用于诊断或治疗脑损伤的方法

专利名称：用于诊断或治疗脑损伤的方法
技术领域：
本发明大体上涉及用于诊断或治疗损伤的方法。本发明方法可以同时诊断和治疗 损伤同时诊断和治疗。单独诊断和治疗个体中创伤性脑损伤(Traumatic brain injury), ^Ml 舌$zHIlT仓Il贞(multi-organ trauma)0
背景技术：
创伤性脑损伤(Traumatic brain injury，TBI)是工业化国家中45岁以下的人死 亡和残疾的首要原因(McAllister，1992)。在美国每年估计发生的150万例头部创伤(head traumas)中，50万可能需要住院，80，000导致某种形式的慢性残疾(Langlois等，2006)。 疾病控制中心(The Center for Disease Control，CDC)估计目前至少有530万美国人，或 约2%人口，由于TBI在每日生活活动上需要长期协助(Langlois et al.，2006)。此外，每 年用于TBI的总健康费用达到大约350亿美元(Max et al.，1991)。尽管这种损伤形式流 行和严重，但是仍然没有研发出有效的治疗。医生通常试图区分轻度创伤性脑损伤(MTBI)和TBI。MTBI通常由临床症状确 定，包括“任何时期观察到的或自我报告的短暂混乱(transient confusion)、定向障碍 (disorientation)或意识障碍(impaired consciousness)；任何时期观察到的或自我报 告的在损伤时间周围的记忆障碍(失忆症，amnesia)；观察到的例如-头部损伤后急性发作 的其它神经或神经心理功能障碍的迹象；在婴幼儿中头部损伤后易怒、嗜睡或呕吐；当损 伤后很快确定的、在较大的孩子和成人中的症状如头痛、头晕、烦躁、疲劳或注意力不集中 可以用来支持轻度TBI的诊断，但不能用来在意识丧失或意识改变不存在的情况下进行诊 断。任何时期观察到的或自我报告的意识丧失持续30分钟或更短时间。"(National Center for Injury Prevention and Control. Report to Congress on Mild Traumatic Brain Injury in the United States: Steps to Prevent a Serious Public Health Problem. Atlanta, GA: Centers for Disease Control and Prevention； 2003)。通常关于 TBI 白勺 症状包括无意识超过30分钟；创伤后失忆症持续时间超过24小时；和颅脑穿透损伤。同 上。认识到只要最初的创伤可以迅速诊断或者在中枢神经系统组织上的压力达到一 个预先选择的阈值之前逐渐紊乱的情况下，可以减少对与最初的创伤的生理反应有关的中 枢神经系统组织的二次伤害，临床神经学领域仍然非常失望。创伤的、缺血的和毒害神经的 化学创伤，与一般紊乱一起，都表示脑损害的可能。虽然对脑损害的这些原因的每一种的几种形式的诊断都是简单地通过临床响应测试和计算机断层扫描(CT)和磁共振成像(MRI) 测试，这些诊断有其局限性，因为光谱成像既费钱又费时，而无行为能力的个体的临床反应 测试是有限的数值，往往排除了细致入微的诊断。此外，由于现有诊断的局限性，当对象经 受导致他们神经系统疾病的压力的情况下，由于微妙的症状往往很快解决，对象往往没有 意识到损害已经发生或寻求治疗。对对象的神经系统疾病的这些轻度至中度激发的治疗的 缺乏可以有一个累积效应或接下来导致严重的脑损害事件，其在每种情况中都具有较差的 临床预后。为了克服与神经系统疾病的光谱和临床反应诊断有关的局限性，对于对象的分子 或细胞水平健康状况，存在增加的注意力至作为变化的内部指标的生物标志物的使用上。 因为生物标志物的检测使用从对象取得的样品，并检测那个样品中的生物标志物，样品通 常是脑脊髓液(cerebrospinal fluid)、血液或血浆，生物标志物检测拥有廉价、快速、客观 测量神经系统疾病的前景。随着神经系统疾病的迅速和客观指标的获得，允许具有一定客 观程度地规模化确定非正常脑部疾病的严重程度，预测结果，指导疾病的治疗，以及监测对 象反应和恢复。此外，从许多对象获得的这些信息允许获得一定的对脑损伤机制的洞悉程 度。中枢神经系统(central nervous system，CNS)损伤的生物标志物可以提供 给医生和实验室研究可量化的神经化学标志物，以帮助不仅确定损伤的严重程度和细 胞病理学，而且提供了治疗干预的替代标志物。虽然已经提出了许多用于创伤性脑损 伤的潜在生化标志物(Pineda et al.，2007年)，数项研究都集中在将α II-血影蛋白 (α Il-spectrin)蛋白水解的降解产物作为啮齿类(Pike et al. ,2004 ；Ringger et al.， 2004年)和人类(Pineda et al.，2007)CNS损伤的生物标志物。许多生物标志物已确定为 与经常在车辆碰撞和冲突中受伤的对象中看到的严重的创伤性脑损伤相关。这些生物标志 物包括血影蛋白降解产物例如SBDP150、SBDP150i, SBDP145 (钙蛋白酶介导的急性神经细 胞坏死)、SBDP120 (半胱天冬酶介导的迟发性神经细胞凋亡)、UCH-Ll (神经细胞体损害标 志物)和MAP - 2树突状细胞损伤相关标志物。这些生物标志物的性质详细描述在美国专 利US7, 291，710和US7, 396，654中，其内容在此通过参考纳入。如果对理论或模型没有限制，提出的MTBI和TBI的划界是损伤后在生物液体中 的分子标志物的可识别的增加或减少。分子标志物的说明性的例子包括Kobeissy冊，et al. , MoI Cell Proteomics, 2006; 5 1887-1898所描述的那些标志物。提出的TBI的定 义是实验TBI (带有在1. 6mm凹陷深度大脑皮层可控碰撞的大鼠大脑皮层可控碰撞，相当于 人类严重TBI) 48小时后，在皮层组织中存在至少两倍增加或减少水平的至少一种可识别 的分子标志物。α II-血影蛋白(α Il-spectrin)的降解产物(SBDP)是TBI的潜在蛋白生物标志 物。α II-血影蛋白主要富集在大脑中，位于神经元内而不是神经胶质中。此外，α II-血 影蛋白显示位于神经轴突中(Czogalla and Sikorski, 2005 ；Riederer et al.，1986)。 α II-血影蛋白由两个半胱氨酸蛋白酶钙蛋白酶(calpain)和半胱天冬酶(caspase)酶 切。钙蛋白酶，在休眠细胞中静态存在，响应细胞外钙的显著升高而诱导至过度激活状态， 伴随TBI(Fineman et al.，1993)。这种酶将α II-血影蛋白切割为150和145 kDa片段。 钙蛋白酶的蛋白水解主要与胀亡坏死有关(Kampfl et al. , 1997 ；Liu et al. ,2004 ；Wang,2002)。半胱天冬酶，其激活与细胞凋亡有关，将血影蛋白切割为不同的150和120 kDa片段 (Pike et al. ,2001 ；ffang,2000)o这种差别切割不仅允许血影蛋白切割酶响应损伤的CNS 特异的过度激活的指示，而且允许作为损伤病理的促成因素的坏死和/或凋亡的相对重要 性的评估。因此，这些SBDPs可以考虑作为用于TBI的生物标志物(Wang et al. , 2005)。研究TBI病理的兴奋毒性机制的先前研究集中在神经递质谷氨酸盐上。然而， 相当多的证据表明乙酰胆碱相关的毒性在CNS病理中也同样非常重要。与脑创伤相关的 乙酰胆碱(ACh)水平的增加已经在50年前在实验室及临床环境进行了记录(Bornstein， 1946 ；Sachs, 1957)。注意到相对更高的神经递质水平与损害的增加的严重性相关(Tower and McEachern，1949)。除了通过使用类胆碱(cholinomimetics)导致毒蕈碱胆碱能受体 (muscarinic cholinergic receptor) WSι^/Κ5FWiw^tiM(Olney et al. , 1983 ； Turski et al.，1983)外，最近的研究还证实实验 TBI (Gorman et al.，1989; Lyeth et al. , 1993a)和缺血(Kumagae and Matsu，1991)后脑脊髓液(CSF)中升高的乙酰胆碱。几 项研究还证实毒蕈碱拮抗剂的紧急施用改善实验TBI后的行为恢复(Lyeth et al. , 1988a ； Lyeth et al. ,1988b ；Lyeth and Hayes,1992 ；Lyeth et al.,1993b ；Robinson et al., 1990)。虽然已经提出了几个潜在的标志物，没有明确的标志物或方法表明能够诊断和区 分MTBI和TBI或证明治疗施用的成功或治疗优势。如果个体还受到多器官损伤，这个缺陷 更加明显。此外，脑损伤通常难以有效治疗，成功的结果通常取决于个体如何被迅速地诊断 出特定的损伤亚型。因此，存在需要用于TBI的具有评价冲击后颅内病理诊断能力的敏感 和特异的生化标志物，以改善病人管理和促进治疗评价。

发明内容
