百里醌在制备防治癫痫持续状态脑损伤的药物中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及化合物的新制药用途，具体地说，涉及百里醌在制备防治癫痫持续状 态脑损伤的药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 癫痫持续状态(status epilepticus，SE)是指癫痫连续发作之间意识未完全恢复 又频繁再发，或发作持续30分钟以上不自行停止。癫痫持续状态能产生永久性的脑损伤，一 次癫痫大发作持续状态能将患者的认知功能降低8 %~26 %。临床研究发现癫痫持续状态 患者存在与发作相关的神经功能缺损并有相应的影像学改变，如T2WI高信号及脑萎缩。病 理学研究也证实了癫痫持续状态患者及动物模型上存在海马、边缘系统、皮层及小脑的病 理改变。
[0003] 百里醌（thymoquinone，TQ)是近年来从黑种草籽中分离出来的主要有效单体，分 子式为Ci〇Hi2〇2，分子量为164.2，化学结构式如下：
[0005] 百里醌具有多种生物活性，千百年来应用于高血压、哮喘、痢疾及湿疹等疾病的治 疗。然而目前关于百里醌在防治癫痫持续状态脑损伤中的作用还未见报道。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供百里醌的新用途。
[0007] 第一方面，提供了百里醌在制备防治癫痫持续状态的药物中的应用。
[0008] 第二方面，提供了百里醌在制备防治癫痫持续状态脑损伤的药物中的应用。
[0009] 第三方面，提供了百里醌在制备改善癫痫持续状态的脑电、癫痫发作等级和/或学 习记忆能力的药物中的应用。
[0010] 第四方面，提供了百里醌在制备试剂中的应用，所述的试剂用于：
[0011] a)降低癫痫持续状态导致的死亡率；
[0012] b)降低癫痫持续状态大鼠模型的脑电图发作潜伏期及总功率；
[0013] c)降低癫痫持续状态大鼠模型的Racine分级；
[0014] d)改善癫痫持续状态大鼠模型的学习记忆能力;和/或
[0015] e)促进癫痫持续状态大鼠模型抗氧化分子Nrf 2、H0-1及S0D的表达。
[0016] 本发明优点在于：
[0017] 本发明观察了百里醌对癫痫持续状态大鼠脑损伤的影响，结果表明：化学点燃癫 痫持续状态前给予百里醌能够有效降低癫痫持续状态导致的动物死亡;与癫痫持续状态组 相比，百里醌组脑电图发作潜伏期及总功率明显下降，Racine分级较癫痫持续状态组亦明 显下降，在水迷宫实验中潜伏期较癫痫持续状态组明显下降，在避暗试验中穿梭潜伏期较 癫痫持续状态组明显下降，Nrf2、H0-l及SOD表达明显升高。以上结果证实了百里醌能够改 善癫痫持续状态的脑电、癫痫发作等级及学习记忆能力，具有防治癫痫持续状态脑损伤的 作用，且其防治效果非常显著。
【附图说明】
[0018]图1.脑电图结果。
[0019] 图2.Racine分级结果。
[0020]图3.水迷宫和避暗实验结果。
[0021] 图4.Nrf2、H0-l及S0D表达的测定结果。
【具体实施方式】
[0022]下面结合附图对本发明提供的【具体实施方式】作详细说明。
[0023] 实施例1 [0024] 1研究方法
[0025] 1.1建立普鲁卡品-氯化锂诱导的癫痫持续状态大鼠模型
