关节炎型支原体精氨酸脱亚胺酶突变体及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种关节炎型支原体精氨酸脱亚胺酶突变体及其基因、聚乙二醇修饰物和应用。所述精氨酸脱亚胺酶突变体为由两氨基酸序列如序列表中SEQ?ID?No:2所示的蛋白质亚基构成的二聚体。本发明的精氨酸脱亚胺酶突变体在大肠杆菌中表达量增加，精氨酸脱亚胺酶的复性效率提高，酶活性不改变，适合产业化生产。精氨酸脱亚胺酶突变体的聚乙二醇修饰物可用于制备抗肿瘤（抗肝癌、白血病、黑色素瘤等）药物。
【专利说明】关节炎型支原体精氨酸脱亚胺酶突变体及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物活性蛋白质的药学领域，特别是一种关节炎型支原体精氨酸脱亚胺酶突变体及其基因、聚乙二醇修饰物和应用。
【背景技术】
[0002]人正常细胞依靠精氨酸琥珀酸合成酶能将瓜氨酸转变成精氨酸，因此精氨酸不是人体细胞中的一种必需氨基酸。肝癌细胞和某些其它癌细胞缺乏精氨酸琥珀酸合成酶，无法在细胞内合成精氨酸，必须依赖细胞外的精氨酸才能生存。因此，凡能耗竭这些癌细胞外精氨酸的酶，例如精氨酸脱亚胺酶(arginine deiminase),能将左旋精氨酸分解成瓜氨酸和氨，就能阻断这些癌细胞获得外源精氨酸的供给，将癌细胞饿死。
[0003]人基因组中不存在精氨酸脱亚胺酶基因。现已从支原体等多种微生物中分离到有抗癌作用的精氨酸脱亚胺酶，包括人型支原体(Mycoplasma hominis)、精氨酸型支原体(Mycoplasma arginini)和关节炎型支原体(Mycoplasma arthritidis)。David Filpula和王懋梁在美国专利US5804183公开了一种从ATCC14152株关节炎型支原体中克隆的精氨酸脱亚胺酶，与以往发现的关节炎型支原体精氨酸脱亚胺酶不同，每个亚单位含有2个半胱氨酸，等电点是5.35，尤其重要的是酶米氏常数Km值低至10.4μΜ，可有效分解血浆中高浓度精氨酸，现有的资料表明，这是到目前为止发现的最适合作为治疗药物的一种精氨酸脱亚胺酶。
[0004]用基因工程技术在大肠杆菌中表达的精氨酸脱亚胺酶均以包涵体的形式存在，呈不溶性，并缺乏酶活性。如同其它在大肠杆菌中表达的不溶性蛋白质一样，从包涵体中回收自然状态的精氨酸脱亚胺酶必须经过一种多肽蛋白再折叠过程。用6Μ盐酸胍溶解以包涵体形式存在的精氨酸脱亚胺酶，将变性的精氨酸脱亚胺酶在磷酸缓冲液中稀释100倍，在室温下经48小时复性成为有活性的精氨酸脱亚胺酶(参阅Satoru Misaw 等，High-level express1n of Mycoplasma arginine deiminase inEscherichia coli and its efficient renaturat1n as an ant1-tumor enzyme, J.0fB1technology36 (1994) 145-155)。然而,在生产精氨酸脱亚胺酶时,高倍数稀释复性过程的产业化是相当困难的。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的精氨酸脱亚胺酶很难产业化生产的缺陷，而提供一种适合产业化生产的精氨酸脱亚胺酶突变体及其聚乙二醇修饰物、基因和应用。
[0006]本发明依据关节炎型支原体的精氨酸脱亚胺酶氨基酸序列建模，设计多种可能影响来自关节炎型支原体包涵体蛋白复性的突变体，筛选发现提高精氨酸脱亚胺酶复性效率的突变体，制备其聚乙二醇修饰物，发现其应用潜力。
[0007]本发明提供的技术方案之一是:一种蛋白质亚基，所述蛋白质亚基的氣基酸序列如 SEQIDN0.2 所示。
[0008]本发明提供的技术方案之二是:一种分离的蛋白质，所述蛋白质具有精氨酸脱亚胺酶活性，为由两所述的蛋白质亚基构成的二聚体。
[0009]其中，来源于关节炎型支原体的精氨酸脱亚胺酶，其亚基氨基酸序列如SEQ IDN0.1所示，该酶亚基在251位的半胱氨酸被其他氨基酸替换，形成该酶的突变体，突变体蛋白亚基的氨基酸序列如SEQID N0.2所示。该突变体蛋白亚基在251位是丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸或缬氨酸，优选丝氨酸和苏氨酸。
[0010]其中，所述蛋白质亚基或蛋白质的制备方法为本领域的常规制备方法，如从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得，或者通过人工合成获得，或者从自然界中天然存在的蛋白质中分离获得。
[0011]本发明提供的技术方案之三是:一种分离的核酸，所述核酸是编码所述蛋白质亚基的核酸。
[0012]其中，所述的核酸是编码氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示的蛋白质的任何核酸，只要因密码子的简并性，其编码所得的蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0.2所示即可。优选的，所述的核酸的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。所述核酸的制备方法为本领域常规的制备方法，如通过基因克隆技术获得编码上述蛋白质亚基的核酸，或者通过人工全序列合成的方法得到编码上述蛋白质亚基的核酸，或者从自然界中提取天然存在的编码上述蛋白质亚基的核酸。
[0013]本发明提供的技术方案之四是:一种包含如权利要求3所述的核酸的重组表达载体。
[0014]其中所述重组表达载体可通过本领域的常规方法获得，如将编码上述蛋白质亚基的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成，所述的表达载体可以为本领域常规的各种载体。所述载体较佳地包括:各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，本发明所述载体优选地为质粒 pET-27b (+)。
[0015]本发明提供的技术方案之五是:一种包含所述重组表达载体的重组表达转化体。
[0016]其中所述重组表达转化体的制备方法为本领域常规，如将上述重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物可以为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制，使编码所述蛋白质亚基的基因能够被有效表达即可。其中所述宿主微生物较佳地为大肠杆菌(E.coli)或枯草杆菌，更佳地为大肠杆菌BL21。将前述重组表达质粒转化至E.coli BL21中，即得本发明优选的基因工程菌株。其中所述转化方法为本领域常规转化方法，较佳地为化学转化法，热激法或电转法。
[0017]本发明提供的技术方案之六是:一种重组精氨酸脱亚胺酶的制备方法，其包括如下步骤:培养所述的重组表达转化体，从培养物中获得重组精氨酸脱亚胺酶。
[0018]其中，所述的培养方法是常规方法。
[0019]较佳的，所述的从培养物中获得重组精氨酸脱亚胺酶包括以下步骤:
[0020]I)破碎菌体细胞后，分离出重组精氨酸脱亚胺酶包涵体；
[0021]2)将包涵体用盐酸胍变性，然后以1:10-1:40，优选1:20的比例稀释在磷酸缓冲液中复性32-60小时，优选48小时。
[0022]其中，步骤I)所述的破碎菌体细胞的方法是常规的，优选超声破碎法。所述的分离出重组精氨酸脱亚胺酶包涵体的方法是常规的，优选的是采用l-10%TritonX-100，在0-10° C，20-60分钟后，离心，去沉淀即得。所述的离心优选采用10000-15000g，15-60分钟，更优选13000g离心30分钟。
[0023]步骤2)所述的用盐酸胍变性的方法是常规方法，较佳的，将重组精氨酸脱亚胺酶包涵体，悬浮于含盐酸胍和二巯基苏糖醇(DTT)的Tris溶液中进行变性。优选的，所述的Tris溶液是含6M盐酸胍和1mM 二巯基苏糖醇的50mM Tris (pH8.5)溶液。所述的磷酸钠缓冲液优选1mM pH7.0的磷酸钠缓冲液。
[0024]较佳的,复性所得的产物还进一步用Q Sepharose F F离子交换层析柱纯化。
[0025]本发明提供的技术方案之七是:一种所述蛋白质的聚乙二醇修饰物。
[0026]其中，优选的，所述蛋白质的赖氨酸被聚乙二醇修饰。优选的，所述的聚乙二醇是的聚乙二醇5000-20000。优选的，所述的蛋白质的一个分子上修饰着被1-64个聚乙二醇分子。
[0027]本发明提供的技术方案之八是:所述的蛋白质的聚乙二醇修饰物在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0028]其中，所述的肿瘤是常规的，优选肝癌，恶性黑色素瘤或白血病。
[0029]在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
[0030]本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0031]本发明采用替换一个半胱氨酸基团，在保留精氨酸脱亚胺酶原有酶活性的同时，增加了精氨酸脱亚胺酶在大肠杆菌中的表达量，又提高精氨酸脱亚胺酶的复性效率，适合于重组精氨酸脱亚胺酶的产业化。
【专利附图】
【附图说明】
[0032]图1是精氨酸型支原体的精氨酸脱亚胺酶三维结构图，其中第251位半胱氨酸被其他氨基酸(丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸或缬氨酸)替换。
【具体实施方式】
[0033]本发明对关节炎型支原体精氨酸脱亚胺酶的第251位半胱氨酸进行突变，该突变未影响酶活性，反而提高了该重组精氨酸脱亚胺酶在大肠杆菌中表达的产量，提高了复性效率，适合产业化生产。
[0034]1.丝氨酸基团取代半胱氨酸基团C251
[0035]关节炎型支原体精氨酸脱亚胺酶是由相同的两个亚基构成的二聚体。本发明中所提到的编码精氨酸脱亚胺酶的基因或DNA分子，以及精氨酸脱亚胺酶蛋白质分子均指两个亚基中的一个。每个亚基多肽含有两个半胱氨酸基团，C251和C398。关节炎型支原体精氨酸脱亚胺酶的催化中心是一个由半胱氨酸基团C398，谷氨酸基团E213和组氨酸基团H269组成的三角形结构。本发明以美国专利US5804183公开的从ATCC14152株关节炎型支原体中克隆出的精氨酸脱亚胺酶的编码氨基酸序列为基础，用计算机软件模拟出关节炎型支原体精氨酸脱亚胺酶的三维结构，分别用丝氨酸基团取代C251或C398半胱氨酸基团。当半胱氨酸基团C251被取代时，精氨酸脱亚胺酶的三维结构不发生明显改变；而半胱氨酸基团C398被丝氨酸基团取代，则会破坏精氨酸脱亚胺酶催化中心。
[0036]进一步研究表明，其他氨基酸替代精氨酸脱亚胺酶的半胱氨酸基团C251获得突变体具有与丝氨酸类似效果，如苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和缬氨酸。优选丝氨酸和苏氨酸，最优选的是丝氨酸，见以下的实施例。
[0037]2.定向突变的精氨酸脱亚胺酶基因的重组表达
[0038]在关节炎型支原体精氨酸脱亚胺酶基因上用定向基因突变技术产生SEQIDN0.3所示的核苷酸序列。产生的精氨酸脱亚胺酶定向突变基因可在各种原核基因表达系统中表达。凡用于大肠杆菌中表达的染色体外载体，例如PET和pBAD，均可用于表达本发明的精氨酸脱亚胺酶基因。为可控地高效表达精氨酸脱亚胺酶，染色体外载体应当含有启动子、操纵子、核糖体结合部位、转录终点、复制起点、抗生素标记和可调控的抑制基因。启动子包括，但不限于，T7、araBAD、phoA、trc等。以T7启动子为优。诱导表达的方法包括,但不限于，改变培养液温度、加入阿拉伯糖、或加入异丙基-β -右旋硫代半乳糖苷(IPTG)等。以IPTG诱导乳糖操纵子的方法为优。为含有精氨酸脱亚胺酶基因的大肠杆菌，选用的抗生素标记包括，但不限于，氨苄青霉素、卡那霉素或四环素等。将含有精氨酸脱亚胺酶定向突变基因的质粒，转化感受态大肠杆菌BL21 (埃希氏大肠杆菌B系列834株，Escherichiacoli834strain)中表达。在发酵过程中，可调节大肠杆菌培养液的成分、温度、酸碱度、诱导因子的浓度和诱导时间等。当大肠杆菌培养液的光密度OD6tltl达到5-50时，加入表达诱导因子IPTGJ^ 0.5到50小时的诱导过程，从培养液中收获大肠杆菌细胞。
[0039]3.定向突变的精氨酸脱亚胺酶的聚乙二醇修饰
[0040]本发明的定向突变的精氨酸脱亚胺酶优选的采用聚乙二醇修饰。其中，聚乙二醇可通过多种活性基团修饰定向突变的精氨酸脱亚胺酶，以修饰赖氨酸的氨基(亲核基团)为最优。被聚乙二醇修饰后，精氨酸脱亚胺酶的分子体积变大，分子量增加，血浆半衰期延长，更重要的是在体内更稳定，不易被蛋白酶分解。每毫克蛋白质所具有的酶活性虽比修饰前减弱，只要给予同等量酶活性的聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚胺酶，则可补偿每毫克酶蛋白所减弱的活性。