提供了一种用于诊断和治疗对象中神经系统疾病的发明方法，包括分析对象的生 物样品以检测一个或更多生物标志物的存在；基于样品中一个或更多生物标志物的比例诊 断神经系统疾病；和对对象施用治疗物以改变一个或更多生物标志物的比例。本发明诊断 许多神经系统疾病例如脑损伤或多器官损伤。优选地，本发明方法在诊断冲击脑损伤、缺血 性中风和多器官损伤中是有用的。一个或更多生物标志物用在本发明中，说明性地包括α-II血影蛋白；血影蛋白 降解产物；ΜΑΡ2 ；神经元退化；泛素羧基末端酯酶；泛素羧基末端水解酶；位于神经元的细 胞内蛋白；MAP-taU;C-taU;聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP);脑衰蛋白反应调停蛋白；其降 解产物；其衍生物，和它们的组合。在优选的具体实施例中，生物标志物是泛素羧基末端水 解酶、血影蛋白降解产物或MAP2。本发明方法检测生物标志物相对于相同的蛋白标志物或不同的蛋白标志物的已 知或测定的基底水平的比例。严重损伤与轻度损伤区分开，因为严重损伤显示相相对于基 底水平2倍或更多生物标志物的比例，而轻度损伤显示相对于基底水平小于2倍生物标志 物的比例。可选地，如果生物标志物与基底水平的比例小于0.5，区分出损伤的严重性。许多治疗物在这里是可操作的。优选地，治疗物是毒蕈碱受体激动剂(muscarinic receptor agonist)。治疗物的说明性的例子包括双环胺(dicyclomine)，东莨菪碱 (scoplamine)，米拉美林(milameline)，N -甲基-4 -哌啶二苯乙醇酸盐或酯NMP(N_me
7thy 1-4-piperidinylbenzilate NMP)；匹鲁卡品(pilocarpine),喊仓西平(pirenzepine)， 乙酰胆碱(acetylcholine),乙酰甲胆碱(methacholine)，卡巴胆碱(carbachol)，乌拉 II MCbethanechol), # M M (muscarine), M^itMMMM ^ (oxotremorine Μ), M^itM 颤素(oxotremorine)，毒胡萝卜素(thapsigargin)，钙通道阻滞剂或激动剂(calcium channel blockers or agonists), M 古 丁，占 i若美 #(xanomeline), BuTAC, M M 5F (clozapine),奥氮平(olanzapine),西维美林(cevimeline),醋克立定(aceclidine),模 榔碱(arecoline)，托特罗定(tolterodine)，羟双环凡林(rociverine)，IQNP，吲哚生物碱 (indole alkaloids),^ΕΦ(himbacine), cyclostellettamines,^tj^lJ^llif^MIJ 以及它们的组合。生物样品优选脑脊髓液(cerebrospinal fluid)或血清。还提供了用于区分对象中神经损伤程度的组合物。一种发明组合物说明性地包括 从怀疑具有损害的神经细胞的对象分离的生物样品，生物样品在从对象分离之前是一种与 对象的神经系统连通的液体；和至少两个增加的抗体，其特异地、独立地结合至选自α-II 血影蛋白、α -II血影蛋白降解产物(SBDP)、泛素羧基末端水解酶和ΜΑΡ2蛋白的至少两个 生物标志物。本发明组合物的对象可选的是哺乳动物。优选地，对象是人。本发明组合物可选地包括生物标志物固定其上的基体。本发明组合物可选地包括 至少一个可检测的标记，其可选地偶联至至少两个抗体。标记优选地偶联至特异结合至少 两个抗体的物质。还提供了用于分析对象中细胞损害的试剂盒。一种发明试剂盒说明性地包括用于 连接从怀疑具有损害的神经细胞的对象分离的生物样品中的生物标志物的基体，生物样品 在从对象分离之前是一种与对象的神经系统连通的液体；至少两个抗体，其特异地、独立地 结合至选自α-ΙΙ血影蛋白、α-ΙΙ血影蛋白降解产物(SBDP )、泛素羧基末端水解酶和ΜΑΡ2 蛋白的至少两个生物标志物；和用于将抗体与生物样品或一部分生物样品反应以检测生物 样品中标志物的存在或量的操作指南。本发明试剂盒的对象可选的是哺乳动物。优选地，对象是人。本发明试剂盒可选地包括至少一个可检测的标记，其可选地偶联至至少两个抗 体。标记优选地偶联至特异结合至少两个抗体的物质。提供了一种用于诊断对象中神经系统疾病的方法。本发明方法包括第一次测量从 对象获得的生物样品中泛素羧基末端水解酶的量和至少一个另外的神经活性生物标志物 的量；和将泛素羧基末端水解酶的量和至少一个另外的神经活性生物标志物的量与泛素羧 基末端水解酶和至少一个另外的神经活性生物标志物的基底水平进行比较从而诊断对象 的神经系统疾病。本发明方法的测量优选地通过免疫测定。优选地，样品是脑脊髓液或血清。一个 另外的神经活性生物标志物优选地是血影蛋白降解产物、MAP - 2、SBDP 150、SBDP 145或 SBDP 120，或神经胶质纤维酸性蛋白。本发明方法可选地包括第二次测量泛素羧基末端水解酶的第二量和至少一个另 外的神经活性生物标志物的第二量，以产生泛素羧基末端水解酶和至少一个另外的神经活 性生物标志物的动力学曲线。可选地，本发明过程还包括比较对象中和与对象相同性别的其它个体中正常水平之间泛素羧基末端水解酶的量和至少一个另外的神经活性生物标志 物的量。还提供了一种用于诊断和治疗对象中多器官损伤的方法。本发明方法包括分析来 自对象的生物样品以检测多个生物标志物；基于所述生物样品中所述多个生物标志物的第 一比例确定第一器官损伤的第一亚型；基于所述生物样品中所述多个生物标志物的第二比 例确定第二器官损伤的第二亚型；施用至少一治疗拮抗剂，其有效抑制响应第一器官损伤 的所述第一亚型释放的蛋白的活性，或者至少一治疗激动剂，其有效促进响应第一器官损 伤的所述第一亚型释放的蛋白的活性；和施用至少一治疗拮抗剂，其有效抑制响应第二器 官损伤的所述第二亚型释放的蛋白的活性，或者至少一治疗激动剂，其有效促进响应第二 器官损伤的所述第二亚型释放的蛋白的活性。本发明方法的蛋白可选地是半胱天冬酶或钙蛋白酶。优选地，蛋白是半胱天冬 酶-3(CapaSe-3)。优选地，多个生物标志物是与所述第一和所述第二器官的至少之一的损 伤相关的细胞降解产物。本发明方法中的损伤优选地是冲击损伤或中风。治疗物优选地是双环胺。还提供了一种用于诊断和治疗对象中创伤性脑损伤的方法，包括分析对象组织或 液体以检测一个或更多血影蛋白降解产物和施用双环胺。较佳地，创伤性脑损伤是中风。更 佳地，损伤是缺血性中风。可选地，损伤是冲击脑损伤。


图1表示CCI后在大鼠CSF中UCHLl的定量western杂交； 图2表示MCAO后在大鼠CSF中UCHLl的定量western杂交；
图3表示在假损伤处理和CCI处理对象的CSF中UCHLl的水平；
图4表示假损伤处理、轻度MACO激发和严重MACO激发后在CSF中UCHLl的水平；
图5表示在假损伤处理或CCI后在不同时间点血清中UCHLl的水平；
图6表示假损伤处理、轻度MACO激发和严重MACO激发后血清中UCHLl的水平；
图7表示假损伤处理、轻度MACO激发和严重MACO激发后CSF和血清中SBDP 145的水
平；
图8表示假损伤处理、轻度MACO激发和严重MACO激发后CSF和血清中SBDP 120的水
平；
图9表示假损伤处理、轻度MACO激发和严重MACO激发后CSF和血清中MAP2的水平； 图10表示CCI后双环胺对CSF中SBDPs的效果；
图11表示CCI后在双环胺存在或不存在情况下在神经元细胞中的细胞死亡。
具体实施例方式本发明在诊断和处理异常的神经系统疾病中具有用处。具体来说，该发明在使用 诊断程序对疾病或损伤亚型，特别是创伤性脑损伤(TBI)亚型，单独或与多器官损伤一起进 行分类，并确定对于对象经受的特定的创伤性脑损伤亚型有效的潜在治疗物中具有用处。 本发明和在这里使用的定义为诊断治疗TBI方法。本诊断治疗方法涉及分析细胞蛋白酶或它们的组合的过度激活或激活不足，以确认脑损伤说明性地包括MTBI和TBI的亚型。示例性的蛋白或蛋白的组合包括钙蛋白酶；泛 素羧基末端酯酶例如Ll (UCHLl)；导致血影蛋白降解产物如SBDP150、SBDP145和SBDP120 的其它蛋白酶；位于神经元的细胞内蛋白MAP-tau ；C-tau ；MAP2 ；聚(ADP-核糖)聚合酶 (PARP)；脑衰蛋白反应调停蛋白2 (CRMP-2)；和半胱天冬酶如半胱天冬酶_3等等。脑损伤发生经历损伤诱导、造成损害和临床结果的严重变化。确定能够区分损伤 严重性的分子标志物对于确定选择用于促进最大恢复的治疗物或治疗的类型和迫切性是 必要的。几个潜在的标志物此前已提出包括乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase)、胶质纤 维酸性蛋白、烯醇酶(enolase)和S-100B。这些标志物没有一个单独具有足够特异性或鲁 棒性从而在临床上取得成功。通过阐明物理或化学应力后响应脑细胞的生化启动或抑制信号，可以阐明一系列 预期有效的化合物的一个或更多的有效性。通过实例的方式，钙激活胞质蛋白酶钙蛋白酶 已知在细胞坏死损伤之前激活，而半胱天冬酶已知在细胞凋亡损伤前激活，并牵连到降解 脑细胞的关键结构蛋白，导致作为TBI级联的一部分的组织自身消化。可理解，除了蛋白酶，通过蛋白酶在暴露于TBI的组织上的作用产生的降解产物 (breakdown products，BDP)在鉴定TBI的亚型中作为标志物也是有效的。有了这个诊断 信息，然后可以施用响应TBI而改变生化浓度的特定蛋白酶或其它化合物的激动剂或拮抗 剂。在钙蛋白酶和半胱天冬酶_3的TBI级联的情况下，TBI后钙蛋白酶和半胱天冬酶抑制 剂的施用对与TBI相关的急性和迟发性脑细胞损伤或死亡提供神经保护。蛋白酶活性可选地通过利用调节发生在所期望的蛋白活动上游的细胞活动从而 控制、监测或以其它方式改变蛋白的表达水平或活性来进行调节。