专利名称：一种干扰Survivin表达的siRNA分子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可干扰Survivin表达的siRNA分子、及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术：
Survivin(存活素)是凋亡抑制蛋白(Inhibitorofapoptosis，IAP)家族的新成 员，是目前发现最强的凋亡抑制因子。Survivin功能复杂，具有抑制细胞凋亡，促进细胞转 化并且参与细胞的有丝分裂、血管的生成和肿瘤细胞耐药性的产生等作用。Survivin基因 是Ambrosini等(Nature Med, 1997, 3 (8) :917_921)在人类基因组文库中筛选克隆到的， 该基因全长15KB，定位于17q25，含4个外显子和3个内含子，Survivin基因编码产物是由 142个氨基酸组成的蛋白，分子量16. 2KD。研究显示，Survivin的高表达能抑制多种因子如 p53,caspases等诱导的细胞凋亡。经转基因技术证实Survivin抑制凋亡的机制与IAP家 族其它成员一样，可直接作用于细胞色素C从线粒体向胞质释放的过程的末期。现已发现， Survivin基因在胚胎组织及恶性肿瘤中普遍表达，如乳腺癌、胃癌、肾癌、黑色素癌、肠癌、 神经母细胞癌和卵巢癌等；但在分化成熟的组织(除胎盘、增殖期子宫内膜、分泌期子宫内 膜有微量表达外)及癌旁正常组织中无表达。它的这一特性，使得靶向Survivin的免疫治 疗和基因治疗能够促进肿瘤细胞的凋亡，抑制其增殖，正常组织却能不受损伤和影响。RNA干扰技术是近几年来兴起的生物技术，该项技术的发现为疾病治疗尤其是癌 症的治疗开辟了全新的途径，为科研工作者提供了一个全新的基因治疗理念。用siRNA 干扰特定基因的表达是基因治疗的重要组成部分。RNA干扰(RNA interference, RNAi) 是由双链RNA (double-stranded RNA, dsRNA)引发的转录后基因沉默机制。其原理是 RNase III核酶家族的Dicer，与双链RNA结合，将其剪切成21_23nt及3'端突出的小干 扰 RNA(smallinterfering RNA, siRNA)，随后 siRNA 与 RNA 诱导沉默复合物(RNA-induced silencingcomplex, RISC)结合，解旋成单链，活化的RISC受已成单链的siRNA引导，序列 特异性地结合在靶mRNA上并将其切断，引发靶mRNA的特异性分解，从而阻断相应基因表达 的转录后基因沉默机制。RNAi已作为一种简单有效的基因敲除的技术，广泛地应用于功能 基因组学研究以及抗病毒、抗肿瘤治疗的研究中。目前针对Survivin的RNA干扰研究进展迅速，体外实验显示了良好的效果。有 很多文献报道，用RNA干扰的技术来抑制Survivin基因的表达，Carvalho等用小分子干扰 RNA(small interfering RNA，siRNA)转染HeLa细胞，60h后蛋白印迹结果显示治疗组中 已检测不到Survivin的表达，细胞增殖明显受抑，部分细胞有丝分裂受到阻滞，出现凋亡 (J Cell Sci,2003,116(14) =2987-2998) 应用 RNA 干扰技术，用靶向至 Survivin 基因的 siRNA作为靶向药物，在基因的转录后进行干扰，从而诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞的 有丝分裂，抑制肿瘤转移时的血管形成和降低肿瘤细胞放化疗的耐受性，对肿瘤进行抑制， 在不久的将来可能成为一种新的肿瘤治疗方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过SiRNA分子库技术筛选出的可干扰Survivin表 达的双链siRNA分子，其下述正义链和反义链组成正义链5，-UCCUUUCU⑶CAAGAAGCAGUUNn-3，(SEQID NO 2)反义链5，-AACUGCUUCUUGACAGAAAGGANn-3，(SEQID NO 3)其中，N是4种DNA碱基及其脱氧形式中的任何一种，即胞嘧啶C、鸟嘌呤G、腺嘌呤 A、胸腺嘧啶T、脱氧胞嘧啶dC、脱氧鸟嘌呤dG、脱氧腺嘌呤dA或脱氧胸腺嘧啶dT ;n是0 2的整数。换句话说，该双链siRNA分子的主干序列为正义链5，-UCCUUUCU⑶CAAGAAGCA⑶U-3，(SEQID NO 4)反义链5，-AACUGCUUCUUGACAGAAAGGA-3，(SEQID NO 5)在一个优选的实施方式中，上述序列中3’端的“Nn”是两个脱氧胸腺嘧啶dTdT。本发明的另一目的在于提供上述siRNA分子在制备抗肿瘤药物中的应用。体外实验证明，本发明的siRNA分子的反义链可特异性地与Survivin基因的mRNA 结合，降解mRNA，从而干扰转录后翻译过程，诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞分裂、抑制肿 瘤血管的生成，达到治疗肿瘤的目的。
