用于治疗脑损伤或中风的试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明关于一种用于治疗脑损伤或中风的方法或试剂盒。
【背景技术】
[0002]缺血性中风是残疾和死亡的一个主要原因。预防和有效治疗缺血性中风极为重要。缺血性脑损伤会造成一系列的病理反应，包括局部严重炎症的积累、自由基，和不可逆的神经细胞死亡。于缺血半影区的细胞凋亡的进展是可逆的。在缺血半影区的神经细胞大多是功能受损的，但若能及时治疗是可修复的。目前对于中风的预防或治疗并无有效的药物或药物疗法。
[0003]中风是由于供应大脑的血管阻塞或出血引起的(Kriz，J.andLalancette-Hebert, Μ.2009.Acta Neuropathol.(Berl).117,497-509 ；Lakhan, S.Ε.etal.2009.Journal of Translat1nal Medicine 7，97.Review)，是全世界第二常见的死因(Donnan GA et al.2008.Stroke Lancet.10 ；371 (9624):1612-23.Review)。缺血性中风占所有中风案例的 80 % 以上(Candelar1-Jalil, E.2009.Current Opin1n inInvestigat1nal Drugs 10,644-654)。缺血性脑损伤会诱发一连串的分子事件，其导致脑损伤，包括兴奋性胺基酸毒性、活性氧生成、发炎和细胞凋亡的分子反应(Lakhan，S.E.etal.2009.Journal of Translat1nal Medicine 7, 97.Review) o 大脑缺血性中风后，可根据损伤区的剩余血液供应量，区分两大损害区域。脑损伤的核心区将完全无血液供应且会有几乎完全性的能量衰竭，因而导致坏死。另一称半影区，围绕核心区域，传统上定义为在闭塞期间轻度至中度脑血流量减少的区域(Lo，E.H.2008.Nat.Med.14，497-500)。因此，临床医生会以半影区当作标的进行介入疗法，用以拯救脑组织和减少中风后残疾(Lakhan, S.E.et al.2009.Journal of Translat1nal Medicine 7, 97.Review)0 尽管有众多专注于神经保护的候选药物的研宄，但因为体内毒性或缺乏疗效，还没有任何一种药物通过所有阶段的临床试验(Green, A.R.and Shuaib, A.Drug Discov.Today.2006Aug ；
11(15-16)，681-93.Review)。尤其是，明显缺乏保护大脑免受中风后恶化的疗法。
【发明内容】
[0004]本发明是基于一不可预期的发现，一个用以采样大脑中目标分析物的传统诊断工具一脑微透析一能有效地减少梗塞体积，促进大脑中动脉闭塞(middle cerebral arteryocclus1n, MCAo)造成的脑缺血实验鼠的行为恢复。另一方面，酸性纤维母细胞生长因子(acidic fibroblast growth factor，aFGF)，一种神经保护和神经再生的神经系统的因子，也被发现能剂量依赖性地降低了缺血诱发的脑梗塞和改善MCAo老鼠的功能恢复。
[0005]因此，在一方面，本发明提供一种用于治疗有其需求的个体的脑损伤或中风的方法，包含:植入一微透析探针于该个体的受损或受伤核心，并以溶于生理上可接受缓冲液的渗透压剂灌注该探针，其中该微透析探针包含一带有截留分子量低于该渗透压剂的分子量的透析膜。
[0006]另一方面，上述方法可以进一步包含:施予个体溶栓药物以及/或神经保护剂，如酸性纤维母细胞生长因子(aFGF)。
[0007]另一方面，本发明提供一种用于治疗脑损伤或中风的试剂盒，包含:一瓶灌流缓冲液，其包含一生理上可接受缓冲液及一溶于其中的渗透压剂；以及一微透析探针，包含一透析膜，其截留分子量低于该渗透压剂的分子量。
【附图说明】
[0008]连同附图阅读能帮助了解前面的概述以及接下来的详细描述，在附图中:
[0009]图1 (A)示意一个典型的微透析探针放置在脑缺血鼠的受损核心区。图1 (B)中提供在缺血再灌流后2、4、6小时于缺血脑中进行治疗性微透析疗法的方法。
[0010]图2㈧至图2 (C)显示治疗性微透析治疗脑缺血大鼠的脑梗塞的时间间隔和持续时间的功效；其中图2(A)提供缺血的脑组织的TTC染色影像的代表影像(脑损伤后4小时，开始进行或没有开始进行微透析治疗)，其中TTC染色阳性表示存活的大脑组织；以及图2(B)及图2(C)分别提供脑缺血老鼠的梗塞体积(mm3)及梗塞面积/脑面积的大小百分比(各两只老鼠)；其中该脑缺血老鼠于受损2小时或4小时后被植入微透析探针，并灌流含有或不含有aCSF土BSA的溶液三小时。老鼠在微透析实验一天后被牺牲。
