专利名称：纯化的益母草提取物在制备脑损伤的神经保护药物中的用途的制作方法
技术领域：
本发明属制药领域，涉及中药益母草提取物在制药中的新用途，具体涉及 纯化的益母草提取物HL (pHL)在制备脑损伤的神经保护药物中的用途，尤其是 纯化的益母草提取物在制备治疗大脑中动脉闭塞的脑保护药物中的用途。
技术背景现有技术公开了缺血性脑卒中是因为血流的减少或完全阻断导致局部血糖 和氧气供应不足而造成的。目前最有效的治疗方法是溶栓疗法，然而只有部分 脑卒中患者能够接受此疗法。因此，开发治疗窗宽，能防止多种神经化学反应 造成不可逆性脑损伤的的神经保护药物成为当务之急。在正常生理状态下，内源性抗氧化剂调控自由基水平。当抗氧化剂保护能 力与自由基水平失衡时就会出现氧化应激。大量研究证明，神经退行性疾病的 病理机制涉及氧化应激。脑缺血时，氧化自由基会通过多种途径破坏细胞的结 构和功能完整性，造成严重的细胞损伤甚至导致细胞死亡或凋亡。众所周知， 脑组织耗氧量高，抗氧化剂水平低，再生力差，对氧化损伤尤其敏感。近年来，天然产物对神经退行性疾病的治疗作用收到了广泛的关注。尤其 是有关具有增强内源性抗氧化剂活性，减少自由基生成，通过非酶手段中和自 由基作用的天然产物。有报导公开了银杏叶具有调控缺血区凋亡级联反应，治 疗持续性大脑中动脉闭塞的功效。根据中医理念，益母草对于调理月经、妇科分娩和活血祛瘀均有良效。有 研究报导益母草具有心肌保护作用，用于治疗高粘血症和心肌梗塞。最重要的 是，Liu等报导HL具有抗氧化活性。在体内试验中，用电子自旋共振(ESR)自 旋捕获技术检测，发现HL具有强大的超氧化物清除能力。通过科学的方法纯化HL原料药，主要含有木苏碱(C孔3N02)、槲皮素 (d孔A)、山柰酚(d孔。06)、益母草碱(C14H21N305)和5，7,4'-三羟(基)黄酮 (d晶。Oj。现有技术报导了纯化的益母草提取物HL (pHL)具有抗氧化活性，并 通过抗氧化作用保护缺血心肌。现在，pHL已经上市(Kardigen，活心珍)，被公认为是具有保护心脏，减少心血管疾病风险的补充剂。但迄今为止，尚未 有关纯化的HL (pHL)能防止多种神经化学反应造成不可逆性脑损伤的的神经保护药物的报道。与本发明相关的现有技术有Antonio, C.， Maria， C.P.， Mario, B.， Salvatore, P.， Roberta, C.， Tiziana， T., Angelo， D丄，2000. Antioxidant profile and early outcome in stroke patients. 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图1是各组大鼠的梗死体积，其中，a) TTC染色后的梗死区域；b)图像分析系统分析梗死体积(Scion image for windows),与脑卒中模型组相比，pHL治疗后梗死体积显著减小， *p<0.05脑卒中pHL治疗组vs.脑卒中模型组。图2是神经功能障碍评分，其中，评分越高，运动功能障碍越严重，脑卒中模型组大鼠神经功能障碍得 分最高，pHL治疗脑卒中大鼠在术后第7天神经功能障碍得分显著下降。 图3是pHL对抗氧化活性的影响，其中，a:各组血浆中总抗氧化剂浓度(mM)，假手术和脑卒中组的总抗氧 化剂浓度都增高；*p<0.05脑卒中模型组vs.假手术组；IWp<0.01脑卒中 pHL治疗组vs.脑卒中模型组；b: DNA氧化损伤水平，pHL治疗使脑卒中后DNA氧化损伤显著减轻，但不 改变健康状态下的基础氧化损伤水平；**p〈0.01脑卒中模型组vs.假手术 组；鼎p〈0. 01脑卒中pHL治疗组vs.脑卒中模型组。图4是MCAO 7天后大脑皮层细胞凋亡染色(20x物镜)，其中，切片在波长520i20nm下观察以检测绿色荧光；在波长460nm下观察检测DAPI染色；图像整合以检测细胞的整体形态；A)假手术组；b)假手术pHL治疗组；c)脑卒中模型组；d)脑卒中pHL治疗组。 