图1是合成的Survivin基因开放阅读框琼脂糖凝胶电泳检测图，制备得到的DNA 片段大小为429bp。右侧条带是Marker (标准参照)。图2是siRNA分子库构建流程示意图。图3是TO-siRNA转录模板-Hl表达框结构示意图。图4是PCR制备的TO-siRNA转录模板-Hl表达框纯化后琼脂糖凝胶电泳检测图。 图中，最左侧条带是Marker(标准参照)；siRNA2是本发明的22bp的siRNA ；而siRNAl、 siRNA3分别是从siRNA分子库中筛选得到长度为19bp和23bp的另外两个siRNA。图5是表达框转染细胞后实时定量PCR检测Survivin mRNA表达量柱形图， 纵坐标表示Survivin相对于GAPDH的mRNA表达水平；横坐标表示各处理实验组，其中 siRNAl-siRNA8为siRNA转染的8个实验组，“未转染”为正常细胞未转染组。图6是化学合成的siRNA转染细胞后实时定量PCR检测Survivin mRNA表达量柱 形图，纵坐标表示Survivin相对于GAPDH的mRNA表达水平；横坐标表示两个处理实验组， 其中siRNA2为本发明的siRNA转染实验组，“未转染”为正常细胞未转染组。
具体实施例方式为方便起见，在下文中，术语“siRNA”、“siRNA序列”或“siRNA分子”可以互换，它 们表示的意思和范围相同。其中，siRNA序列可以是单链结构，也可以是双链结构。本发明的siRNA分子来源于针对Survivin基因开放阅读框的功能保守区而制备 的siRNA分子库，本发明所用siRNA分子库技术是百奥迈科生物技术有限公司的专利技术 (中国发明专利申请号为=200710024217. 6，专利名称PCR高通量构建siRNA全位点分子
4库制备方法)，其优点在于所制备得到的siRNA随机分布于Survivin开放阅读框区段，长度 可控性分布于19-23bp，可以提高有效靶位点的命中率。siRNA的制备可采用多种方法，比如化学合成法、体外转录、酶切长链dsRNA、载 体表达siRNA、PCR合成siRNA表达元件等，这些方法的出现为研究者提供了可选择的空间， 可以更好地获得基因沉默效率。本发明的siRNA分子可以作为抗肿瘤药物的有效成分。肿瘤疾病包括肝癌、肺癌、 白血病、胃癌、宫颈癌、多发性骨髓瘤、皮肤鳞癌、结肠癌、黑色素瘤、膀胱癌、骨肉瘤。本发明 的药物对肝癌的抑制作用尤其明显。作为该siRNA分子的一种表达形式，可将其制备成DNA表达框形式，比如启动 子-siRNA转录模板-Hl启动子。为简要起见，在下文中将“TO启动子-siRNA转录模板-Hl启动子”简写为 "U6-siRNA转录模板-Hl，，或“U6-siRNA_Hl，，，它们表示的意思和范围相同。出于应用目的，可将siRNA分子、表达siRNA分子的DNA表达框、或者包含siRNA 分子表达框的质粒作为药物直接给药于受药者身上特定部位，比如肿瘤组织。本发明的药物的剂型可以为多种形式，只要适合于相应疾病的给药、并且恰当地 保持siRNA分子的活性。比如，对于注射用给药系统，剂型可以是冻干粉。任选地，上述药物剂型中可以包含任何药学可接受的辅助剂，只要其适合于相应 的给药体系、并且恰当地保持siRNA分子的活性。为了实现本发明的设计思想并验证筛选得到的siRNA的抗肿瘤效果，设计了如下 实验方案(1)构建凋亡抑制因子Survivin基因开放阅读框的siRNA分子库，该分子库中包 含靶向至Survivin基因的siRNA效应分子，长度分布于19_23bp。(2)制备具有相应效应的siRNA表达框，其结构为U6启动子-siRNA转录模板-Hl 启动子，使其更易于体外筛选。(3)运用实时定量PCR技术，检测上述siRNA表达框在细胞中转录出的效应siRNA 分子对Survivin基因的抑制作用。(4)化学合成上述方法筛选得到的最优靶点siRNA，在体外细胞实验中进一步运 用实时定量PCR技术检测Survivin基因的mRNA表达水平。下述实施例仅用于阐明本发明，并非是对本发明进行限制。需要说明的是，如无特别注明，下述实施例中的百分比含量皆为重量百分含量