例如，Ml毒蕈碱受体激 活的调节被认为具有许多的下游细胞影响。这些影响被认为是来自受体配体结合后与β Y 亚基复合物分离的Ml毒蕈碱受体G蛋白的α Λι亚基。α亚基激活磷脂酶(Xphospholipase C, PLC),使得磷脂酰肌醇 4，5 二 磷酸(phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate， PIP2)水解成 1，4，5 三磷酸肌醇(inositol 1，4，5 trisphosphate, IP3)和甘油二酯 (diacylglycerol,DG)0 IP3刺激细胞内储存钙离子的释放。DAG激活磷酸化许多蛋白包括 离子通道和NMDA受体复合物的PKC。B y G蛋白亚基抑制蕈毒碱(Ikgo)和钙调节(IK(Ca)) 的钾流，其通过增大去极化增加细胞兴奋性(Lyeth，2001)。几项研究提供了令人信服的证 据表明PIP2的信号转导通路在TBI后激活。Wei和其同事(Wei et al.，1982)首次报道 在猫中液压冲击TBI后立即PLC激活。后来的在大鼠侧向液压冲击模型中的研究发现在损 伤5分钟后在同侧海马中IP3水平升高，在同侧皮层长达20分钟(Prasad et al.，1994)。 随后的研究测量了在大鼠中液压冲击TBI后膜PIP2的磷酸二酯的降解，发现当DG升高时 组织PIP2W浓度显著减少(Dhillon et al.，1995)。后来的研究毒蕈碱受体与PLC信号转 导通路的TBI诱导激活之间的联系的研究发现损伤时用东莨菪碱进行毒蕈碱受体的药理 阻断显著减弱PIP2S生脂肪酸的急剧减少(Lyeth et al.，1996)。因此，Ml受体的激活与 增强的兴奋性调节相关，尽管细胞内钙离子升高、NMDA受体敏感性扩大和增加的神经元的 兴奋性。为了本主题发明的目的，脑损伤分为两级，轻度创伤性脑损伤(mild traumatic brain injury, MTBI)和创伤性脑损伤(traumatic brain injury，TBI)。TBI 定义为与分 子标志物水平或活性2倍增加或大于2倍减少或更大相关联的损伤。MTBI定义为与分子标
10志物水平或活性小于2倍增加或2倍减少相关联的损伤。如在这里所使用的，损伤是在细胞或分子完整性、活性、水平、鲁棒性、状态的改 变，或其它可追溯至一个事件的改变。损伤说明性地包括物理的、机械的、化学的、生物的、 功能的、感染的或其它的细胞或分子特性的调节物。事件说明性的是，物理创伤例如碰撞 (冲击)或生物异常例如血管闭塞或渗漏造成的中风。事件可选的是由感染源导致的感染。 本领域技术人员知道由术语损伤或事件包含的许多相当的事件。损伤可选的是物理事件例如冲击碰撞。碰撞是类似冲击损伤，例如击打头部，从而 要么颅骨结构完整，要么导致其破裂。实验上，使用的几种碰撞方法说明性地包括在1.6mm 凹陷深度的可控的皮层碰撞(controlled cortical impact，CCI)，相当于人类的严重TBI。 这种方法由 Cox, CD, et al. , J Neurotrauma, 2008; 25(11) 1355-65 所详细描述。可 理解，其它产生碰撞创伤的实验方法同样是可操作的。TBI也可以来自中风。缺血性中风可选地通过在啮齿类动物中大脑中动脉闭塞 (middle cerebral artery occlusion，MCA0)进行模型制作。UCHLl蛋白水平，例如，在轻度 MACO后增加了，其在严重MACO激发后进一步增加。轻度MACO激发可以导致蛋白水平在两 小时内瞬时增加，在24小时内回至对照水平。与此相反，严重MACO激发导致蛋白水平在损 伤后两小时内增加，可能是更加持久的，统计学上表明显著水平达到72小时或更长时间。分子标记物可选地称为生物标志物，在这里交替使用。生物标志物是测量生物 活性或反应有用的细胞、蛋白、核酸、类固醇、脂肪酸、代谢物或其它区分物。在这里可操 作以区分MTBI和TBI的生物标志物说明性地包括泛素羧基末端酯酶，泛素羧基末端 水解酶，血影蛋白降解产物，位于神经元的细胞内蛋白，MAP-tau, C-tau，MAP2，聚(ADP -核糖)聚合酶(PARP)，脑衰蛋白响应调停蛋白，UCHL1，膜联蛋白All (Annexin All), 酸脱氢酶家族 7 (Aldehyde dehydrogenase family 7)，丝切蛋白 1 (Cofilin 1)，前 纤维蛋白 1 (Profilin 1), http://www. mcponline. org/cgi/external_ref access_ num=XP_227366&link_type=GENa -烯醇酶(非神经烯醇酶(non-neural enolase))，烯醇 酶1蛋白，三磷酸甘油醛脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase),己糖激 酶 1 (Hexokinase 1)，顺乌头酸酶 2 (Aconitase 2)，线粒体(mitochondrial )，乙酰辅酶 A 合成酶 2 (Acetyl-CoA synthetase 2)，神经元蛋白 22 (Neuronal protein 22)，磷酸甘 油酸酉旨激酶2 (Phosphoglycerate kinase 2)，磷酸甘油酸酉旨激酶1 (Phosphoglycerate kinase 1), Hsc70_psl,谷氨酸脱氧酶(Glutamate dehydrogenase),酸缩酶 A (Aldolase A)，醛缩酶 C (Aldolase C)，果糖 二磷酸(fructose-biphosphate)，二 甲基精氨酸二 甲氨水解酶 2 (Dimethylarginine dimethylaminohydrolase 1)，微管相关蛋白 2 (Microtubule-associated protein 2)，碳酸 ff (Carbonic anhydrase), ADP W ^ 化因子3 (ADP-ribosylation factor 3)，转铁蛋白(Transferrin)，肝再生相关蛋白 (Liver regeneration-related protein)，血红蛋白 α (Hemoglobin α—chain)，血红 蛋白β链(Hemoglobin β chain)，肝再生相关蛋白，胎球蛋白β (Fetuin β)，3_含氧 酸辅酶 A 转移酶(3-0xoacid-CoA transferase),苹果酸脱氧酶(Malate dehydrogenase 1)，NAD (可溶的)，乳酸脱氢酶B (Lactate dehydrogenase B)，苹果酸脱氢酶，线粒体，羧 酸酯酶El前体(Carboxylesterase El precursor)，丝氨酸蛋白酶抑制剂α 1 (Serine protease inhibitor α 1)，结合珠蛋白(Haptoglobin)，泛素羧基末端水解酶Li，丝氨
11酸蛋白酶抑制剂2a，T型激肽原(T-kininogen)，α 1主要急性期蛋白(α 1 major acute phase protein), http://www.mcponline. orR/cRi/external ref access num=XP AAH85359&link type=GEN 白蛋白(Albumin), http://www. mcponl ine. org/cgi/external_ ref access_num=NP_001009628&link_type=GENa 1 主要急性期蛋白前肽(pr印印tide)， Murinoglobulin 1 类似物，特殊基团成分蛋白(Group-specific component protein),鸟 苷二磷酸解离抑制因子 1 (Guanosine diphosphate dissociation inhibitor 1)，脑衰蛋 白响应调停蛋白2，Murinoglobulin 1类似物，亚铁氧化酶(Ferroxidase)，血浆铜蓝蛋白 (Ceruloplasmin)，血影蛋白α链，脑，C反应蛋白(C-reactive protein)，大脑肌酸激酶 (Brain creatine kinase),蛋白体亚基(Proteasome subunit), α type7，14—3—3 蛋白， 突触结合蛋白(Synaptotagmin)，其亚型，其片段，其降解产物，或其组合。其它潜在的生物 标志物说明性地包括 Kobeissy, FH, et al, Molecular & Cellular Proteomics, 2006; 5:1887-1898确定的那些标志物，其内容在这里通过参考并入，或其它现有技术中已知的生 物标志物。优选地，生物标志物是有选择性的用于检测或诊断神经系统疾病例如脑损伤等。 更优选地，生物标志物是既特异性的又有效的用于检测和区分TBI级别。这种生物标志物 可选地称为神经活性生物标志物。在优选的具体实施例中，在这里可操作的生物标志物说 明性的是血影蛋白降解产物(SBDP) SBDP 150, SBDP 150i, SBDP 145 (钙蛋白酶介导的急性 神经细胞坏死)，SBDP120 (半胱天冬酶介导的迟发性神经细胞凋亡)，UCHLl (神经元细胞体 损害标志物)，胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和MAP - 2树突状细胞损伤相关标志物。可理解，生物标志物存在或活性的时间性质作为TBI亚型的指标或区分物是可操 作的。在非限制性的实例中，实验的大脑中动脉闭塞(MCAO)的严重性与CSF中UCHLl的短 暂保持相关联。30分钟的MCAO产生短暂的UCHLl水平，6小时达到高峰，然后迅速下降，而 2小时的MCAO产生持续多达三天的UCHLl水平。同样的，损伤后在不同时间点的其它生物 标志物的流行去区分TBI亚型是可操作的。生物标志物分析优选使用生物样品或液体进行。在这里可操作的生物样品说明性 地包括细胞、组织、脑脊髓液(CSF)、人工CSF、全血、血清、血浆、细胞内液体、尿液、粪便、胃 液、消化液、唾液、鼻腔或其它呼吸道液体、阴道分泌物、精液、缓冲生理盐水、生理盐水、水 或本领域认可的其它生物液体。除了增加的细胞表达，生物标志物也出现在与受损细胞流通的生物液体中。从对 象获得生物液体例如脑脊髓液(CSF)、血液、血浆、血清、唾液和尿液通常比获得固体组织活 体检视样品具有更少的侵害性和痛苦。因此，是生物液体的样品优选用在本发明中。尤其， CSF优选用于检测对象中神经损害，因为它是直接接触神经系统并且是很容易获得的。可理 解，血清是优选的生物样品，因为它是更容易得到的，并显示出对供体对象更少的进一步损 伤或副作用的风险。生物样品优选从一个过更多对象获得。生物样品通过常规技术从对象获得。例 如，CSF通过腰椎穿刺(lumbar puncture)获得。血液通过静脉穿刺(venipuncture)获 得，而血浆及血清通过根据已知方法分离全血获得。用于获得固体组织样品的外科手术 是本领域众所周知的。例如，用于获得神经系统组织样品的方法由描述在标准的神经 外科教科书例如神经外科文集颅骨和血管程序的基本方法(Atlas of Neurosurgery:Basic Approaches to Cranial and Vascular Procedures, by F. Meyer, Churchill Livingstone, 1999)；脑肿瘤的立体定位与图像定向外科手术第1版(Stereotactic and Image Directed Surgery of Brain Tumors, 1st ed. , by David G. T. Thomas, WB Saunders Co. , 1993)；和颅骨显微外科手术方法与技巧(Cranial Microsurgery: Approaches and Techniques, by L. N. Sekhar and E. De Oliveira, 1st ed. , Thieme Medical Publishing, 1999)中。用于获取和分析脑组织的方法还描述在Belay et al.， Arch. Neurol. 58: 1673-1678 (2001)；和 Sei jo et al. , J. Clin. Microbiol. 38: 3892-3895 (2000)中。创伤后，神经细胞与没有经受创伤的这种细胞相比在体外培养基中或在对象中 在原位表达出改变的水平或活性。因此，含有神经细胞的样品，例如，中枢神经系统或周 边神经系统组织的活检是适合用在本发明中的生物样品。但是，除了神经细胞，其它细胞 表达说明性的例如α II-血影蛋白，包括，例如，心肌细胞(cardiomyocyte)、骨骼肌细胞 (myocytes in skeletal muscles)、肝细胞(hepatocytes)、肾细胞(kidney cells)禾口睾丸 细胞(cells in testis)。包括这些细胞或从这些细胞分泌的液体的生物样品也可以用在 改用于确定和/或特征化对这些非神经细胞的损伤的本发明方法中。在这里使用的对象说明性地包括狗、猫、马、牛，猪、绵羊、山羊、鸡、非人类的灵长 类动物、人类、大鼠、豚鼠、仓鼠和老鼠。由于本发明优选涉及人类对象，用于本发明的方法 的优选对象是人类。从本发明获益最多的对象是那些怀疑已经患有或存在危险将患有异常神经系统 疾病或损伤的那些对象，其例如创伤损伤(如枪伤、车祸、运动意夕卜、摇晃婴儿综合症、其它 冲击损伤)、缺血性事件(如中风、脑出血、心脏停搏)、神经退行性疾病(如阿尔茨海默氏症、 亨丁顿舞蹈症和帕金森氏症；朊病毒相关疾病；痴呆的其它形式)、癫痫症、药物滥用(例如， 来自安非他明、迷魂药(Ecstasy)/摇头丸(MDMA)，或乙醇)、和周边神经系统病变如糖尿病 神经病变、化疗引起的神经病变及神经性疼痛导致的脑损伤的受害者。为了提供神经系统疾病和测量的神经活性生物标志物的量之间的关联性，CSF或 血清是优选的生物液体。说明性地，CSF或血清样品从带有进行神经活性生物标志物测量 的样品的对象采集。对象具有不同的神经系统疾病。然后一个或更多生物标志物的检测到 的水平与除了 GCS计分外承认或标准的基底水平或可选的CT扫描结果相关联。根据这些 结果，一种发明分析方法可选地得到发展和验证(Lee et al.，Pharmacological Research 23 312-328，2006)。可理解，神经活性生物标志物，除了从CSF和血清中获得外，还很容易 从血液、血浆、唾液、尿液以及固体组织活检中获得。而CSF由于直接接触神经系统因而是 优选的采样液体，可理解，在被采集用于其它目的时，其它生物液体具有优势从而允许创造 性地确定神经系统疾病，并作为在单个样品例如血液、血浆、血清、唾液或尿液上进行的一 系列测试的一部分。几种生物标志物的基底水平是在没有已知的神经系统疾病的期望对象的物种中 的目标生物样品中获得的那些水平。这些水平不需要用硬浓度(hard concentrations)表 示，相反可以从平行对照试验知道，并用荧光单位、密度单位等等表示。通常，在没有神经系 统疾病时，SBDPs在生物样品以可以忽略不计的量存在。然而，UCHLl在神经元中是高度丰 富的蛋白。确定特定物种的神经元中UCHLl的基底水平在本领域中是已知的。同样，确定MAP2的基底水平的浓度在本领域中是已知的。如在这里所使用的，术语“诊断”是指识别神经或其它疾病如损伤或疾病是否存 在。诊断可选地指的是分析的结果，其中生物标志物的特定比例或水平被检测到或不存在。如在这里所使用的，“比例”要么是正比例，其中目标的水平大于目标在第二样品 中的水平或已知或公认的相同目标的基底水平。负比例描述了目标的水平小于目标在第二 样品中的水平或已知或公认的相同目标的基底水平。中性比例描述了目标生物标志物没有 可观察到的变化。如在这里所使用的，术语“施用”是输送治疗物至对象。该治疗物由本领域技术人 员确定的对于特定对象合适的路径进行施用。例如，治疗物是口服、非肠道(例如，静脉的)、 通过肌肉注射、通过腹腔注射、瘤内注射、通过吸入或经皮施用的。治疗物所需的确切的量 根据对象的不同而不同，取决于对象的年龄、体重和一般状况，治疗的神经系统疾病的严重 性，使用的特定的治疗物，施用方式等等。合适的量可以由本领域技术人员仅使用常规实验 结合本文教导或利用本领域知识而无需过度实验(undue experimentation)进行确定。一种用于检测生物样本中一个或更多神经活性生物标志物存在与否的示例性的 方法涉及从对象例如人获得生物样品，将生物样品接触能够检测要分析的生物标志物的化 合物或试剂，说明性地包括抗体或适体，并分析冲洗后化合物或试剂与样品的结合。可理 解，其它检测方法也同样可操作的，说明性地与蛋白或核酸特异性染色有联系。在抗体或适 体的情况下，特异结合化合物或试剂的那些样品表达出要分析的标志物。本发明可选地用UCHLl或SBDP进行描述。可理解，这些标志物只是用于说明目的， 并不意味着明示或暗示本发明的范围限于UCHLl或SBDPs。—种发明方法可用于体外以及体内检测生物样品中UCHLl和一个或更多其它神 经活性生物标志物。样品中UCHLl或一个或更多其它神经活性生物标志物的表达量与合 适的对照例如已知表达了要分析的标志物的可检测到的水平的第一样品(阳性对照)和已 知没有表达要检测的标志物的可检测到的水平的第二样品(阴性对照)进行比较。例如， 用于检测标志物的体外技术包括免疫吸附测定法(ELISAs)、放射免疫测定法、放射性分析 (radioassay)、western杂交、Southern杂交、Northern杂交、免疫沉淀、免疫荧光、质谱测 定、RT - PCR、PCR、液相色谱法、高效液相色谱法、酶活性测定法、细胞分析、正电子发射断 层扫描技术、质谱分析、其组合、或本领域已知的其它技术。此外，用于检测标志物的体内技 术包括往生物样品或测试对象导入特异性结合标志物的标记的试剂。例如，试剂可以用放 射性标记进行标记，该放射性标记在生物样品或测试对象中的存在和位置可以通过标准成 像技术进行检测。可特异性结合UCHLl或其它生物标志物的任何合适的分子和特异性结合一个或 更多神经活性生物标志物的任何合适的分子在本发明中是可操作的。用于检测UCHLl或一 个或更多其它神经活性生物标志物的优选的试剂是能够结合至要分析的生物标志物的抗 体，优选地，抗体与可检测的标记偶联。这种抗体可以是多克隆的或单克隆的。完整的抗体， 其片段(例如，？油或？(油’)2)，或其工程变体(如评力也可以使用。这种抗体可以是任何 免疫球蛋白类包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD和其任何亚类。在这里可操作的抗体可选的是 单克隆的或多克隆的。抗体可选地进行标记。本领域技术人员认识到许多标记在这里是可操作的。标记和标记试剂盒是市售可得的，可选地从Invitrogen Corp, Carlsbad, CA得到。标记说明 性地包括荧光标记、生物素、过氧化物酶、放射性核苷酸(radionucleotides)、或本领域已 知的其它标记。 基于抗体的分析优选地用于分析生物样品以检测UCHLl和一个或更多其它神经 活性生物标志物的存在。合适的western杂交方法描述在下面的实例部分。如需更加快速 分析(在紧急医疗情况下可能是重要的)，可以使用免疫吸附测定法(如ELISA和RIA)和免 疫沉淀分析法。作为一个例子，生物样品或其一部分是固定在基体例如硝化纤维或PVDF制 成的膜；或由聚苯乙烯或其它塑料聚合物制成的刚性基体例如微量滴定板上，基体与抗体 接触，抗体在允许抗体结合至要分析的生物标志物的条件下特异性结合UCHL1，或其它神经 活性生物标志物之一。清洗后，抗体在基体上存在表明样品含有要分析的标志物。如果抗 体直接偶联可检测的标记，如酶、荧光或放射性同位素，标记的存在可选地通过检测用于可 检测的标记的底物来进行检测。或者，结合标志物特异性抗体的可检测的标记了的二抗加 至基体。清洗后可检测的标记在基体上存在表明样品含有标志物。
这些基本免疫测定法的无数变换在本发明中也是可操作的。这些变换包括生物标 志物特异性抗体，而不是样品固定在基体上，基体与偶联有可检测的标记的UCHLl或另一 神经活性生物标志物在使得抗体结合至标记的生物标志物的条件下接触。然后基体与样品 在允许要分析的标志物结合至抗体的条件下接触。清洗后在基体上的可检测的标记的量的 减少表明样品含有标志物。虽然抗体因为其广泛的特性优选使用在本发明中，特异性结合UCHLl或另一神 经活性生物标志物的任何其它合适的试剂(例如，肽，适体(aptamer)，或有机小分子)可选 地使用在上述免疫分析中代替抗体。例如，可以使用特异性结合α II血影蛋白和/或它 的SBDPs的一个或更多的适体。适体是基于核酸的结合特异性配体的分子。用于制备具 有特定结合特异性的适体的方法已知详细描述在美国专利US5，475，096 ；US5, 670，637 ； US5, 696，249 ；US5, 270，163 ；US5, 707，796 ；US5, 595，877 ；US5, 660，985 ；US5, 567，588 ； US5, 683，867 ；US5, 637，459 ；及 US6, 011，020 中。在用于生物标志物表达的诊断分析中可操作的许多可检测的标记在本领域中是 已知的。使用在用于检测UCHLl或另一神经活性生物标志物的方法中的试剂偶联至可检测 的标记，例如，酶比如辣根过氧化物酶。标记有辣根过氧化物酶的试剂可以通过加入在辣根 过氧化物酶存在下发生颜色变化的合适的底物来进行检测。可以使用的其它几种可检测的 标记是已知的。这些标记的常见的例子包括碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、荧光化合物、发 光化合物、胶体金、磁性粒子、生物素、放射性同位素和其它酶。可理解，一抗/ 二抗系统可 选地用于检测一个或更多生物标志物。特异性识别一个或更多生物标志物的一抗暴露于可 能含有感兴趣的生物标志物的生物样品。然后，识别一抗的类型或同型的带有合适标记的 二抗与样品接触从而实现样品中一个或更多生物标志物的检测。本发明采用将生物样品中UCHLl和一个或更多其它神经活性生物标志物的存在 或量与神经细胞损伤的严重程度和/或类型相关联的步骤。对于在实例中详细描述的创伤 性脑损伤来说，生物样品中UCHLl和一个或更多其它神经活性生物标志物的量与神经系统 疾病有关。一种协同测量UCHLl和一个或更多其它神经活性生物标志物的发明方法的结果 可以帮助医生确定损伤的类型和严重程度，并牵涉已被破坏的细胞类型。这些结果与CT扫
15描和GCS结果一致，但是是定量的，获得更加迅速，并且成本低得多。本发明提供了将UCHLl的量和可选地至少一个其它神经活性生物标志物的量与 一个或每一个正常水平相比较以确定对象的神经系统疾病的步骤。可理解，在轴突损伤标 志物即一种SBDP的情况下，其它生物标志物的选择允许确定异常神经系统疾病牵涉的神 经细胞的类型，以及细胞死亡的本质。本发明方法的实践提供了一种测试，其可以帮助医生 为了对象的最佳利益而确定合适的施用的治疗物。虽然在实例中发现的随后提供的数据是 关于全方位的创伤性脑损伤的，可理解，这些结果适用于缺血事件、神经退行性疾病、朊病 毒相关疾病、癫痫病、化学病因及周边神经系统病变。性别差异可能出现在异常的对象神经 系统疾病中。还提供了一种用于分析对象中细胞损害的方法，该法包括(a)基体，用于固定从 怀疑具有损害的神经细胞的对象分离的样品，样品在从对象分离之前是与对象的神经系统 连通的液体；(b) UCHLl特异性结合试剂；(c)可选的用于另一神经活性生物标志物的结合 试剂；及(d)印刷的操作指南，用于将UCHLl试剂与生物样品或生物样品的一部分反应以检 测生物样品中至少一生物标志物的存在或量。本发明方法可用于为财务酬劳检测神经系统 疾病。本方法可选地包括可检测的标记，例如与试剂偶联的标记；或者与特异性结合试 剂的物质例如二抗偶联的标记。本发明的诊断治疗方法可选地包括可以改变目标生物标志物的一个或更多特征 的一个或更多治疗物的存在。治疗物可选地是作为目标生物标志物或生物标志物的上游效 应子的激动剂或拮抗剂。治疗物可选地影响生物标志物的下游功能。例如，乙酰胆碱(Ach) 在由疾病引起的神经元兴奋中起作用，TBI诱导的毒蕈碱胆碱能受体激活可能有助于兴奋 毒性过程。因此，生物标志物可选地包括Ach或毒蕈碱受体的水平或活性。可选地，可操作 的生物标志物是由毒蕈碱受体的活性影响的分子、蛋白、核酸或其它物质。因此，在本目标 发明中可操作的治疗物说明性地包括调节毒蕈碱受体激活的各个方面的那些物质。作为治疗目标或治疗目标调节物的可操作的具体毒蕈碱受体包括Ml、M2、M3、M4 和M5毒蕈碱受体。毒蕈碱胆碱能受体通路在检测和治疗TBI中的合适性产生于证明实验TBI (Gorman et al. , 1989; Lyeth et al. , 1993a)禾口缺血(Kumagae and Matsui, 1991)后在 大脑脑脊髓液(CSF)中ACh升高的研究，以及通过施用类胆碱(cholinomimetics)，毒蕈碱 胆碱能受体激活的高水平的损伤本质(Olney et al.，1983; Turski et al.，1983)。此 外，实验TBI后毒蕈碱拮抗剂的紧急施用改善行为恢复(Lyeth et al. , 1988a; Lyeth et al. , 1988b; Lyeth and Hayes, 1992; Lyeth et al. , 1993b; Robinson et al. , 1990)。在本目标发明中可操作的治疗物说明性的是任何分子、化合物、家族、提取物、溶 液、药物、药物前体，或其它机制，其可操作的用于改变，优选改善，处于神经元损伤例如TBI 或MTBI危险或是神经元损伤例如TBI或MTBI的受害者的对象的治疗结果。治疗物可选地 是毒蕈碱胆碱能受体调节物，例如激动剂或拮抗剂。激动剂或拮抗剂可以是直接的或间接 的。间接激动剂或拮抗剂可选的是降解或合成乙酰胆碱的分子，或其它毒蕈碱受体相关分 子，说明性的是目前用于治疗阿尔茨海默病的分子。胆碱类似物(Cholinic mimetics)或 类似分子在这里是可操作的。在这里可操作的治疗物的示例性的列表包括双环胺，东莨菪
16碱，米拉美林，N -甲基-4-哌啶二苯乙醇酸盐或酯NMP ；匹鲁卡品，哌仑西平，乙酰胆碱，乙 酰甲胆碱，卡巴胆碱，乌拉胆碱，毒蕈碱，氧化震颤素M,氧化震颤素，毒胡萝卜素，钙通道阻 滞剂或激动剂，尼古丁，占诺美林，BuTAC，氯氮平，奥氮平，西维美林，醋克立定，槟榔碱，托 特罗定，羟双环凡林，IQNP,吲哚生物碱，喜巴辛，cyclostellettamines,其衍生物，其前体 药物，以及它们的组合。治疗物可选的是可操作的去改变钙蛋白酶或半胱天冬酶的水平或 活性的分子。这种分子和它们的施用在本领域中是已知的。—种发明诊断治疗方法说明性地包括用于诊断对象中神经系统疾病的方法，用于 治疗具有神经系统疾病的对象的方法，或两者均包括。在优选的具体实施例中，发明方法说 明性地包括从对象获得生物样品。生物样品通过本领域已知的机制进行分析以检测或确定 生物样品中一个或更多生物标志物的存在。基于生物样品中生物标志物的量或存在，可选 地计算一个或更多生物标志物的比例。比例可选的是一个或更多生物标志物的水平相对于 相同或平行样品中另一生物标志物的水平，或要测量的生物标志物的量与已知没有神经系 统疾病的对象中相同生物标志物的测量的或先前建立的基底水平的比例。比例允许对象中 神经系统疾病的诊断。发明方法还给对象施用将直接或间接改变一个或更多生物标志物的 比例的治疗物。还提供了一种发明方法用于诊断和治疗多器官损伤。多器官说明性地包括神经 组织例如脑和脊髓等等的子集，或大脑的特定区域，例如皮层、海马等等。多器官损伤说明 性地包括通过半胱天冬酶诱导的SBDPs的存在可检测的细胞凋亡；和通过钙蛋白酶诱导的 SBDPs的存在可检测的细胞胀亡。本发明方法说明性地包括分析从对象获得的生物样品中 的许多生物标志物，其中当生物样品从对象获得时，生物样品可选地与怀疑经受损害的器 官或对照器官液体接触。本发明方法基于许多生物标志物的第一比例确定器官损伤的第一 亚型。本发明方法还基于生物样品中许多生物标志物的第二比例确定第二器官损伤的第二 亚型。比例说明性地通过在这里描述的或本领域已知的方法确定。在本发明方法中的多器官损伤的治疗说明性地通过对对象施用至少一种有效调 节因响应第一器官损伤而活性改变的蛋白的活性的治疗拮抗剂或激动剂，和施用至少一种 有效调节因响应第二器官损伤而活性改变的蛋白的活性的治疗拮抗剂或激动剂。本目标发明说明性地包括用于区分对象中神经系统疾病的程度的组合物。一种发 明组合物要么是一种试剂实体要么是多种试剂的混合物。在优选的具体实施例中，组合物 是一种混合物。该混合物可选地包含源自对象的生物样品。对象可选地怀疑具有神经系统 疾病。生物样品在从对象分离之前与对象的神经系统连通。本发明组合物还包含至少两个 主要试剂，优选抗体，其特异性地和独立地结合至可能存在生物样品中的至少两个生物标 志物。在优选的具体实施例中，第一主要试剂是特异性结合泛素羧基末端水解酶优选UCHLl 的抗体。第二主要试剂优选特异性结合血影蛋白降解产物的抗体。本发明组合物的试剂可选地是可动的，或以其它方式与基体接触。本发明教导优 选地用至少一种可检测的标记进行标记。在优选的具体实施例中，在每种试剂上的标记是 独一无二的和可独立检测的。可选地，特异性用于检测或结合至主要试剂的次要试剂用至 少一种可检测的标记进行标记。在非限制实例中，主要试剂是兔源抗体。次要试剂可选的 是对兔源一抗具有特异性的抗体。抗体结合至抗原的检测的机理是本领域熟知的，本领域 普通技术人员很容易想到适于检测生物样品中的抗原或生物标志物的许多方法和试剂。