图5是MCAO 7天后大脑皮层免疫组化染色(40x物镜)， 其中，促细胞凋亡蛋白(b) BAX和(c) FAS，抗凋亡蛋白(d) BCL-2和(e)BCL-XL， (a)阴性对照；染色结果表明，脑卒中后，促细胞凋亡蛋白的免疫反应增强，抗凋亡蛋白的免疫反应减弱；HL治疗后，抗凋亡蛋白的免疫反应加强，而促细胞凋亡蛋白的免疫反应减弱；从左起i)假手术组；ii)假手术pHL治疗组；iii)脑卒中模型组；iv)脑卒中pHL治疗组。具体实施方案 实施例1体内试验本发明的试验方案通过伦理协会认证，符合国际伦理标准。实验动物(购自 新加坡国立大学实验动物中心)。84只重220g 250g的Wistar大鼠在日间光照情况下笼养，给以充足的食物和 水。将大鼠随机分为四组假手术组[Sham]，假手术pHL治疗组(400mg/kg/day) [Sham + pHL]，脑卒中模型组[Vehicle]，脑卒中pHL治疗组(400mg/kg/day) [Sroke + pHL]。每天灌胃给药。手术前两周预给药，闭塞大鼠大脑中动脉 (MCAO)造成脑卒中。首先用氯胺酮/甲苯噻嗪混合物麻醉大鼠(0.1ml/100g i.p.)，分离出大脑中动脉，电烙阻断与大脑下静脉交叉处至靠近豆状核纹状体 分支源头处这段大脑中动脉分枝，确保完全永久性闭塞。缝合伤口 ，整个手术 过程中用电热毯维持大鼠体温在37±0.5° C。假手术组大鼠给以同样的操作， 但不造成MCAO。术后继续给药一周，处死采集样本。脑梗体积测量脑梗体积的测量采用TTC (2, 3， 5-triphenyltetrazolium chloride)染 色。脑组织被取出后，清除小脑和脑系膜。脑组织被切成8片2mra厚的薄片，浸至4%福尔马林溶液中。脑梗体积用影像分析系统分析(Scion image for windows),经水肿和萎縮矫正后转化为全脑半球中的真实缺血损伤梗死区域。结果显示，各组大鼠的梗死体积如图1所示。如预期的一样，假手术组和 假手术pHL治疗组没有脑损伤，因此没有梗死区域(Figure 2ai， ii)。而大 脑中动脉闭塞手术造成大鼠缺血损伤，左大脑皮层和纹状体皆出现梗死区域 (Figure 2aiii)。脑卒中pHL治疗后，梗死体积由20. 75 ± 0. 03%显著减小至 15.19 ± 0.02% (图lb)。神经功能障碍的评价采用神经功能障碍评分体系评分(Lu et al， 2005)，评估脑卒中损伤后的 神经功能缺损，评分范围从0-5,用来评价MCAO后动物的行为和运动变化。 固定大鼠尾部使其悬挂，如果大鼠行为正常，如前肢均伸向地面，则评为0 分。如果大鼠MCAO对侧的前肢在悬挂过程中始终保持屈曲，此外没有其他异 常行为，则评为1分。接下来，将大鼠放在地上，让它们自由行动。大鼠自发 向各方向运动，但当轻拉鼠尾时，沿着瘫痪一侧单向转圈，则评为2分。持续 自发沿MCA0对侧转圈的大鼠被评为3分。而那些身体虚弱，只有在刺激下才运 动的大鼠被评为4分。那些在评分当天死亡的大鼠被评为5分。得分高的大鼠 表现出得分低大鼠的所有症状。因此，得分越高，大鼠神经功能障碍越严重。结果如图2所示假手术组和假手术pHL治疗组大鼠没有神经功能障碍， 评分为0分；术后脑卒中模型组大鼠得分最高，与它们表现出最大的梗死体积 相一致；脑卒中pHL治疗组，MCAO后第一天神经功能障碍得分比模型组低 (2.22 vs. 2.43)，随着进一步治疗，神经功能障碍得分进一步下降，术后第七 天由2.22降至1.81 (图2). 总抗氧化剂含量分析采集血浆样本用于分析pHL对内源性抗氧化系统的影响。pHL对内源性抗 氧化系统的影响用总抗氧化剂检测试剂盒分析(W5WQ Calbiochem， Germany)。按照试剂盒说明书操作。试剂盒的原理是抗氧化剂抑制高铁肌红蛋 白氧化ABTST"底物为ABTS '+产物。因此样本中抗氧化剂的含量与检测到的ABTS '+含量成反比。ABTS '+的含量可以通过检测波长600nm的吸光度值检 测。