[0041]本发明修饰用的聚乙二醇可以是直链的，支链的，或是多链的。本发明聚乙二醇的修饰可以是永久性的，也可以是短暂性的。每个定向突变的精氨酸脱亚胺酶二聚体优选的被1-64个聚乙二醇分子所修饰。聚乙二醇的分子量优选从1000到40000不等。关节炎型支原体精氨酸脱亚胺酶的分子量为46309道尔顿，在聚乙二醇修饰精氨酸脱亚胺酶反应过程中，聚乙二醇与精氨酸脱亚胺酶的摩尔比优选10:1至200:1。
[0042]4.聚乙二醇修饰优化的精氨酸脱亚胺酶应用
[0043]本发明所述的聚乙二醇修饰定向突变的精氨酸脱亚胺酶可用于制备抗肿瘤药物，所述的抗肿瘤药物包括，但不限于，抗肝癌药物、抗恶性黑色素瘤药物、抗前列腺癌药物等。所述的精氨酸脱亚胺酶的聚乙二醇修饰产物溶液以适当剂量可经皮下、肌肉、静脉等途径注射治疗。
[0044]下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
[0045]实施例1关节炎型支原体的精氨酸脱亚胺酶基因定向突变的设计
[0046]以美国专利US5804183从ATCC14152株关节炎型支原体(Mycoplasmaarthritidis)的精氨酸脱亚胺酶的编码核苷酸序列为基础，用PyMOL0.99rc6软件模拟关节炎型支原体中的精氨酸脱亚胺酶的三维结构(见图1)，可见半胱氨酸基团C251远离精氨酸脱亚胺酶的活性中心，用用其他氨基酸(丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸或缬氨酸)替代半胱氨酸基团C251，设计出10个突变体。三维结构分析表明，这些突变不会明显改变精氨酸脱亚胺酶的三维结构。
[0047]实施例2突变精氨酸脱亚胺酶基因的定向突变和重组表达
[0048]以美国专利US58 04183记载的从ATCC14152株关节炎型支原体的编码精氨酸脱亚胺酶的核苷酸序列为基础，根据大肠杆菌编码丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸和缬氨酸的不同密码子，设计突变的核苷酸序列，并以原酶序列及突变体序列委托基因公司合成核苷酸。
[0049]将原酶基因及定向突变产生的精氨酸脱亚胺酶基因插入到质粒pET_27b (+)的T7启动子之后。再转化感受态大肠杆菌BL21细胞(埃希氏大肠杆菌B系列834株，Escherichiacoli834strain)中。定向突变基因的DNA序列经核苷酸序列分析证实如SEQIDN0.3所示。
[0050]将野生型原酶或含定向突变产生的精氨酸脱亚胺酶基因质粒的BL21大肠杆菌，在10升发酵罐内37° C下发酵培养(5升培养基)。每升细菌培养液(LB培养基)中加入10毫克卡那霉素。当光密度0D_读数值达到20时，加入ImM异丙基-β-右旋硫代半乳糖苷(IPTG)，诱导表达16小时后收获大肠杆菌细胞。野生型原酶及不同突变株的包涵体量见下表一,可见突变体的表达量增加。
[0051]表一、野生型原酶不同突变体表达后获得包涵体量(g/5L)
[0052]
【权利要求】
1.一种蛋白质亚基，其特征在于，所述蛋白质亚基的氣基酸序列如SEQIDN0.2所不。
2.一种分离的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质具有精氨酸脱亚胺酶活性，所述蛋白质为由两如权利要求1所述的蛋白质亚基构成的二聚体。
3.一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸是编码如权利要求1所述蛋白质亚基的核酸。
4.一种包含如权利要求3所述的核酸的重组表达载体。
5.一种包含如权利要求4所述重组表达载体的重组表达转化体。
6.一种重组精氨酸脱亚胺酶的制备方法，其特征在于，其包括如下步骤:培养如权利要求5所述的重组表达转化体，从培养物中获得重组精氨酸脱亚胺酶。
7.—种如权利要求2所述蛋白质的聚乙二醇修饰物。
8.如权利要求7所述的蛋白质的聚乙二醇修饰物，其特征在于，所述蛋白质的赖氨酸被聚乙二醇修饰。
9.如权利要求7所述的蛋白质的聚乙二醇修饰物，其特征在于，所述的聚乙二醇是聚乙二醇 5000-20000。
10.如权利要求7所 述的蛋白质的聚乙二醇修饰物在制备抗肿瘤药物中的应用。
【文档编号】C12N9/78GK104130996SQ201310159336
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2013年5月3日 优先权日:2013年5月3日
【发明者】胡海峰, 李小灵, 刘 英 申请人:上海医药工业研究院, 中国医药工业研究总院