还提供了试剂盒，包括适于连接生物样品中的目标生物标志物的基体。生物样品 可选地与试剂盒一起提供或由使用本发明试剂盒的医师获取。一种发明试剂盒还包括特异 性地和独立地结合至至少两个生物标志物的至少两个抗体。抗体优选地区分两种生物标志 物。优选地，第一抗体是特异性的和独立地用于结合和检测第一生物标志物。第二抗体是 是特异性的和独立地用于结合和检测第二生物标志物。采用这种方式，可以确定或区分在 单一生物样品中的多个生物标志物的存在或缺乏。在优选的具体实施例中，生物样品中的 目标生物标志物说明性地包括α II血影蛋白、α II血影蛋白降解产物(SBDP)、泛素羧基末 端水解酶和ΜΑΡ2蛋白。一种发明试剂盒还包括用于将抗体与生物样品或一部分生物样品 反应从而检测生物样品中生物标志物的存在或量的操作指南。在试剂盒中，生物样品可以是CSF或血液，试剂可以是特异性结合α II血影蛋白、 α II血影蛋白降解产物(SBDP)、泛素羧基末端水解酶和ΜΑΡ2蛋白的至少之一的抗体、适体 或其它分子。试剂盒还可以包括可探测的标记，例如偶联至试剂的标记，或偶联至特异性结 合试剂的物质(例如，二抗)的标记。本发明采用将生物样品中生物标志物的存在或量与神经细胞(或其它表达生物标 志物的细胞)损伤的严重程度和/或类型相关联的步骤。在生物样品中生物标志物的量直 接与神经组织损伤的严重性相关，因为更加严重的损伤损害更多数目的神经细胞，其反过 来导致更大量的生物标志物积累在生物样品(例如CSF ；血清)中。神经细胞损伤是否触发 细胞死亡的凋亡类型和/或坏死类型可以通过检测生物样品中SBDPs的存在来确定。细胞 坏死优先激活钙蛋白酶，而细胞凋亡优先激活半胱天冬酶-3。因为可以区分钙蛋白酶和半 胱天冬酶-3 SBDPs，这些标志物的测量表明对象中细胞损害的类型。例如，坏死诱导的钙蛋 白酶激活导致SBDP150和SBDP145的产生；凋亡诱导的半胱天冬酶_3激活导致SBDP150i 和SBDP120的产生，两种通路都激活导致所有四种标志物的产生。同样，存在于生物样品中 的UCHLl的水平或动力学程度可以可选地区分轻度损伤和更严重的损伤。在说明性的实例 中，相对于轻度激发(30分钟)，严重的MACO (2小时)在CSF和血清中均产生增加的UCHL1， 然而两者均产生超过未损伤对象的UCHLl水平。而且，生物样品中标志物的持久性或动力 学程度指示损伤的严重程度，更大的损伤表示对象中UCHLl或SBDP的增加的持久性，其是 通过一种发明方法在损伤后在几个时间点在生物样品中测量的。这种测试的结果可以帮助医生确定施用特定治疗物例如钙蛋白酶和/或半胱天 冬酶抑制剂或毒蕈碱胆碱能受体拮抗剂是否可能有益于病人。该应用在检测细胞死亡机制 中年龄和性别差异方面可能是尤其重要的。涉及常规生物技术的方法在这里进行了描述。这些技术一般是本领域已知的， 并详细描述在方法专题著作例如分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed. , vol. 1-3, ed. Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 1989)；和分子生物学现行实验方案(Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publishing and WiIey-Interscience, New York, 1992)(定期更新)中。免疫学方法(如，抗原特异性抗体制 备，免疫沉淀和免疫印迹)描述在，例如，免疫学现行实验方案(Current Protocols in Immunology, ed. Coligan et al. , John Wiley & Sons, New York, 1991)；禾口免疫学分 析方法(Methods of Immunological Analysis, ed. Masseyeff et al. , John Wiley &Sons, New York, 1992)中。本发明的各个方面通过以下非限制的实例进行阐述。这些例子只用于说明目的， 而不是限制本发明的任何实践。将可以理解，可以作出变化和更改而不背离本发明的精神 和范围。虽然实例一般是针对哺乳动物组织，具体地说，分析大鼠组织，本领域普通技术人 员认识到本领域已知的相似的技术和其它技术容易将实例应用到其它哺乳动物例如人类 上。在这里说明的试剂均通常是在哺乳动物物种间交叉反应的，或具有类似性质的替代试 剂是商业上可获得的，本领域普通技术人员容易知道哪里可以得到这些试剂。实例1 用于生物标志物分析的材料。碳酸氢钠，(Sigma Cat# :C_3041 )，封闭缓冲 液(Startingblock T20-TBS) (Pierce Cat#: 37543)，含吐温 20 的 Tris 盐缓冲液(TBST ； Sigma Cat# :T-9039)。磷酸盐缓冲液(PBS ;Sigma Cat#:P_3813)；吐温 20 (Sigma Cat# P5927);超级 TMB ELISA (Pierce Cat#: 34028)；和 Nunc maxisorp ELISA 板(Fisher)。单 克隆和多克隆UCH-Ll抗体是本实验自制或来自Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA。用于α-II血影蛋白和降解产物以及MAP2的抗体可以从Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA得到。用于许多亚型的抗体的标记可以从Invitrogen，Corp. , Carlsbad, CA得到。生物样品中蛋白浓度用标准白蛋白使用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid)微量 蛋白测定法(Pierce Inc., Rockford, IL, USA)测定。所有其它必须的试剂和材料对于 本领域技术人员是已知的而且容易获得的。实例2 =TBI损伤模型的体内模型可控的皮层碰撞(CCI)装置用于制备如前所 述的大鼠 TBI 模型(Pike et al, 1998)。成年雄性(280_300g) SD 大鼠(Sprague-Dawley ratsXHarlan: Indianapolis, IN)用在 1 :1 02/N20 载气中的 4% 的异氟醚麻醉(4 分钟)， 然后保持在相同载气中的2. 5 %的异氟醚中。核心体温用直肠热敏电阻探针连续监测，并通 过在大鼠下面放置可调节的温度控制的加热垫维持在37士 1°C。动物以卧姿固定在立体定 位框架上并用耳朵和门牙固定杆栓牢。沿着颅中线切口和软组织的反射区，实施单侧(与碰 撞部位同侧)开颅手术(直径7毫米)，临近中缝，在前囱(bregma)和人字缝尖(lambda)之 间。硬脑膜(dura mater)在皮层上保持完整。脑损伤通过用直径5mm的铝碰撞头(安装在 气缸中)以3. 5m/s的速度、1. 6mm压缩冲程和150ms停留时间碰撞右侧(同侧)皮层产生。 假损伤对照动物进行同样的外科手术，但不接受碰撞损伤。进行适当的损伤前后的处理以 确保遵照由佛罗里达州实验动物管理及使用委员会制定的指南和详细描述在实验动物管 理及使用指南中的美国国立卫生研究院指南。此外，研究的开展遵照动物福利法和其它与 动物和涉及动物的实验的联邦条例和法规，并遵循在“NRC出版，1996年版，实验动物管理 及使用指南(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, NRC Publication, 1996 edition)”中规定的原则。实例3 大脑中动脉栓塞(MCAO)损伤模型大鼠在异氟醚麻醉(5%异氟醚经由吸 气室，然后2%异氟醚经由鼻锥)下培养，大鼠的右颈总动脉(CCA)在颈外动脉(ECA)和颈内 动脉(EIA)分叉处通过颈部中线切割而暴露出。ICA朝喙侧地位于翼腭分支之后，ECA在其 舌和上颂骨分叉处结扎并割断。然后通过在ECA残部上的切口，将3-0尼龙缝线引入ECA (缝线的路径通过血管壁视觉监测)，并前进通过颈动脉管至离颈动脉分叉约20mm直到它停 留在大脑前动脉的狭窄处阻断大脑中动脉的源头。然后闭合皮肤切口，血管内缝线留在位 置上30分钟或2小时。然后大鼠再次短暂麻醉，取回缝线细丝，以允许再灌注。对于假MACO手术，遵循同样的程序，但丝线前进仅超过内-外颈动脉分叉10mm，留在位置上直到大鼠死 亡。