Wt %。实施例1siRNA分子库的制备1.主要仪器、试剂和材料1. 1 仪器=PCR 仪(ABI 公司)；电转仪(BIO-RAD，MicroPulser)；离心机 (Eppendorf)，长波长紫外灯等。1.2 材料和试剂lkb plus DNA Ladder (invitrogen) ；DNase I (Roche)； MnCl2(BBI)；磷酸接头(Sigma-aldrich) ；ATP (BBI) ；BSA (NEB) ；BmsbI (NEB) ；T4 DNA连接酶 (NEB) ；Tag DNA聚合酶(百奥迈科生物技术有限公司)；琼脂糖(BBI) ；dNTP(上海生工生物工程技术服务有限公司)；酚氯仿抽提试剂(上海生工生物工程技术服务有限公司)；低分 子量DNA Ladder (NEB) ；EcoPl5I (NEB) ；T4 DNA聚合酶(NEB) ；FokI 酶(NEB) ；SfiI 酶(NEB)； 感受态细胞(invitrogen) ；pTOHl-GFP表达载体(NT 0imcs，USA)。凝胶抽提试剂盒QIAEX II Gel Extration Kit(QIAGEN)；质粒抽提试剂盒(百奥迈科生物技术有限公司)。其他 生化试剂均购于Sigma-aldrich。2. siRNA分子库的构建2. lSurvivin基因开放阅读框的获得由百奥迈科生物技术有限公司全基因合 成 Survivin(GenBank Accession number :ΝΜ_001168)开放阅读框(ORF)，基因长度为:
429bp (图 1),3
122atgggtgccccgacgttgccccctgcctggcagccctttctcaaggaccaccgcatctc
181tacattcaagaactggcccttcttggagggctgcgcctgcaccccggagcggatggccga
241ggctggcttcatccactgccccactgagaacgagccagacttggcccagtgtttcttctg
301cttcaaggagctggaaggctgggagccagatgacgaccccatagaggaacataaaaagca
361ttcgtccggttRCRCtttCCtttctRtcaaRaaRcaRtttgaagaattaacccttggtga
421atttttgaaactggacagagaaagagccaagaacaaaattgcaaaggaaaC C 3.3. C 3.3. 3.3.
481gaagaaagaatttgaggaaactgcggagaaagtgcgccgtgccatcgagcagctggctgc
541catggattga(SEQ ID NO 1)
2. 2siRNA分子库构建用百奥迈科生物技术有限公司的专利技术构建siRNA分子
库(专利申请号为200710024217.6，专利名称PCR高通量构建siRNA全位点分子库制备 方法)，构建流程见图2。成功构建Survivin开放阅读框的siRNA分子库，随机挑取克隆进行测序，其序列 长度可控性分布在19-23bp之间，显示出位点及长度的多样性。实施例2siRNA表达框的制备与靶位点筛选1.主要仪器、试剂和材料1. 1仪器PCR仪(ABI)；实时定量PCR仪(Bio-Rad)；凝胶电泳设备(北京六一仪 器厂)；长波长紫外灯；细胞培养箱(Thermo)等。I·2 材料和试剂Ikb plus DNA Ladder (invitrogen) ； Pfu DNA 聚合酶(百奥迈 科生物技术有限公司)；Agar0se(BBI) ；dNTP(上海生工生物工程技术服务有限公司)；琼 脂糖凝胶纯化试剂盒(百奥迈科生物技术有限公司)，Lipofectamin 2000 (invitrogen), DMEM J^ # S (Gibco), TurboCapture mRNA kit (QIAGEN), SensiMix One-Step Kit(Quantace)等。其他生化试剂均购于上海生工生物工程技术服务有限公司。1. 3PCR引物(百奥迈科生物技术有限公司合成)5，U6 启动子引物5，-AAGGTCGGGCAGGAAGAGGGC-3，3，Hl 启动子引物5，-TATTTGCATGTCGCTATGTGTTCT-3，Survivin 正向引物5，-CGACGTTGCCCCCTGCCTG-3，Survivin 反向引物5，-AAGGAAAGCGCAACCGGACGA-3，GAPDH 正向引物5，-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3，GAPDH 反向引物5，-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3，
6
2. siRNA表达框的制备2. IPCR扩增制备U6-siRNA转录模板-Hl表达框选取8例Survivin siRNA阳性 克隆质粒为模板，用高保真酶Pfu DNA聚合酶通过PCR的方法扩增制备TO-siRNA转录模 板-Hl表达框(图3为表达框示意图)。各PCR反应体系为50 μ 1反应体系0. 5 μ 1模板DNA(10_50ng)，1 μ 1 5，U6启动 子引物(ΙΟμΜ),Ιμ 1 3，Hl 启动子引物(ΙΟμΜ),Ιμ IdNTP (IOmM), 0. 5 μ IPfuDNA 聚合酶， 用ddH20补足到50μ 1。反应条件为:95°C Imin预变性，95°C 15sec变性，58°C 30sec退火， 72°C 30sec延伸，20个循环。1 %琼脂凝胶电泳检测，PCR产物条带单一，片段大小符合实验 要求。2. 2表达框PCR产物纯化1. 0%琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增得到的表达框，并 用琼脂糖凝胶纯化试剂盒纯化凝胶产物。纯化后的DNA再次进行1. 0%琼脂糖凝胶电泳检 测，纯化后的TO-siRNA转录模板-Hl表达框纯度和浓度符合要求，如图4所示。同时用紫 外分光光度计测得制备后的表达框浓度为200-420ng/y 1。3.靶位点筛选3. 1细胞培养肝癌细胞S匪C-7721在含10% 85的01^] 培养基中，371、5%0)2 培养才直培养。3. 2细胞铺板并转染将细胞按IX IO5/孔接种到96孔细胞培养板中，在无抗含 10% FBS的DMEM培养基中，37°C、5% CO2培养箱培养过夜。转染按照LipofectaminTM2000的说明书转染，U6_siRNA转录模板-Hl表达框DNA 量按0.2 μ g/孔加入。3. 3实时定量PCR检测Survivin基因mRNA水平用mRNA提取纯化试剂盒 TurboCapture mRNA kit提取纯化细胞RNA，操作按试剂盒说明书进行，按80 μ 1无RNase 水/孔溶解RNA，取4 μ IRNA为模板进行实时定量PCR反应。用基因特异性引物检测样本中Survivin mRNA表达水平，同时扩增看家基因 GAPDH作为内参对照。每个反应做3个平行实验。建立如下25μ 1反应体系4μ 1模板RNA， 12. 5 μ 12X SensiMix One-Step, 1 μ 15，正向引物(6 μ Μ)，1 μ 13，反向引物(6 μ Μ), 0. 5 μ 1 50 X SYBR GreenI，用无RNase水补足体系至25 μ 1。反应条件40°C反转录30min，95°C预 变性 7min，95°C变性 20sec，60°C退火 30sec，72°C延伸 30sec，循环 45 次。3. 4结果分析用实时定量PCR 2_Δ ^t法分析实验结果，并作出柱状图，如图5所 示，结果显示对应于Survivin多个位点的siRNA均呈现较好的沉默效果，尤其是siRNA2，相 对于未转染组，其对Survivin基因的沉默效果达到81 %。尤其须需要说明的是，siRNA2正义链序列与Survivin基因开放阅读框中的第 378-399 位(下划线部分 gacttggcccagtgtttct)相对应。实施例3化学合成siRNA验证沉默效果1.主要仪器、试剂和材料1. 1仪器核酸合成仪(GE公司)、PCR仪(ABI公司)；实时定量PCR仪(Bio-Rad)； 细胞培养箱(Thermo)等。1. 2 材料和试剂:Lipofectamin 2000 (invitrogen)，DMEM 培养基(Gibco)，TurboCapturemRNA kit (QIAGEN), SensiMix One-Step Kit(Quantace)等。其他生化试剂 均购于上海生工生物工程技术服务有限公司。1. 3PCR引物(百奥迈科生物技术有限公司合成)Survivin 正向引物5，-CGACGTTGCCCCCTGCCTG-3，Survivin 反向引物5，-AAGGAAAGCGCAACCGGACGA-3，GAPDH 正向引物5，-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3，GAPDH 反向引物5，-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3，2.化学合成制备siRNA利用百奥迈科生物技术有限公司拥有的核酸合成仪(美国GE公司)分别合成 siRNA2的正义链(sense strand)和反义链(antisense strand)的RNA。并进行纯化，将 正义链和对应的反义链退火成siRNA双链(duplex)，分装IOD/管，最后冷冻干燥，转染前用 无RNase水溶解至20 μ Μ。3.沉默效率验证3. 1细胞培养肝癌细胞S匪C-7721在含10% 85的01^] 培养基中，371、5%0)2 培养才直培养。3. 2细胞铺板并转染将细胞按IX IO5/孔接种到96孔细胞培养板中，在无抗含 10% FBS的DMEM培养基中，37°C、5% CO2培养箱培养过夜。转染按照LipOfeCtaminTM2000的说明书转染，RNA按IOnM/孔加入。3. 3实时定量PCR检测Survivin基因mRNA水平用mRNA提取纯化试剂盒 TurboCapture mRNA kit提取纯化细胞RNA，操作按试剂盒说明书进行，用80 μ 1无RNase 水/孔溶解RNA，取4 μ IRNA为模板进行实时定量PCR反应。用基因特异性引物检测样本中Survivin mRNA表达水平，同时扩增看家基因 GAPDH作为内参对照。每个反应做3个平行。建立如下25μ1反应体系4μ1模板RNA， 12. 5μ 1 2 X SensiMixOne-St 印，1 μ 1 5，正向引物(6 μ Μ)，1 μ 13，反向引物(6 μ Μ)， 0. 5 μ 150 X SYBR Green I，用无RNase水补足体系至25 μ 1。反应条件40°C反转录30min， 95°C预变性 7min，95°C变性 20sec，60°C退火 30sec，72°C延伸 30sec，循环 45 次。3. 4结果分析用实时定量PCR2_AAet法分析实验结果，并作出柱状图，如图6所 示，结果显示靶向至Survivin基因的siRNA2的沉默效果达到90%。序列表<110>百奥迈科生物技术有限公司<120> 一种干扰Survivin表达的siRNA分子及其应用<130>PCNBB0901066S<141>2009-07-03<160>5<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>429<212>DNA<213>GenBank Accession number :NM_001168
<220><221>Survivin基因开放阅读框<222>(1). . (429)<400>1atgggtgccc cgacgttgccacattcaaga actggcccttgctggcttca tccactgcccttcaaggagc tggaaggctgtcgtccggtt gcgctttccttttttgaaac tggacagagaaagaaagaat ttgaggaaacatggattga<210>2<211>23<212>RNA<213>人工序列<220><221> 正义链<222>(1). . (23)<223>Nn<220><221>misc_feature<222>(23). . (23)<223州是(、6、八、1\(1(、_、^_^^，11/^〃 。…1从。<400>2uccuuucugu caagaagcag uuNn 23<210>3<211>23<212>RNA<213>人工序列<220><221> 反义链<222>(1). . (23)<223>Nn<220><221>misc_feature<222>(23). . (23)<223州是(、6、八、1\(1(、(16、(^或泔；η 是 0 2 的整数。<400>3
ccctgcctggcagccctttctcaaggaccaccgcatctct60cttggagggctgcgcctgcaccccggagcggatggccgag120cactgagaacgagccagacttggcccagtgtttcttctgc180ggagccagatgacgaccccatagaggaacataaaaagcat240ttctgtcaagaagcagtttgaagaattaacccttggtgaa300aagagccaagaacaaaattgcaaaggaaaccaacaataag360tgcggagaaagtgcgccgtgccatcgagcagctggctgcc420 429
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一种双链siRNA分子，其具有如下序列结构正义链5’ UCCUUUCUGUCAAGAAGCAGUUNn 3’(SEQ ID NO2)反义链5’ AACUGCUUCUUGACAGAAAGGANn 3’(SEQ ID NO3)，其中，N是4种DNA碱基及其脱氧形式中的任何一种，即胞嘧啶C、鸟嘌呤G、腺嘌呤A、胸腺嘧啶T、脱氧胞嘧啶dC、脱氧鸟嘌呤dG、脱氧腺嘌呤dA或脱氧胸腺嘧啶dT；n是0～2的整数。
2.如权利要求1所述的siRNA分子，其特征在于，所述N为dT，且n为2。
3.如权利要求1所述的siRNA分子，其特征在于，所述n为0。
4.如权利要求1 3中任一项所述的siRNA分子在制备治疗抗肿瘤药物中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肝癌、肺癌、白血病、胃癌、宫颈 癌、多发性骨髓瘤、皮肤鳞癌、结肠癌、黑色素瘤、膀胱癌、骨肉瘤中的至少一种。
全文摘要
本发明涉及一种可干扰Survivin基因表达的双链siRNA分子、及其在制备抗肿瘤药物中的应用。该siRNA分子正义链为SEQ ID NO2，反义链为SEQ ID NO3，其中，反义链可特异性地与Survivin基因的mRNA结合，降解mRNA，从而干扰转录后翻译过程，达到治疗肿瘤的目的。
文档编号A61K48/00GK101935650SQ20091005439
公开日2011年1月5日 申请日期2009年7月3日 优先权日2009年7月3日
发明者孙云成, 朱远源, 李铁军, 陆毅祥, 陈莉 申请人:百奥迈科生物技术有限公司