalandtissuetraffickingfollowingadoptivetransferofCD4ζgene-modifiedautologousCD4+andCD8+Tcellsinhumanimmunodeficiencyvirus-infectedsubjects).Blood.96，785-792(2000)。15.Naldini，L.，等.用慢病毒载体对非分裂细胞进行体内基因递送和稳定转导(InVivogenedeliveryandstabletransductionofnondividingcellsbyalentiviralvector).Science272，263-267(1996)。16.NaldiniL.等.用慢病毒载体注射的成年大鼠脑中转基因的有效转移、整合和持续长期表达(Efficienttransfer，integration，andsustainedlong-termexpressionofthetransgeneinadultratbrai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38.如权利要求23或24或25或26所述的方法，其特征在于，所述膜相关性非病毒配体是结合LFA-1、CD18、CD11b、CD11c、CD11d和CD43的微生物蛋白。39.如权利要求23或24或25或26所述的方法，其特征在于，所述靶细胞是造血干细胞。40.如权利要求23或24或25或26所述的方法，其特征在于，所述靶细胞是CD34+、CD33+、CD14+或表达结合素1的细胞。41.如权利要求23或24或25或26所述的方法，其特征在于，所述靶细胞是T细胞。42.如权利要求23或24或25或26所述的方法，其特征在于，所述靶细胞是淋巴结生发中心的B细胞或树突状细胞。43.如权利要求23或24或25或26所述的方法，其特征在于，所述靶细胞是成纤维细胞。44.一种逆转录病毒载体包装细胞，其包括内源性表达能够结合靶细胞或组织的细胞表面分子的至少一种膜相关性配体的细胞。45.如权利要求63所述的包装细胞，其特征在于，所述细胞在体内与所述靶细胞或组织相互作用。46.如权利要求64所述的包装细胞，其特征在于，所述细胞是骨髓基质细胞，所述靶细胞是造血干细胞。47.如权利要求63或64所述的包装细胞，其特征在于，所述配体是整合蛋白，所述靶细胞是CD34+细胞。48.如权利要求66所述的包装细胞，其特征在于，所述配体是SDF-1VLA-4、VLA-5或LFA-1，所述造血干细胞是CD34+和CD38-/CXCR4+，或CD34+和CD381o/CXCR4+。49.如权利要求63所述的细胞，其特征在于，所述细胞是逆转录病毒包装细胞，其特点为包含能够表达病毒配体的异源核酸分子，所述病毒配体结合靶细胞的细胞表面分子并任选地发挥作用以介导含有所述病毒配体的细胞膜与所述靶细胞融合。全文摘要本发明涉及一种增加靶细胞中载体转导的方法。本发明提供一种重组工程化的包装细胞系，其能够表达一种或多种有助于结合到靶细胞和靶细胞活化的膜蛋白。本发明还提供重组工程化的细胞，其内源性将一种或多种此类膜蛋白表达入包装细胞系。通过使用此类细胞系而包装入病毒颗粒中的载体将包含含有这些蛋白的外包膜。这些颗粒将特异性适用于结合和靶向靶细胞以促进该靶细胞被所述载体转导。靶细胞也可在不存在外源补充的刺激分子的情况下同时被包装的载体活化(刺激)。文档编号C12N5/10GK101072880SQ200580022623公开日2007年11月14日申请日期2005年6月30日优先权日2004年7月1日发明者L·休缪,V·斯德普西金,B·帕什克特,倪亚瑾申请人:VIRxSYS股份有限公司