在所有外科手术期间，动物通过恒温加热毯维持在37 士 1°C (Harvard Apparatus, Holliston, ΜΑ, U. S. Α.)。重要的是要注意，在每个实验的结论中，如果验尸时大鼠大脑显 示蛛网膜下出血的病理证据，将它们从研究中排除。进行适当的损伤前和损伤后处理，以确 保遵循所有的实验动物管理和使用指南。实例4 组织和样品制备在损伤后适当的时间点(2、6、24小时和2、3、5天)，对 动物进行麻醉并立即斩首处死。快速取出大脑，用冰冷PBS冲洗后分成两份。迅速解剖右 半球大脑(碰撞区域周围的大脑皮层和海马)，用冰冷PBS淋洗后在液氮中速冻，然后保存 在-80°C待用。对于免疫组化，大脑迅速在干冰浆中冷冻，用冷冻切片机(20微米)切片到 SUPERFROST PLUS GOLDrp (Fisher Scientific)载玻片上，然后保存在 _80°C待用。对于 左半球大脑，收集和右侧相同的组织。对于Western杂交分析，大脑样品用置于干冰上的 小的研钵和杵粉碎成细粉末。然后粉碎好的脑组织粉末在含50mM Tris CpH 7. 4)、5 mM EDTA、1% (v/v) Triton X-100U mM DTT和Ix蛋白酶抑制剂混合物的缓冲液中(Roche Biochemicals)于4°C裂解90分钟。然后将脑组织裂解液在4°C，15000xg离心5分钟去掉 和移除不溶物，速冻，然后保存在-80°C待用。对于凝胶电泳和电印迹，澄清的CSF样品(7μ 1)加2x的蒸馏水中含0.25 M Tris (pH 6. 8)、0. 2M DTT,8% SDS、0. 02%溴酚蓝和20%甘油的上样缓冲液，进行十二烷基 硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)电泳。每个泳道20微克(20 yg)蛋白按常规 在 10-20%的 Tris/ 甘氨酸凝胶(Invitrogen, Cat #EC61352)上采用 SDS-PAGE 以 130 伏 电泳2小时。电泳之后，分离的蛋白在半干转印系统(Bio-Rad)中在含有39mM氨基乙酸、 48mM Tris-HCl (pH8. 3)和5%甲醇的转印缓冲液中在恒定电压20V室温转印2小时从而 横向转印到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。电转印之后，膜在含5%脱脂奶粉的TBS和0. 05% Tween-2 (TBST)中室温封闭1小时，然后在含5%脱脂奶粉的TBST中与按照厂商建议以 1 2000稀释的多克隆UCHLl —抗在4°C孵育过夜。然后用TBST洗涤三次，和生物素标记的 二抗(Amersham，Cat # RPmi77vl)在室温孵育2小时，与链霉亲和素偶联的碱性磷酸酶 (BCIP/NBT reagent: KPL, Cat# 50-81-08)孵育30分钟。完整UCHLl蛋白的分子量用彩 虹颜色的标准分子量标记(Amersham，Cat # RPN800V)进行估算。完整UCHLl蛋白水平的 半定量评估通过计算机辅助光密度扫描(Epson XL3500 scanner)和用ImageJ软件(NIH) 进行成像分析来完成。实例5 =UCHLl表达对神经组织是特异的。UCHLl的组织特异性通过例如在实例4 中那样进行分析，以确定组织特异性表达。UCHLl主要表达在大脑(图1A)，在睾丸中低水平 表达。UCHLl存在于所有大脑区域，在小脑和桥脑水平降低(图1B)。
实例6 :MAC0激发后UCHLl在CSF中增加。如在实施例3中描述的，对象进 行MACO激发处理，CAF样品通过定量免疫印迹法分析。损伤后，UCHLl蛋白是容易检测的， 在超出假损伤处理样品中的UCHLl的量以上的统计上显著水平(图2A，B)。轻度缺血(30分 钟MCA0)后再灌注以后，这些UCHLl水平短暂升高(在6小时)，而更严重(2小时MAC0)缺 血后水平从6保持至72小时(图2A，B)。实例7 =ELISA法很容易确定CSF和血清中的UCHLl水平。ELISA法用于更快、更 容易地检测和定量生物样品中的UCHLl。对于UCHLl夹心ELISA (swELISA),96孔板用在PH9. 2.的IM碳酸氢钠中的100 μ 1/每孔的捕捉抗体(实验室自制的500 ng/每孔纯化的 兔UCHLl抗体)进行包被。96孔板4°C孵育过夜，吸干，然后加入300 μ 1/每孔的封闭缓冲 液(Startingblock T20-TBS)，室温轻轻摇动孵育30分钟。接下来要么添加用于标准曲线 (0. 05-50ng/每孔)的标准抗原(重组UCHLl)要么添加在样品稀释液(总体积100 μ 1/每孔) 中的样品(3-10μ 1 CSF)。板在室温孵育2小时后，用自动洗板机洗板(用洗涤缓冲液TBST， 5 χ 300 μΙ/每孔)。然后在封闭缓冲液中的检测抗体HRP偶联的鼠抗UCH-Ll (实验室自 制，50yg/ml)以100 μ 1/每孔加到孔中，室温孵育1. 5小时，然后洗涤。如果需要放大信 号，加入生物素化的酪胺(biotinyl-tyramide)溶液(Perkin Elmer Elast Amplification Kit),室温孵育15分钟，洗涤，然后100 μ 1/每孔的在含0. 02% Tween-20和1 % BSA的PBS 溶液中的链霉亲和素标记的HRP (1 :500)，孵育30分钟，洗涤。最后，孔中加入100 μ 1/每 孔的TMB底物溶液(Ultra-TMB ELISA, Pierce# 34028)，孵育5_30分钟。在96孔分光光度 计(Molecular Device Spectramax 190)上在 652nm 处读出信号。通过swELISA测量，TBI组(冲击损伤)的UCH-Ll水平显著高于假损伤对照组 (p<0. 01，ANOVA分析)和空白对照组，证明损伤后UCHLl在CSF中早期升高(损伤后2小时)， 然后在损伤后48小时再次升高之前，在约24小时下降(图3)。
在MACO激发之后，相对于采用更轻激发(30分钟)，采用严重激发(2小时) 在CSF中UCHLl的量显著增加(图4)。更严重的2h MACO组，UCHLl蛋白水平比30min MACO 高2-5倍(ρ < 0.01，ANOVA分析)。对于假损伤组，UCHLl蛋白水平事实上几乎难以与空白 对照组区分开。对于血清中UCHL1，得到了类似的结果。在每个实验阶段最后，用配有21规格针头 的注射器直接从心脏采集血液(3-4ml )，置于聚丙烯管内，室温放置45分钟到1小时形成血 块。管用3000 xg离心20分钟，取血清进行ELISA分析(图5，6)。
TBI组的UCHLl水平显著高于假损伤组(ρ <0. 01，ANOVA分析)，对于从2 小时至24小时测量的每个时间点各自对应相同的假损伤时间点(ρ< 0. 005, Student's T 检验)。损伤后在血清中最早2小时UCH-Ll显著增加。严重MACO激发相对于轻度激发产 生增加的血清UCHL1。轻度和严重激发都统计上高于假损伤处理的动物，表明UCHLl的血清 检测是稳健的诊断物，其水平能够充分区分轻度和严重损伤。实例8 大鼠MACO激发后，通过与那些描述在其内容在这里通过参考纳入的美国 专利US7，291，710中的程序类似的程序对血影蛋白降解产物进行了分析。图7表明相对于 轻度(30分钟)激发，严重(2小时)MACO激发后在血清和CSF中的SBDP145的水平在研究 的所有时间点是显著增加的。同样，SBDP120表明严重MACO激发后，在损伤后24至72小 时之间在CSF中显著升高。然而，相对于轻度激发，严重激发后在血清中的SBDP120的水平 在2至120小时之间的所有时间点是增加的。相对于假损伤处理的对象，轻度和严重MACO 激发在CSF和血清中均产生增加的SPBP 120和140。实例9 微管相关蛋白2 (MAP2)作为轻度(30分钟)及严重(2小时)MCAO激发后 在对象CSF和血清中的生物标志物用基本上描述在实例4和7中的ELISA或western杂交 实验进行分析。抗 MAP2 抗体(MAP-2(E-12))从 Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA获得。这些抗体既适用于ELISA又适用于western杂交实验，并且对鼠和人MAP2有交叉 反应。相对于空白对照动物，在轻度MCAO激发后在对象的CSF和血清中MAP2的水平均显
21著增加(P<0.05)(图9)。与UCHLl和SBDPs类似，严重激发(2小时)在两个样品中均比轻 度激发(30分钟)产生高得多的MAP2水平。实例10 双环胺抑制TBI后CSF中SBDPs的产生，但对神经元细胞的活力没有影 响。对于其改变激发后生物样品中生物标志物水平的能力，基本上如其内容在这里通过参 考纳入的Cox, CD, et al. , JNeurotrauma, 2008; 25(11) 1355-65所描述的对该治疗 物双环胺进行分析。没有经过药物处理的8个TBI对象用在时间曲线研究中进行SPDP免疫组织化学 (在TBI后3、12、24和48 h，n=2/时间点)。24个对象被分配到3个处理组之一(每个组η =8)损伤组施用盐水溶媒(与药物注射相等体积)；损伤组施用双环胺；及第三假损伤组作 为没有受伤的基准，以其比较在SBDP水平上TBI诱导的变化。所有程序均按照加州大学戴 维斯分校实验动物管理和使用委员会批准的方案进行。基本上如实例2中所描述的对对象施用CCI，CSF如实例4所述的进行制备。双环 胺溶解在等渗盐水(isotonic saline)中，在TBI诱导之前5分钟以5mg/kg剂量(体积1. O ml/kg)进行腹腔注射(i. p.)。溶媒处理组接受等体积i. p.注射的等渗盐水。两组均在相 对于损伤的同一时间点接受注射，对研究者隐瞒药物或溶媒的身份。对于TBI程度、初始体重(手术时)或手术时的温度，组之间没有显著差异(表1)。 与盐水处理组相比，双环胺处理组中体重下降百分比显著降低(表1)。
