专利名称：一种具有β-内酰胺酶抑制活性的多肽及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，特别涉及一种具有β -内酰胺酶抑制活性的多肽及其 制备方法和应用，包括该多肽的编码基因及其重组表达载体和转化子。
背景技术：
β -内酰胺类抗生素(青霉素和头孢菌素)在临床上用于治疗多种细菌感染疾 病，但随着抗生素的广泛应用以及某种程度上的滥用，耐药菌在不断地产生，它们对许多 β “内酰胺抗生素耐药，从而使这类药物对耐药菌感染的疾病无效。微生物来源的β “内酰 胺酶的抑制剂棒酸(Clavulanic acid)及其β -内酰胺砜类化合物舒巴坦(Sulbactam)和 他佐巴坦(Tazobactam)，均在七十年代至八十年代被发现并证实是有效的β -内酰胺酶的 抑制剂，且作为“自杀者”与内酰胺抗生素合并用药，可达到抑制内酰胺酶活力、增 强β-内酰胺抗生素疗效的目的。然而，这些小分子化合物对一些细菌产生的由染色体介 导的I型β-内酰胺酶的抑制作用都很小。近来人们从带棒链霉菌(Str印tomyces clavuligerus)中分离到β -内酰胺酶抑 制蛋白(β -lactamase inhibitory protein，BLIP)，可以特异性的抑制β -内酰胺酶的活 性，随后又有BLIP-I、BLIP-II被发现。但是β -内酰胺酶抑制蛋白BLIP，分子量比较大， 有165个氨基酸组成，并不适合开发成为临床使用的药物。BLIP与β-内酰胺酶的结合具 有几个关键结合位点。本申请人的专利ZL200410084577. 1中根据关键结合位点设计并合 成了随机寡核苷酸库，从中筛选到24肽SIPIS04-01，体外作用表明具有抑制β -内酰胺酶 的活性，适合用于作为基因工程表达药物，但是该24肽SIPIS04-01的抑制β -内酰胺酶的 活性并不高。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题就是针对现有的具有β -内酰胺酶抑制活性的多 肽存在的活性低的不足，提供一种新的具有内酰胺酶抑制活性的多肽及其制备方法和 应用，同时提供该多肽的编码序列及其重组表达载体和转化子。本发明人经过仔细研究发现，随着BLIP与β -内酰胺酶结合关系的研究的深入， 包括结构生物学以及热力学，影响二者结合的“热点”(hotspot)关键氨基酸不断被发现。 据此，本发明人通过反复的试验，将之前得到的24肽SIPIS04-01的编码基因，根据大肠杆 菌密码子偏爱性进行改造，然后通过关键位点的氨基酸替换，并延长其N端，终于制备了新 的具有更强内酰胺酶抑制活性的小肽，从而完成了本发明。因此，本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之一是一种具有β -内酰胺 酶抑制活性的多肽，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID Ν0. 6所示，其中，第25位的“Xaa”表
示非极性氨基酸残基。本发明中，所述的非极性氨基酸残基包括Ile，Met，Gly，Ala，Val，Pro, Leu, Trp,或Phe，较佳的是丙氨酸(Gly)残基或甘氨酸(Ala)残基。当所述的非极性氨基酸残基是丙氨 酸残基或甘氨酸残基时，本发明所述的多肽的氨基酸序列较佳的如序列表中SEQ ID NO. 2 或 SEQ ID NO. 4 所示。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案之二是一种DNA序列，其编码具有 β -内酰胺酶抑制活性的多肽，是下列之一1)其核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO. 5所示，其中，第73 75位的“nbn”表示
编码非极性氨基酸残基的密码子序列；2)其编码如序列表中SEQ ID NO. 6所示的氨基酸序列的多肽，其中，第25位的 "Xaa"表示非极性氨基酸残基。本发明中，所述的非极性氨基酸残基包括lie, Met, Gly，Ala, Val, Pro, Leu, Trp, 或Phe，较佳的是丙氨酸(Gly)残基或甘氨酸(Ala)残基。当所述的非极性氨基酸残基是丙 氨酸残基或甘氨酸残基时，本发明的编码具有β "内酰胺酶抑制活性的多肽的DNA序列，较 佳的是下列之一 1)其核苷酸序列是序列表中SEQ ID NO. 1或SEQ ID N0. 3所示；2)其编 码如序列表中SEQ ID N0. 2或SEQ ID N0. 4所示的氨基酸序列的多肽。本发明还提供一种重组载体，其含有任一项如上所述的DNA分子。较佳的，所述的 重组载体的载体骨架是质粒pET32a。本发明还提供一种转化体，其含有如上所述的重组载体。较佳的，所述的转化体的 宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli，Ε. coli)，如 Ε. coli BL21(DE3)。本发明还提供一种制备具有内酰胺酶抑制活性的多肽的方法，包括以下步 骤培养如上所述的转化体，从培养物中获得具有内酰胺酶抑制活性的多肽。本发明中，所述的具有内酰胺酶抑制活性的多肽可用于制备治疗或预防细菌 感染疾病的药物。本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。相比于现有技术，本发明的有益效果如下本发明提供了一种内酰胺酶抑制 多肽及其制备方法，该多肽比现有的内酰胺酶抑制多肽活性高得多，对临床耐药菌肺 炎克雷伯氏菌具有明显的抑制作用，用来与内酰胺类抗生素合用来治疗细菌感染将具 有更明显的效果。该多肽可以采用基因工程方法制备，非常适合开发成为临床使用的药物， 可以满足生物医药领域发展的需要，具有良好的医药前景。
以下结合
本发明的特征和有益效果。图 1 是 SIPIS04-01 与 SIPIS04-01-N 的比对。其中，1 是原始序列 SIPIS04-01，2 为优化序列SIPIS04-01-N。图2是小肽融合蛋白表达载体ΡΕΤ132的构建流程示意图。 图3是合成氨基酸替换小肽基因的PCR产物电泳图。1，2，3，4分别代表氨基酸Α， G，C，R替换后的PCR扩增产物。图4是氨基酸替换前后小肽序列比较图。图5是氨基酸替换A，G，C，R的表达载体的构建示意图，以A显示载体的构建过程。图6是36肽SIPIS04-01N-Y50A-36的编码基因以及对应的氨基酸序列。
图7是带His-tag的SIPIS04-01N-Y50A-36融合蛋白洗脱组分的SDS/PAGE电泳 图。1为分子量标记，2为融合蛋白。图8是表达阳性多肽融合蛋白SIPI04-01-N和SIPI04-01N-Y50A经肠激酶切割后 的SDS/PAGE电泳图。1、融合蛋白SIPI04-01N-Y50A ；2、融合蛋白SIPI04-01N-Y50A经肠激 酶消化后得到的片段；3、融合蛋白SIPI04-01-N ；4、融合蛋白SIPI04-01-N经肠激酶消化得 到的片段5、蛋白分子量标记。图9是超滤后流出液的tricine-SDS-PAGE电泳。1是分子量标记，2是超滤后的 目标小肽。图10是纯化的目的小肽SIPIS04-01N-Y50A-36的HPLC图。图11是不同浓度的小肽SIPIS04-01N-Y50A-36对临床耐药肺炎克雷伯氏菌的抑 制活性。
具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注 明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所述 的“室温”是指进行试验的操作间的温度，一般为25°C。实施例1小肽SIPIS04-01-N表达载体的构建将专利申请200410084577. 1序列表中的第二条核苷酸序列，即24肽的编码基因 序列命名为SIPIS04-01，具体见图1中的1所示。在SIPIS04-01核苷酸序列的基础上，以 大肠杆菌密码子偏爱性为指导原则，在不改变其氨基酸序列前提下，对基因序列进行改造， 得到大肠杆菌密码子偏爱的编码该24肽，然后在其5’-末端加上了酶切位点及一个甲硫氨 酸起始密码子的核苷酸序列，命名为SIPIS04-01-N，具体见图1中的2所示。SIPIS04-01-N 编码28肽。通过化学合成目的基因SIPIS04-01-N，并在基因两侧引入EcoRI，Sail酶切位点 插入到质粒pET-32a(+)，构建得到小肽融合蛋白重组表达载体，命名为pET132，构建流程 图见图2。实施例2SIPIS04-01-N氨基酸替换试验载体构建将在SIPIS04-01-N编码的28肽中的3个氨基酸作了以下点突变，研究突变后肽 的性能。首先是将在SIPIS04-01-N编码的28肽中对应第3位和第20位的氨基酸进行了替 换，将第3位S替换成F，将第20位由V替换成Y。这两个位点根据文献(Zhang Z,et al. J Biol Chem，2004，279(41) :42860_42866.)是关键的氨基酸位点。还将在 SIPIS04-01-N 编 码的28肽中处于第17位的氨基酸进行下文四种不同氨基酸的替换，由原来的Y替换成A， 6，(或1 。该位点被认为(Strynadka NC, et al. Nature, 1994,368(6472) :657_660.)位于 蛋白相互作用的界面和两个loop环上，在BLIP与TEM等Class A型β -内酰胺酶结合过 程中扮演的重要角色。对此位点的上述4个点突变可以比较此位点上不同类型的氨基酸残 基(非极性R基，不带电荷极性R基，带正电荷R基)对BLIP与β-内酰胺酶结合能力的 影响。上述在SIPIS04-01-N编码的28肽中对应的第3、第20和17位的氨基酸在文献报道 的165个氨基酸组成的β -内酰胺酶抑制蛋白BLIP中对应的位置是第36、53和50位的氨 基酸。
为了实现上述点突变，设计合成了如表1中的引物。
表 1.氨基酸替换试验引物序列
引物名称序列Pl-AR5'-TTTACCATTCACTGTTCTGTTACCGCAGCTGGC-3'P2-Y50A5'-ACCGTGGTAGCAGTAAGCATCGCCAGCTGCGGTAACA-3'P2-Y50G5'-ACCGTGGTAGCAGTAACCATCGCCAGCTGCGGTAACA-3'P2-Y50C5'-ACCGTGGTAGCAGTAACAATCGCCAGCTGCGGTAACA-3'P2-Y50R5'-ACCGTGGTAGCAGTATCGATCGCCAGCTGCGGTAACA-3'P3-AR5'-GTAGA4JJCATGTTCCGCTTTACCATTCACTGTTCT-3'P4-AR 5，-ATAGrCGL4CTAGAAGGAAGTACCGTTCGCACCGTGGTAGCAGTA-3'表中黑色斜体处为酶切位点。分别将上述引物加入PCR反应体系中，PCR反应体系见表2。PCR产物电泳图见图 3。4条引物经过互为模板的PCR反应，得到的产物编码27肽，它是在SIPIS04-01-N基础上 替换了 3个氨基酸，即第3位，第17位和第20位，同时去除了第2位的Ala，这样氨基酸替 换小肽比28肽SIPIS04-01-N少了一个氨基酸。这样就得到编码4条新的27肽的DNA序 列。其中引物P2-Y50A扩增的基因命名为SIPIS04-01N-Y50A，引物P2-Y50G扩增的基因命 名为 SIPIS04-01N-Y50G，引物P2-Y50C扩增的基因命名为 SIPIS04-01N-Y50C，引物P2-Y50R 扩增的基因命名为SIPIS04-01N-Y50R。表2. PCR反应体系
组份贮藏液浓度反应体系加入量(μ )4条弓丨物(PI、P3、P4各 ΙΟμιηοΙ/L0.8和选自P2中的一种)dNTP各 2.5mmol/L1.6100mmol/L Tris-ClIOx缓冲液500 mmol/L KCl2.015 mmol/L MgCl2Taq酶5υ/μ10.5ddH20补足至总体积为20μ1PCR反应条件94°C预变性3min，94°C变性30s，退火30s温度一般为引物Tm值减 50C _10°C，72°C延伸，时间控制在lmin/kb，进行30个循环后，72°C再延伸lOmin，最后4°C
保存待用。将4条PCR产物回收后，分别用EcoRI，SalI双酶切电泳回收，同质粒pET32a (+)的EcoRI，Sal I双酶切大片段连接，形成重组表达质粒，分别命名为pYG567，pYG568，pYG569 和 pYG570。其中 pYG567 含有 SIPIS04-01N-Y50A 基因，pYG568 含有 SIPIS04-01N-Y50G 基 因，pYG569 含有 SIPIS04-01N-Y50C 基因和 pYG570 含有 SIPIS04-01N-Y50R 基因。以 pYG567 重组表达质粒构建为例，示意图见图5。pET-32a(+)为一种常用的大肠杆菌表达载体质粒， 带有His-Tag蛋白标签以及肠激酶酶切位点，由Novagen公司购得。随后分别将pYG567-570转化大肠杆菌DH5 α (购自上海生工)。实施例3编码多肽的DNA序列测定将实施例2制备的大肠杆菌DH5 α转化子中pYG567_570测序，以通用引物S-Tag 作为测序引物，由上海英俊生物技术有限公司测定。PYG567-570的测序结果与理论完全一 致。其中PYG567测序结果及其编码的氨基酸序列如图6。PYG567-570四个氨基酸残基替 换小肽编码基因的测序结果所对应的氨基酸序列与原始SIPIS04-01-N的氨基酸序列的比 对见图4。实施例436肽SIPIS04-01N-Y50A-36的诱导表达以及分离纯化将pYG567-570转化大肠杆菌BL21 (DE3)，取Iml上述大肠杆菌BL21 (DE3)的转 化子培养液，加入到装有IOOml LB培养基(含ΙΟΟμ g/mlAmp)的250ml摇瓶，37 °C培养 到0D_ = 0. 6时(约45min)，取Iml样品作为诱导前对照，升温至42°C热激培养诱导 3h，收集菌体。将诱导后的培养物离心(8000gX10min)获得菌体，用5ml NTA-O重悬，置 于冰浴中超声波破壁5min(500W，工作5s，间歇5s)。细胞破壁液于13，200r/min 4°C离 心20min(Eppendorf5415R小型冷冻高速离心机)，取上清置于烧杯(25ml)中。加入Iml Ni-NTA树脂混悬液(含50% (ν/ν)树脂，保存于20% (ν/ν)乙醇溶液中)，置于冰上(或 在4°C冰箱中)用脱色摇床120r/min振荡lh。装入层析柱，移去层析柱底端的帽子，上清 液通过NTA柱，收集流出液用于电泳分析。加IOml NTA-20洗涤层析柱，洗去未结合的杂蛋 白。然后用2ml NTA-200洗脱目的蛋白，分4次洗脱，每次0.5ml，即得到多肽的融合蛋白 (见图7)。融合蛋白经过透析之后再被重组肠激酶(rEK，购自上海智源生化公司)消化(如 图8)。融合蛋白用肠激酶切后，酶切液中含有3个蛋白，分别是肠激酶，融合蛋白以及本发 明的目的小肽。酶切液装入截留分子量为10，OOODa的离心超滤管(由MILLIP0RE公司购 得)中，7500gX10min，收集流出液体。由于肠激酶和融合蛋白的分子量均超过10KD，所以 超滤后流出液中仅含有分子量小于10，OOODa的蛋白，即目的小肽。肠激酶的识别序列为DDDDK，在赖氨酸的C端切割多肽。质粒pET_32a(+)中含有 编码肠激酶酶切位点的序列，在此位点与重组插入序列之间还有一些核苷酸。重组质粒表 达后，重组插入序列的表达产物的前面还融合了一段蛋白。在用肠激酶消化该融合蛋白时， 目的蛋白会比重组插入序列的表达产物多带上质粒pET-32a(+)自身所有的9个氨基酸，这 样最后得到的肽长度就是36肽。这样得到的4条36肽，如实施例2 —样分别根据突变氨基 酸命名，如第17位由Y突变为A的命名为SIPIS04-01N-Y50A-36小肽，推测分子量是3900 道尔顿。将超滤流出液中含有的目的小肽进行tr i cine-SDS-PAGE，见图9，可见小肽分子量 约1. 42KD。对此小肽进行了 HPLC分析，有单一的出峰图谱。其中小肽SIPIS04-01N-Y50A-36 的HPLC分析见图10。
实施例5多肽对于肺炎克雷伯氏菌的体内抑制作用将肺炎克雷伯氏菌Klebsiella pneumonias (购自ATCC公司，700603)接种在含 Amp的LB培养基中37°C振摇过夜，次日以(ν/ν)的比例转接后培养至OD值为0. 5左 右。稀释至浓度为IO8细胞/ml后，分两组平行试验，一组加入Amp (终浓度50μ g/ml)，另一 组加入Amp (终浓度50 μ g/ml)和上述纯化回收的小肽(终浓度约为2. 23 μ mol/L)，37°C， 230rpm震荡培养2小时后离心。菌体适当稀释涂布含Amp抗生素的LB平板，37°C培养16 小时，计数存活的菌落数，考察在小肽SIPIS04-01N-Y50A存在下，肺炎克雷柏氏菌对Amp的 耐受性。同时采用原始小肽SIPIS04-01作为对照。空白对照则用水代替小肽进行上述试 验。菌落数统计见表3和图11，显示在稀释度为10_5和10_6稀释度下，平板上长出适 合统计的菌落数。表明SIPIS04-01-N-Y50A-36相对于原始小肽SIPIS04-01对于β内酰 胺酶的抑制活性提高了 80%。可见肠激酶消化所得的36肽(SIPIS04-01-N-Y50A-36)比原 始的24肽(SIPIS04-01)具有更好的β -内酰胺酶抑制活性。表3.菌落统计结果
菌落数1(Γ510_Ε
空白对照291. 336
SIPI-04-0116017
SIPIS04-01N-Y50A-3651. 32 实施例6多肽在体外对β -内酰胺酶的抑制活性利用Dixon双倒数作图法求抑制常数Ki。分别测定两种底物Amp浓度(低底物 浓度(SL)25ymol/L，高浓度底物(Sh)为50 μ mol/L)下，不同小肽浓度(0. 5，1. 0，2. 0，4. 0， 8. 0，16. 0 μ mol/L)对适当稀释50 μ 1 SHV型β内酰胺酶酶液(按如下文献制备杨涛，胡 又佳，谢丽萍等.来自肺炎克雷伯氏菌的SHV型β-内酰胺酶基因的克隆、表达与纯化[J]. 中国医药工业杂志，2008，39 (5) 335-339.)在200 μ 1体系中的抑制常数，分别比较原始小 肽 SIPIS04-01N 以及氨基酸替换后的小肽 SIPIS04-01N-Y50A-36.SIPIS04-01N-Y50G-36 三 组实验，测得的结果如表4。计算得到的抑制常数如表5所示。抑制常数越小，抑制活性越 高，从表5可以看出，Υ50替换成A后，小肽对SHV型β内酰胺酶的抑制作用提高了 0.8倍。同法比较了 小肽 SIPIS04-01-N 和 36 肽 SIPIS04-01-N-Y50A-36、 SIPIS04-01N-Y50G-36对于TEM-I型β内酰胺酶(按如下文献制备孙伟等.中国医药工 业杂志，2004，35 (2)，16-19)的抑制作用，发现Υ50替换成A后，抑制活性提高了 2. 5倍，见 表6。表4.小肽对SHV型β内酰胺酶的抑制常数测试实验
权利要求
一种具有β 内酰胺酶抑制活性的多肽，其特征在于，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.6所示，其中，第25位的“Xaa”表示非极性氨基酸残基。
2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的非极性氨基酸残基是丙氨酸残基或 甘氨酸残基。
3.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO. 2 或 SEQ ID NO. 4 所示。
4.一种DNA分子，其编码具有内酰胺酶抑制活性的多肽，其特征在于，是下列之1)其核苷酸序列是序列表中SEQID NO. 5所示，其中，第73 75位的“nbn”表示编码 非极性氨基酸残基的密码子序列；2)其编码如序列表中SEQID NO. 6所示的氨基酸序列的多肽，其中，第25位的“Xaa” 表示非极性氨基酸残基。
5.如权利要求4所述的DNA分子，其特征在于，所述的非极性氨基酸残基是丙氨酸残基 或甘氨酸残基。
6.如权利要求4所述的DNA分子，其特征在于，所述的DNA分子是下列之一1)其核苷酸序列是序列表中SEQID NO. 1或SEQ ID NO. 3所示；2)其编码如序列表中SEQID NO. 2或SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列的多肽。
7.—种重组载体，其特征在于，其含有如权利要求4 6任一项所述的DNA分子。
8.如权利要求7所述的重组载体，其特征在于，所述的重组载体的载体骨架是质粒 pET32a0
9.一种转化体，其特征在于，其含有如权利要求7所述的重组载体。
10.如权利要求9所述的转化体，其特征在于，所述的转化体的宿主细胞是大肠杆菌。
11.一种制备具有内酰胺酶抑制活性的多肽的方法，其特征在于，包括以下步骤 培养如权利要求9或10所述的转化体，从培养物中获得具有β -内酰胺酶抑制活性的多肽。
12.如权利要求1 3任一项所述的具有β-内酰胺酶抑制活性的多肽在制备治疗或 预防细菌感染疾病的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种具有β-内酰胺酶抑制活性的多肽及其制备方法和应用。该多肽的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.6所示，其中，第25位的“Xaa”表示非极性氨基酸残基。该多肽包括36个氨基酸残基，比现有的β-内酰胺酶抑制多肽活性更高，对临床耐药菌肺炎克雷伯氏菌有抑制作用，可以用来与β-内酰胺类抗生素合用来治疗细菌感染。该多肽可以采用基因工程方法制备，适合开发成为临床使用的药物，可以满足生物医药领域发展的需要，具有良好的医药前景。本发明还公开了该多肽的编码基因及其重组表达载体和转化子。
文档编号A61K38/16GK101935341SQ200910054340
公开日2011年1月5日 申请日期2009年7月3日 优先权日2009年7月3日
发明者朱宝泉, 朱春宝, 胡又佳, 许明飞, 谢丽萍 申请人:上海医药工业研究院