结果显示，假手术组抗氧化剂浓度为0.38 ± 0.08mM (图3a).假手术 pHL治疗组的抗氧化剂浓度增加至0. 5 ± 0. 2mM ，(图3a)。脑卒中模型组， 抗氧化剂浓度显著减少至0. 31 ± 0. 03mM (图3a)。脑卒中pHL治疗组抗氧化 剂浓度恢复至0.42 ± 0.05mM，甚至比假手术组还略高(图3a)。GC/MS分析DNA氧化损伤采用苯酚-氯仿法从各组动物的血样中抽提DNA， DNA氧化加合物可以视 为氧化应激的标志。采用GC/MS (Agilent 6890气相色谱和Agilent MSD 5973)方法分析DNA样本。各样本中DNA氧化加合物量求和，算出DNA加合 物的平均值。结果如图3b所示，假手术组和假手术pHL治疗组的DNA氧化损伤水平几 乎一致，分别为0.98 ± 0. 05和1.08 ± 0. 06，可见pHL治疗不会改变基础 DNA氧化损伤水平。脑卒中模型组的DNA氧化损伤最严重(1.78 ± 0.03)，如 图3b所示。pHL治疗后，脑卒中造成的DNA氧化损伤水平显著下降至1.19 ± 0.03 (图3b)，和假手术组基本一致。TUNEL检测法治疗终期，用2%福尔马林灌流以固定动物组织，取脑组织，用2%福尔马 林继续固定两小时。15%蔗糖磷酸缓冲液浸泡过夜，30%蔗糖磷酸缓冲液浸泡脱 水。用Leica9 CM1510冰冻切片机(Leica显微系统，IL， USA)将脑组织制成厚 20 um的薄片。用DeadEnd 荧光TUNEL系统(Mi^" Promega， USA)试剂盒 检测细胞凋亡导致的核DNA断裂，并在荧光显微镜下观察。切片用Leic^荧光 显微镜观察并拍照(Leica显微系统，IL， USA)，观察波长520 ± 20nm的绿 色荧光和波长460nm的蓝色荧光。TUNEL染色可以指示凋亡细胞。TUNEL染色后，凋亡细胞核发出很强的绿色 荧光。结果显示，仅在左大脑皮层梗死区域检测到细胞凋亡，而在非梗死区、 假手术组大鼠(图4a)和假手术pHL治疗组大鼠(图4b)均未检测到凋亡细胞。脑卒中模型组细胞凋亡标记最多(图4c)。与该组的梗死体积最大，神经损伤最 严重一致。脑卒中pHL治疗组梗死区细胞凋亡标记显著减少(图4d)。免疫组化染色上述冰冻组织用于免疫组化染色(IHC)。用多克隆兔抗Bax抗体"c-4^ , Santa Cruz, CA, USA)，多克隆兔抗Fas抗体(sc-775"， Santa Cruz, CA, USA) 和多克隆兔抗Bel-xS/xL抗体(w6J《Santa Cruz, CA， USA)进行一抗孵 育。用优维显检测系统和HRP/DAB试剂盒(Lab Vision Corporation, CA, USA)进行抗体染色。用苏木精复染。切片在Leic^荧光显微镜下观察并拍照。所述的免疫组化染色用于细胞凋亡相关蛋白定位，阴性对照用于确保二抗 的特异性(图5a)。结果显示，假手术组和假手术pHL治疗组染色未发现促凋亡 蛋白BAX (图5b);反之，脑卒中模型组BAX信号最强(图5b);脑卒中pHL 治疗组BAX免疫反应较弱(图5b)，仅在梗死区有BAX阳性染色；FAS染色结 果与BAX相似(图5c) ; MCA0后，脑卒中模型组梗死区中促细胞凋亡蛋白BAX 和FAS显著增加，并且这些促细胞凋亡蛋白只在梗死区被检测到，证实缺血会 导致这些蛋白表达上调，而在非梗死区这些蛋白表达量低于检测水平；在假手术组和假手术pHL治疗组有最强的抗凋亡蛋白BCL-2和BCL-XL (图5d, e)阳性信号；在脑卒中模型组BCL-2阳性染色非常弱，而BCL-XL信号 则未检测到(图5); pHL治疗使脑卒中后BCL-2和BCL-XL的阳性表达恢复到 正常水平。本发明的实验结果采用平均值土 S.E.M表示；双尾学生t-检验分析组间差 异，当pOK05时，认为组间差异显著。实验结果证实了 pHL具有神经保护作用，尤其是缺血性脑卒中后的神经保 护作用。本发明中，pHL能减小梗死体积，改善MCAO后神经功能。