[0026] 雄性SD大鼠，160-180g。大鼠腹腔注射氯化锂（3mg/kg)，20h后再腹腔注射匹鲁卡 品（30mg/kg)。注射匹鲁卡品后约15min左右大鼠会出现发作行为，发作的记录和等级依照 Racine评分标准:0级:无任何反应;1级:行为固定，面肌抽搐;2级：点头和湿狗样动作;3级： 双侧前肢阵挛;4级:前肢阵挛和后肢站立;5级:站立并摔倒。大鼠出现连续的四级以上发作 持续60分钟后，给予地西泮（10mg/kg)终止发作。建模时对照组腹腔注射给予等量生理盐 水。造模前两天，给予大鼠糊状食物。
[0027] 1.2实验分组及处理方法
[0028]实验分为三组:正常对照组、癫痫持续状态组(model组)和癫痫持续状态百里醌干 预组(简称百里醌组，TQ组）（11 = 11)<^〇组在注射匹鲁卡品前2411及111共两次腹腔注射百里 醌（l〇mg/kg/次）model组则给予等量生理盐水。采用神经电生理及行为学方法(水迷宫、避 暗实验）观察其对癫痫持续状态大鼠脑电、发作等级及学习记忆能力的影响，同时采用 western-blot方法观察百里醌对氧化应激通路Nrf 2、Η〇-1及S0D表达的影响。
[0029]神经电生理实验:造模前24h及造模中分别进行脑电图测定。10%水合氯醛腹腔麻 醉后，将其背位固定于立体定位仪上，切开眼-耳间中线皮肤，剥离骨膜，暴露颅骨，调整标 准头位，根据脑图谱，用骨钻在前囟（2mm，2mm)，（2mm，-2mm)，（-10mm，0mm)处各钻一孔，各孔 仅钻透颅骨，勿伤及脑膜。分别在前肉处安放记录电极、参考电极和0线电极，然后将两个电 极用牙托粉固定于颅骨上，术后三天即可进行造模并进行脑电图测定。大鼠安静、自由活动 时采用上海诺诚公司无线蓝牙小动物脑电图仪(上海诺诚BT-8数字化脑电图仪)进行脑电 采集，记录发作潜伏期、发作总功率(功率包含了 EEG的频率和幅度双重因素）。采用视频摄 像机记录大鼠行为学变化，根据Racine分级测定发作行为。
[0030]水迷宫实验:造模前48h及造模后48h进行行为学测定。本实验装置主要是一直径 为100cm、高度为50cm的ABS工程塑料做成的内壁、底部均为黑色的圆形水池。池内水深 30cm，水温控制在24-26Γ。由于实验小鼠均为黑色，水池内倒入脱脂奶粉将小鼠显出以便 软件跟踪识别。池壁上标有东南西北四个入水点，将水池分为四个象限，一直径为5cm的可 移动的白色透明圆形平台在实验时被固定在目标象限的中央，并埋于水下lcm。每个象限均 贴有一不同形状的标记，以便给小鼠提供视觉线索帮助其找到平台。平台的位置在整个定 位航行实验中都是固定的，是小鼠在水中唯一的逃生处，所以它们不得不定位寻找这隐藏 于水下的平台。实验主要由连续5天的定位航行实验和第6天的空间探索实验组成。定位航 行实验:连续练习5天，每天训练4次，每次训练间隔为15-20分钟。训练开始时，随机选择一 象限(除外目标象限），将小鼠面向池壁放入水中，让其在水中游泳寻找平台，最大时限为60 秒，小鼠寻找到平台所需的时间记录为逃避潜伏期。如果小鼠未能在60秒内找到平台，则用 一树枝将其轻柔引导至平台，使其在平台上停留10秒，逃避潜伏期记为60秒。第6天将平台 撤除，进行空间探索实验。造模后仅进行空间探索实验。
[0031]避暗实验:利用大鼠具有趋暗避明的习性设计装置，一半是暗室，一半是明室，中 间有一小洞相连。暗室底部铺有通电的铜栅。动物进入暗室即受到电击。将大鼠放入明箱， l〇s后，将明暗箱之间的门打开。大鼠会很快进入暗箱。大鼠（四肢)完全进入暗箱后，立即将 中门关上，并给予一次电击。电击强度为能引起大鼠退缩和发声的最小电流。持续1~2s。让 大鼠在暗箱内停留l〇s(以使让动物形成箱与电击之间的关联），将大鼠放回笼内。清洁操作 箱。记忆保持测试(re tent i on te st)电刺激训练24h后，将大鼠放回明箱，中门打开，但不给 电击。观察时间、穿梭次数、潜伏期等指标。