权利要求
一种用于诊断和治疗神经系统疾病或神经系统疾病可能性的方法，其特征在于，包括分析对象的生物样品以检测一个或更多生物标志物的存在；基于样品中一个或更多生物标志物的比例诊断神经系统疾病；和对对象施用治疗物以改变所述的一个或更多生物标志物的比例。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述神经系统疾病选自包括脑损伤、或多 器官损伤、或它们的组合的组。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物标志物选自包括血影蛋白；血 影蛋白降解产物；MAP2 ；神经元退化；泛素羧基末端酯酶；泛素羧基末端水解酶；位于神经 元的细胞内蛋白；MAP-tau ；C-tau ；聚(ADP-糖)聚合酶(PARP)；脑衰蛋白反应调停蛋白； 其降解产物；其衍生物，和它们的组合的组。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物标志物是泛素羧基末端水解酶。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物标志物比例大于2。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述生物标志物比例小于0.5。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述治疗物是直接治疗物。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述治疗物是间距治疗物。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述治疗物选自包括双环胺，东莨菪碱， 米拉美林，N -甲基-4-哌啶二苯乙醇酸盐或酯NMP ；匹鲁卡品，哌仑西平，乙酰胆碱，乙酰甲 胆碱，卡巴胆碱，乌拉胆碱，毒蕈碱，氧化震颤素M,氧化震颤素，毒胡萝卜素，钙通道阻滞剂 或激动剂，尼古丁，占诺美林，BuTAC，氯氮平，奥氮平，西维美林，醋克立定，槟榔碱，托特罗 定，羟双环凡林，IQNP,吲哚生物碱，喜巴辛，cyclostellettamines，其衍生物，其前体药物， 以及它们的组合的组。
10.一种用于诊断和治疗神经系统疾病或神经系统疾病可能性的方法，其特征在于， 包括分析对象的脑脊髓液或血清以检测选自包括泛素羧基末端水解酶；血影蛋白降解产 物；和MAP2的组的一个或更多生物标志物的存在；算所述生物标志物水平与基底水平的比 例；基于所述比例诊断神经系统疾病；和对对象施用毒蕈碱受体拮抗剂以改变所述的一个 或更多生物标志物的比例。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述毒蕈碱受体拮抗剂是双环胺。
12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述神经系统疾病选自包括冲击脑损 伤；缺血性中风；和多器官损伤的组。
13.一种用于区分神经损伤程度的组合物，其特征在于，包括从怀疑具有损害的神经 细胞的对象分离的生物样品，生物样品在从对象分离之前是一种与对象的神经系统连通的 液体；和至少两个增加的抗体，其特异地、独立地结合至选自α II血影蛋白、α II血影蛋白 降解产物(SBDP)、泛素羧基末端水解酶和ΜΑΡ2蛋白的至少两个生物标志物。
14.根据权利要求13所述的混合物，其特征在于，所述对象是哺乳动物。
15.根据权利要求13所述的混合物，其特征在于，所述对象是人。
16.根据权利要求13所述的混合物，其特征在于，所述生物标志物固定在基体上。
17.根据权利要求13所述的混合物，其特征在于，还包括至少一可检测的标记。
18.根据权利要求17所述的混合物，其特征在于，所述可检测的标记偶联至所述至少两个抗体。
19.根据权利要求17所述的混合物，其特征在于，所述可检测的标记偶联至特异结合 所述至少两个抗体的物质。
20.一种用于分析对象中细胞损害的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括用于连接从 怀疑具有损害的神经细胞的对象分离的生物样品中的生物标志物的基体，生物样品在从对 象分离之前是一种与生物神经系统连通的液体；至少两个抗体，其特异地、独立地结合至选 自α II血影蛋白、α II血影蛋白降解产物(SBDP)、泛素羧基末端水解酶和ΜΑΡ2蛋白的至 少两个生物标志物；和用于将抗体与生物样品或一部分生物样品反应以检测生物样品中标 志物的存在或量的操作指南。
21.根据权利要求20所述的混合物，其特征在于，所述对象是人。
22.根据权利要求20所述的混合物，其特征在于，还包括至少一可检测的标记。
23.根据权利要求22所述的混合物，其特征在于，所述可检测的标记偶联至所述至少 两个抗体。
24.根据权利要求22所述的混合物，其特征在于，所述可检测的标记偶联至特异结合 所述至少两个抗体的物质。
25.一种用于诊断对象神经系统疾病的方法，其特征在于，包括第一次测量从对象获 得的生物样品中泛素羧基末端水解酶的量和至少一个另外的神经活性生物标志物的量；和 将泛素羧基末端水解酶的量和至少一个另外的神经活性生物标志物的量与泛素羧基末端 水解酶和至少一个另外的神经活性生物标志物的基底水平进行比较从而诊断对象的神经 系统疾病。
26.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，所述测量是免疫测定。
27.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述样品是脑脊髓液或血清。
28.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述至少一个另外的神经活性生物标 志物包括血影蛋白降解产物、MAP - 2、SBDP 150、SBDP 145或SBDP 120，或神经胶质纤维酸性蛋白。
29.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，还包括第二次测量泛素羧基末端水解 酶的第二量和至少一个另外的神经活性生物标志物的第二量，以产生泛素羧基末端水解酶 和至少一个另外的神经活性生物标志物的动力学曲线。
30.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，还包括比较对象中和与对象相同性别 的其它个体中正常水平之间泛素羧基末端水解酶的量和至少一个另外的神经活性生物标 志物的量。
31.一种用于诊断和治疗对象中多器官损伤的方法，其特征在于，包括分析来自对象 的生物样品以检测多个生物标志物；基于所述生物样品中所述多个生物标志物的第一比例 确定第一器官损伤的第一亚型；基于所述生物样品中所述多个生物标志物的第二比例确定 第二器官损伤的第二亚型；施用至少一治疗拮抗剂，其有效抑制响应第一器官损伤的所述 第一亚型释放的蛋白的活性，或者至少一治疗激动剂，其有效促进响应第一器官损伤的所 述第一亚型释放的蛋白的活性；和施用至少一治疗拮抗剂，其有效抑制响应第二器官损伤 的所述第二亚型释放的蛋白的活性，或者至少一治疗激动剂，其有效促进响应第二器官损 伤的所述第二亚型释放的蛋白的活性。
32.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述蛋白是钙蛋白酶。
33.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述蛋白是半胱天冬酶-3。
34.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述多个生物标志物是与所述第一和 所述第二器官的至少之一的损伤相关的细胞降解产物。
35.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述损伤是冲击损伤或中风。
36.根据权利要求31所述的方法，其特征在于，所述治疗拮抗剂是双环胺。
37.一种用于诊断和治疗对象中创伤性脑损伤的方法，其特征在于，包括分析对象组 织或液体以检测一个或更多血影蛋白降解产物；施用双环胺。
38.根据权利要求37所述的方法，其特征在于，所述创伤性脑损伤是中风。
39.根据权利要求37所述的方法，其特征在于，所述创伤性脑损伤是缺血性中风。
40.根据权利要求39所述的方法，其特征在于，所述创伤性脑损伤是冲击脑损伤。
全文摘要
本发明提供了一种用于诊断和治疗对象中神经系统疾病的方法，包括分析对象的生物样品以检测一个或更多生物标志物的存在；基于样品中一个或更多生物标志物的比例诊断神经系统疾病；和对对象施用治疗物以改变一个或更多生物标志物的比例。提供了诊断许多神经系统疾病例如脑损伤或多器官损伤。
文档编号G01N33/68GK101983337SQ200980111586
公开日2011年3月2日 申请日期2009年2月4日 优先权日2008年2月4日
发明者王凯文, 罗纳德·L·海斯 申请人:班扬生物标记公司