此外，它还 增强内源性抗氧化能力，从而能对抗缺血损伤，减少DNA氧化损伤和细胞凋 亡。MCAO是广泛应用的局部脑缺血模型，MCAO造成的梗死与人大面积可致死 性缺血脑卒中造成的脑损伤相似(Miller, 1999)。左大脑中动脉向左大脑皮层 和纹状体供血，这一区域的损伤会导致运动、语言、吞咽功能障碍。本发明中，TTC染色结果证实了左MCAO会导致左大脑皮层和纹状体出现梗死区域。此 外，所采用的神经功能障碍评分体系评价表明，左MCAO会导致严重的运动功 能障碍，pHL治疗后，梗死体积显著减小，该结果表明与脑卒中模型组相比， pHL治疗使脑组织损伤减少。因此，pHL治疗后神经学障碍也相应的减轻。本发明结果表明MCAO后总抗氧化剂浓度显著下降。该结果与Antonio等 (2000)报导的结果一致。本发明采用pHL治疗后，健康和脑卒中状态下，血浆 抗氧化剂浓度均显著提高，表明无论是否发生氧化应激，pHL都具有增加内源 性抗氧化剂的能力，从而形成对抗脑卒中的保护屏障。本发明结果表明，MCAO后DNA氧化损伤增加，证明了自由基活力的增 强。相对的，脑卒中造成的DNA氧化损伤使内源性抗氧化活性下降。pHL治疗 脑卒中大鼠，不仅内源性抗氧化剂浓度提高，DNA氧化损伤也明显减轻。因此 证实，pHL在体内实验显示的治疗作用与其的抗氧化作用密切相关，即增强内 源性抗氧化活力，减轻氧化应激。本发明的TUNEL检测结果显示绿色荧光只在梗死区被检测到，表明细胞凋 亡只在受损区域出现。此外，脑卒中模型组大鼠显示出最强的核绿色荧光，与 其他检测结果一致。pHL治疗脑卒中后，核绿色荧光减少，与它减小梗死体 积、神经功能损伤和DNA氧化损伤的结果一致，TUNEL检测结果进一步证实了 pHL对大脑中动脉闭塞w'star大鼠的治疗作用。本发明的免疫组化染色结果表明促凋亡蛋白BAX和FAS只在MCAO后梗死 区域检测到，而在健康个体中检测不到。脑卒中模型组有最高的促凋亡蛋白表 达，与最强的核绿色荧光结果一致。证明了梗死区域促凋亡蛋白上调，导致严 重的细胞死亡和形态学显著变化。相反地，不论是假手术组还是假手术pHL治 疗组，抗凋亡蛋白BCL-XL和BCL-2在整个脑部都可检测到。脑卒中模型组抗 凋亡蛋白信号要弱一些。在脑卒中给药组，促凋亡蛋白免疫反应显著减少和抗 凋亡蛋白的信号显著加强。综上所述，具有抗氧化活性的pHL ，能够转化细胞 抗凋亡状态，具有调控细胞凋亡的作用。本发明的结果提示了用药学手段修复氧化损伤是提供脑卒中治疗的有效方法。
权利要求
1、纯化的益母草提取物在制备脑损伤的神经保护药物中的用途。
2、 纯化的益母草提取物在制备治疗大脑中动脉闭塞的脑保护药物中的用途。
3、 按权利要求1或2所述的用途，其特征是所述的纯化的益母草提取物含有木苏碱C7H13N02、 槲皮素C15H1()07、山柰酚CI5Hlfl06、 益母草碱C14H21N305和5, 7, 4'-三羟(基)黄酮C15H1()05。
4、 一种脑损伤的神经保护药物，其特征是含有有效治疗量的权利要求3所述的纯化的益母草提取物。
5、 一种治疗大脑中动脉闭塞的脑保护药物，其特征是含有有效治疗量的权利要求3所述的纯化的益母草提取物。
全文摘要
本发明属制药领域，涉及中药益母草提取物在制药中的新用途，具体涉及纯化的益母草提取物在制备脑损伤的神经保护药物中的用途，尤其是纯化的益母草提取物在制备治疗大脑中动脉闭塞的脑保护药物中的用途。所述的纯化的益母草提取物经动物实验，结果表明，施用纯化的益母草提取物后，脑梗体积显著下降，与对照组相比，神经功能障碍评分减小，血浆中总抗氧化剂浓度增加，DNA氧化损伤减少，并降低凋亡和促凋亡蛋白表达水平，同时增加抗凋亡蛋白含量。所述的纯化的益母草提取物可制备脑损伤的神经保护药物，能有效治疗脑卒中。
文档编号A61K36/533GK101596232SQ20091005441
公开日2009年12月9日 申请日期2009年7月3日 优先权日2009年7月3日
发明者朱依纯, 朱依谆 申请人:复旦大学