[0032] 2研究结果 [0033] 2.1造模结果
[0034] model组造模过程死亡大鼠2只，其余11只大鼠造模成功;TQ组未有大鼠死亡，11只 大鼠全部造模成功。
[0035] 2.2神经电生理实验结果
[0036]脑电图结果显示：与model组相比，TQ组脑电图发作潜伏期及总功率明显下降（p〈 0.05)(图 1)。
[0037] 2 · 3Racine 分级结果
[0038] 大鼠点燃后，根据Racine分级显示，model组发作等级集中在4和5级，而TQ组多分 布于2-3级，TQ组发作强度明显小于model组(p〈0.05)(图2)。
[0039] 2.4水迷宫和避暗实验结果
[0040]避暗实验结果显示TQ组潜伏期较model组明显缩短，具有统计学意义。水迷宫实验 结果显示，TQ组潜伏期较model组明显缩短。说明TQ组较model组具有更好的学习记忆能力 (图 3)。
[0041 ] 2 · 5氧化应激通路Nrf2、H0-l及S0D测定
[0042] 结果发现TQ组脑内皮层及海马Nrf2、H0-l及S0D的表达水平明显高于model组(p〈 0.05)(图4)。
[0043] 3 讨论
[0044] 以上研究发现，化学点燃癫痫持续状态前给予百里醌，能够有效降低癫痫持续状 态导致的动物死亡，并且明显降低癫痫发作等级。学习记忆相关的行为学结果同样证实了 百里醌的保护作用，TQ组在水迷宫及避暗实验中具有更好的学习记忆能力。同时我们发现 百里醌能有效提高脑内抗氧化系统如Nrf 2、H0-1及SOD的水平，其抗氧化应激能力与Nrf 2通 路密切相关。以上研究表明百里醌可以保护癫痫持续状态导致的脑损伤。
[0045]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人 员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为 本发明的保护范围。
【主权项】
1. 百里醌在制备防治癫痫持续状态的药物中的应用。2. 百里醌在制备防治癫痫持续状态脑损伤的药物中的应用。3. 百里醌在制备改善癫痫持续状态的脑电、癫痫发作等级和/或学习记忆能力的药物 中的应用。4. 百里醌在制备试剂中的应用，其特征在于，所述的试剂用于： a) 降低癫痫持续状态导致的死亡率； b) 降低癫痫持续状态大鼠模型的脑电图发作潜伏期及总功率； c) 降低癫痫持续状态大鼠模型的Racine分级； d) 改善癫痫持续状态大鼠模型的学习记忆能力； e) 促进癫痫持续状态大鼠模型抗氧化分子Nrf 2、H0-1及SOD的表达。
【专利摘要】本发明涉及百里醌在制备防治癫痫持续状态脑损伤的药物中的应用。本发明观察了百里醌对癫痫持续状态大鼠脑损伤的影响，发现化学点燃癫痫持续状态前给予百里醌能够有效降低癫痫持续状态导致的动物死亡，可使动物脑电图发作潜伏期及总功率明显下降，Racine分级明显下降，在水迷宫实验和避暗实验中的潜伏期明显下降，以及Nrf2、HO-1和SOD表达明显升高。以上结果证实百里醌能够改善癫痫持续状态的脑电、癫痫发作等级及学习记忆能力，具有防治癫痫持续状态脑损伤的作用，且其防治效果非常显著。
【IPC分类】A61K31/122, A61P25/28, A61P25/08
【公开号】CN105616392
【申请号】CN201610185760
【发明人】陈英辉, 邵一叶, 李炳, 罗琼, 谢阳梅
【申请人】复旦大学附属金山医院
【公开日】2016年6月1日
【申请日】2016年3月29日