专利名称：创伤性脑损伤的治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)-1，2，3，6-四氢-1-甲基吡啶在制备用于治疗创伤性脑损伤(TBI)的药物制剂中的应用。
背景技术：
EP-A10 296 721公开了一类哌啶或1，2，3，6-四氢吡啶化合物，其5-位被一个5-元杂环基取代，包括一组任意取代的5-四唑基-1，2，3，6-四氢吡啶化合物。已揭示此类化合物对中枢胆碱能受体具有高亲和性，特别是对中枢毒蕈碱M1受体具有高亲和性，因此，可用于治疗阿尔茨海默病，老年痴呆症，以及学习和记忆功能障阻。
Moltzen等人J.Med.Chem.1994，37，4085-4099描述了该一组化合物的结构-活性关系。已报导其中一种化合物，即5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)-1，2，3，6-四氢-1-甲基吡啶对毒蕈碱受体具有选择性作用，并对M1受体比对M2和M3受体具有高几倍的亲和性(毒蕈碱受体的亚型，第六届国际学术讨论会，Nov.9-12，1994，FortLauderdale)。其功能作用被描述为M1受体的部分激动剂，以及M2和M3受体的拮抗剂。并且，已报导的体内试验中唯一突出的作用是分别对幼大鼠和成年大鼠空间记忆获得的效力。
在人群中由物理的或神经的状态，或者各种疾病所引起的TBI，其重要性正在不断增加，因此，对用于治疗这种疾病及其后遗症有效并安全的药物有巨大的需求。
现在已惊奇地发现，化合物5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)-1，2，3，6-四氢-1-甲基吡啶在用于治疗TBI及其后遗症中，显示出有益的作用。
发明概述因此，本发明涉及5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)-1，2，3，6-四氢-1-甲基吡啶，或它的酸加成盐在制备用于治疗创伤性脑损伤或其后遗症的药物制剂中的应用。
在说明书和权利要求书中，名词“创伤性脑损伤(TBI)”意指包括与脑或脊髓创伤有关的所有病症，例如，由作用于脑底(Scull)或脊柱的物理力，局部缺血，中风，呼吸停止，心跳停止，脑血栓形成或栓塞，AIDS所致神经障碍，大脑出血，脑脊髓炎，脑积水，术后事件，脑感染，震荡或颅内压升高所引起的与脑或脊髓创伤有关的病症。
本发明所用的该化合物的可药用的酸加成盐，是以无毒的有机或无机酸形成的盐。这类有机盐的实例有下列有机酸形成的盐马来酸，富马酸，苯甲酸，抗坏血酸，双羟萘酸，琥珀酸，草酸，双-亚甲水杨酸，甲磺酸，乙二磺酸，乙酸，丙酸，酒石酸，水杨酸，柠檬酸，葡糖酸，乳酸，苹果酸，扁桃酸，肉桂酸，柠康酸，尺冬氨酸，硬脂酸，棕榈酸，衣康酸，乙醇酸，对-氨基苯甲酸，谷氨酸，苯磺酸，和茶叶碱乙酸，以及8-卤代茶叶碱，如8-溴代茶叶碱。这类无机盐的实例有以盐酸，氢溴酸，硫酸，氨基磺酸，磷酸和硝酸形成的盐。
现在已发现，本发明所用的化合物对治疗TBI是有用的。例如，它能改善中度创伤性脑损伤之后的识别能力，以及能够降低胆碱能神经元的损伤退化性减少。而且还发现，在被认为是临床适合的剂量下，它不引起有害的心博或其它的副作用。
另一方面，本发明提供了一种用于预防或治疗人TBI的方法，包括对需要这种治疗的病人给予治疗有效量5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)-1，2，3，6-四氢-1-甲基吡啶或其酸加成盐的步骤。
本发明所用的化合物及其可药用的酸加成盐，可通过任何适当的途经给药，例如口服或非经肠道给药，并且，该化合物还可以以任何适当的形式给药，例如以片剂，胶囊，粉剂或糖浆剂的形式，或者溶液或分散体的注射剂型。
本发明化合物或其可药用的盐，其有效的日剂量是10μg/kg体重-10mg/kg体重，优选的是25μg/日/kg体重-1.0mg/日/kg体重。因此，适合的日剂量是500μg/日-600mg/日，优选的是1.0mg/日-100mg/日。
本发明所用的化合物可按照EP-A10 296 721中所述的方法得到，其酸加成盐可通过本领域熟知的方法容易地制备。药理学通过如下公认的可靠方法，对本发明所用的化合物进行了测定TBI之后的识别功能按照Dixon.C.E等人J.Neurosurgery，67(1987)110-119所述的方法，使大鼠形成中枢流体冲击创伤性脑损伤。对受损伤的动物从受伤后24小时开始治疗，以生理盐水或5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)-1，2，3，6-四氢-1-甲基吡啶，以3.6μmol/kg或15μmol/kg的剂量，每日皮下注射给药1-15天。
按照Dixon et al 1987，同上文献的方法测定动物TBI后的翻正反射抑制。
在动物受损伤之前和受损伤后1-5天记录体重，并按照Hamm.R.J.等人J.Neurotreuma，11(1994)187-196中的方法，在受伤后1-5天测定动物旋转杆的能力。旋转杆试验可用于测定TBI后的运动能力。
最后，在受伤后11-15天，测定动物在Morris水迷宫中找到目标平台的平均消耗时间(+S.E.M.)。借助于ANOVA对此结果进行分析。在水迷宫试验过程中，对所有的动物在水迷宫测定前10分钟进行了注射治疗。
试验中还包括用于对比的假损伤动物(使动物受损伤，但未受到中枢流体冲击)。
TBI之后对ChAT神经元的定量测定如上所述使大鼠形成中枢流体冲击创伤性脑损伤，并进行治疗。以生理盐水(n＝5)或待测化合物(5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)-1，2，3，6-四氢-1-甲基吡啶，15μmol/kg)(n＝5)对动物作皮下注射。对假损伤大鼠也以生理盐水(n＝4)或待测化合物15μmol/kg(n＝4)注射(皮下)治疗。
如上所述测定翻正反射的抑制。
通过对前脑基底部胆碱乙酰转移酶(ChAT)免疫反应性神经元进行定量计数，可测定TBI之后胆碱能神经元的可能损失。在受损伤后15天(最后一次注射给药后的2-4小时)，将所有的动物用戊巴比妥麻醉(90mg/kg腹膜内注射)后，先用200-250ml等渗盐水，随后用以0.1M磷酸盐缓冲液配制的500ml 4.0％多聚甲醛/0.2％苦味酸，在室温下，以500ml/30分钟的速度作主动脉灌流。灌流完成之后，选取修整成二块脑组织，并在相同的溶液中，10℃后固定24小时。通过前脑各神经核，在振动切片机上切取40μm厚的冠状切片，并对每个核的第5片切片作ChAT免疫反应性处理。对平行的切片以结晶紫作Nissi体物质染色，用于定量测定前脑基底部神经核中胆碱能和非胆碱能神经元的任何可能的损失。
将前脑切片在以含有0.1％triton、X-100的0.01M磷酸盐缓冲盐水(PBS)配制的1.0μg/ml最终ChAT抗体浓度(1∶50)中作自由漂浮孵育。然后对前脑切片进行修整，并在培养板中，以第一抗体在室温下孵育24小时(4片/300μl/孔)。
在PBS中洗4次后，将这些切片在第二抗体(马抗小鼠IgG、VectorLaboratories，Burlingame，CA)中37℃孵育1小时。在PBS中洗3次后，以小鼠亲合素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)(Vector)技术(Hsu et al，J.Histochem.Cytochem29，1981，577-580)将切片在37℃孵育2小时。用PBS洗3次，用0.1M Tris缓冲盐水(TBI)洗1次之后，借助于Shu et al，Neurosci.Lert.85 1988，169-171所述的葡萄糖氧化酶-二氨基联苯胺-镍法、对自由漂浮的切片进行处理。通过将切片转移到TBS中使反应停止。将切片铺裱在明胶-铬明矾涂布的载玻片上，并使之在室温下干燥过夜，在递增浓度的乙醇和二甲苯中进行脱水，然后以Permount作盖玻片封片。
用微型计算机图象处理系统(MCID)(Imaging Research Inc.Ontario.Canada)，对中隔核(MSN)，对角带顶叶核(VDB)和外侧基底核中的ChAT免疫反应性神经元进行计数。把MSN和VDB之间的界面定义为前连合。NMB被定义为位于黄白球和内囊邻接部中的免疫标记神经元。从每只动物，对通过前脑各神经核0.2mm间隔得到的切片进行细胞计数。对于每个前脑神经核，细胞数目以每10000μm2的组平均数表示。
对于以结晶紫染色的平行切片，其MSN，VDB和NMB中的神经元也通过MCID进行计数。因为在全部胆碱能和非胆碱能神经元中，整个这些区域被结晶紫染色的神经元数量很多，所以，对每个神经核进行双侧样品神经元计数。将预先确定面积和网状方格尺用于每个神经核的细胞计数。对于MSN和VDB核，对每侧3个2000μm2的区域进行计数(这样，在被计数的4片切片中的每片切片，每个神经核取样的取样的总面积为12000μm2)。对于NMB，每侧计数一个12000μm2的区域(在被计数的4片切片中的每片切片，计数的总面积＝24000μm2)。仅对具有明显体细胞Nissi体的，并具有非常典型神经元细胞核的大细胞(直径＞20μm)作定量测定。结果TBI后，在受损伤的任何动物之间，翻正反射的抑制没有显著差异。这表明，在每次实验中，损伤组动物受到了同等程度的损伤。假损伤动物的翻正动作显著地快于TBI的任何动物(每一比较中P＜0.0001)。假损伤组动物翻正反射的抑制是由于损伤前所用的气体麻醉引起的。
在受伤组的任何动物之间，TBI后体重下降没有显著差异，再次表明受伤组动物有同等的损伤程度。
受损伤组的任何动物之间，在受损伤后1-5天旋转杆的能力没有显著差异。因为是在损伤后1-15天给予待测化合物，所以这些试验也表明，该药物对损伤后的体重或旋转杆能力没有影响。
ANOVA分析表明，每日以待测化合物注射(皮下)治疗的受损伤动物，在Morris水迷宫中比注射盐水治疗的受损伤动物有更好的表现。以待测化合物15μmol/kg治疗的受损伤动物，具有显著改善的能力，P＜0.01。
对于分别以盐水和待测化合物治疗的大鼠，TBI都引起了VDB和NMB中ChAT-1R神以元数量显著减少。但是，本发明化合物显著地降低了ChAT-1R神经元的损伤退化性减少(VDB中，与盐水治疗的受损伤组相比较，降低了32％，NMB中降低于51％)。结晶紫染色的平行切片显示，MSN，VDB或NMB中细胞数目未减少，表明ChAT-1R神经元的损失并不是由于细胞死亡所致。
制剂实施例本发明的药物制剂可通过本领域常规的方法制备。
例如片剂可通过将活性成分与通常的佐剂和/或稀释剂混合，然后在常用的压片机内将此混合物压片。佐剂或稀释剂的实例包括玉米淀粉，乳糖，滑石粉，硬脂酸镁，明胶，树胶等等。任何其它的佐剂或添加的色素，香料，防腐剂等，只要它们与该活性成分是可配伍的都可加入。
注射液可通过如下程序制备先将活性成分和可能的添加剂溶解于部分赋形剂中，优选的赋形剂是无菌水，并将此溶液校准至所需的体积，再将此溶液灭菌，然后灌装入适当的安瓿或药瓶中。还可以加入本领域常规使用的任何适合的添加剂，如渗压调节剂，防腐剂，抗氧化剂等。
本发明制剂的典型制剂实例如下(活性成分的量是以游离碱计算)1)片剂5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)1，2，3，6-四氢-120mg-甲基吡啶乳糖60mg玉米淀粉30mg羟丙基纤维素2.4mg微晶纤维素 19.2mgA型Croscarmellose钠 2.4mg硬脂酸镁0.84mg2)片剂5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)1，2，3，6-四氢-110mg-甲基吡啶乳糖46.9mg玉米淀粉23.5mg聚烯吡酮1.8mg微晶纤维素 14.4mgA型Croscarmellose钠 1.8mg硬脂酸镁0.63mg3)糖浆剂5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)1，2，3，6-四氢-15.0mg-甲基吡啶山梨醇 500mg羟丙基纤维素15mg甘油50mg对羟苯甲酸甲酯 1mg对羟苯甲酸丙酯 0.1mg乙醇0.005ml芳香剂 0.05mg糖精钠 0.5mg水 加至1ml4)溶液5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)1，2，3，6-四氢-11.0mg-甲基吡啶山梨醇 5.1mg乙酸0.08mg注射用水加至1ml
权利要求
1. 5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)-1，2，3，6-四氢-1-甲基吡啶或其可药用的酸加成盐在制备用于治疗创伤性脑损伤药剂中的应用。
2.根据权利要求1的应用，其特征在于所制备的药剂含有单位剂量形式的5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)-1，2，3，6-四氢-1-甲基吡啶或其可药用的酸加成盐。
3.根据权利要求1的应用，其特征在于所制备的药剂含有500μg-600mg/日，优选地为1.0mg-100mg/日剂量的5-(2-乙基-2H-四唑-5-基)-1，2，3，6-四氢-1-甲基吡啶或其可药用的酸加成盐。
4.根据权利要求1-3中任一权项的应用，其特征在于所制备的药剂用于治疗由作用于脑底或脊柱的物理力，局部缺血，中风，呼吸停止，心跳停止，脑血栓形成或栓塞，AIDS所致神经障碍，大脑出血，脑脊髓炎，脑积水，术后事件，脑感染，震荡或颅内压升高所引起的创伤性脑损伤，和/或用于治疗这样一种病症的后遗症。
全文摘要
式(Ⅰ)化合物5－(2－乙基－2H－四唑－5－基)－1,2,3,6－四氢－1－甲基吡啶,能改善创伤性脑损伤动物的识别能力,并能降低胆碱能神经元损伤退化性减少,因此可用于制备治疗创伤性脑损伤的药剂。
文档编号A61K31/44GK1207039SQ9619946
公开日1999年2月3日 申请日期1996年11月5日 优先权日1996年11月5日
发明者B·R·派克 申请人:H·隆德贝克有限公司