[0011]图3(A)至图3(C)显示于受损后2小时，开始治疗性微透析可有效地降低缺血诱发的脑梗塞，其中图3(A)提供MCAo老鼠于受损I周后的脑切片的代表性TTC染色影像；其中阴性TTC染色区域代表于缺血脑中的梗塞区域；以及图3(B)及图3(C)分别提供于I周再灌流后的缺血脑组织的梗塞体积(_3)及梗塞面积/脑面积(％);其中该梗塞面积/脑面积)代表于脑缺血老鼠中损伤体积相较于全大脑的比率。资料是以平均值土SEM表示。(a:P<0.001，假处理 vs.aCSF/BSA ；b:P<0.001，aCSF vs.aCSF-BSA 以单因子变异数分析法(one way ANOVA)及Bonferroni t测试法进行分析)。
[0012]图4㈧至图4(C)显示以治疗性微透析截取MCAo鼠脑所释放的谷胺酸及乳酸至透析液中的功效，以及受损I周后大脑的蛋白质表达情形，其中图4(A)提供MCAo老鼠于脑受损后2-5小时间于微透析液中的谷胺酸浓度；其中微透析液是每15分钟收集一次，收集3小时；图4(B)显示MCAo老鼠于脑受损后2-5小时间的微透析液中乳酸释放情形；及图4(C)显示于脑缺血受损I周后的鼠脑切片的western blot分析结果，其中MAP-2 (微管相关蛋白 2 (microtubule associated protein 2)的简称)为一神经元指标、EDI (CD68)代表活化的微胶细胞/巨.细胞、GAP43(亦称神经调节蛋白(neuromodulin))代表新生合成的神经突、GFAP(胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein)的简称)为一星状胶质细胞指标、及MBP (髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein)的简称)为髓鞘形成寡突细胞的指标。**:P<0.0LaCSF vs.aCSF-BSA以单因子变异数分析法(one way ANOVA)及Bonferroni t测试法于相同间隔进行分析。
[0013]图5(A)至图5(B)显示治疗性微透析治疗可改善MCAo老鼠的行为功能，其中图5(A)提供经脑缺血中风后存活I周的老鼠的神经缺损分数，是以神经缺损评分法使用五点计分方式评估；以及图5 (B)提供MCAo老鼠的握力，藉由握力试验评估MCAo老鼠的右前肢(未受影响侧)及左前肢(中风影响侧)的功能。资料是以平均值土SEM表示(η代表每组的老鼠数目；a:P<0.05，假处理 vs.aCSF/BSA ；b:P<0.05，aCSF vs.aCSF/BSA 以单因子变异数分析法(one way AN0VA)及Bonferroni t测试法进行分析)。
[0014]图6 (A)至图 6(D)显不人类血清白蛋白(human serum albumin，HSA)与 BSA —样有效可作为渗透压剂，用于MCAo老鼠的治疗性微透析；其中图6㈧及图6(B)分别提供经再灌流I周后的缺血脑组织的梗塞体积(_3)及梗塞体积/脑(％ );其中该梗塞体积/脑(％)意指受损体积相较于全大脑的比率，使用MCAo+假处理作为100%;图6(C)提供神经缺损分数；以及图6(D)提供握力，其是以握力试验评估MCAo老鼠的右前肢(未受影响侧)及左前肢(中风影响侧)。资料是以平均值土 SEM表示(η代表每组的老鼠数目；a:Ρ〈0.05，假处理 vs.aCSF-BSA ；b:P<0.05，aCSF vs.aCSF-BSA 以单因子变异数分析法(oneway ANOVA)及Bonferroni t测试法进行分析)。
[0015]图7(A)至图7(H)为观察到的皮质区域影像，其中有标记缺血边界区域(中间梗塞区域)。NeuN免疫反应性(immunoreactive，IR)细胞代表神经元细胞；ED_1，一种活化的微胶细胞/巨噬细胞指标。图7(A)至图7(D)为缺血核心区域附近的脑切片，以抗NeuN抗体进行免疫染色，其中图7 (A)为源自MCAo+假处理组的脑切片、图7 (B)为源自MCAo+aCSF组的脑切片、图7(C)为源自MCAo+aCSF-BSA组的脑切片、及图7(D)为源自MCAo+aCSF-HSA组的脑切片、及图7(E)至图7(H)为使用抗EDl进行免疫染色的脑切片；其中图7(E)为源自MCAo+假处理组的脑切片、图7(F)为源自MCAo+aCSF组的脑切片、图7(G)为源自MCAo+aCSF-BSA组的脑切片、及图7(H)为源自MCAo+aCSF-HSA组的脑切片。
[0016]图8 (A)至图8 (D)显示于受损6小时后使用治疗性微透析介入疗法可有效降低缺血诱发的脑梗塞，其中图8(A)显示于再灌流I周后的缺血脑组织中所评估的梗塞体积；图8(B)显示梗塞体积/大脑体积(％)，指出损伤体积相较全大脑的比率，以MCAo+假处理作为100% ;图8(0显示神经缺损分数；图8(D)提供大脑缺血性中风老鼠的握力。握力是以握力试验评估MCAo老鼠的右前肢(未受影响侧)及左前肢(中风影响侧)。资料是以平均值土SEM表示，每组超过11只老鼠。林: