专利名称：壳聚糖或海藻酸钠改性碳纳米管靶向缓释载体的制备方法
技术领域：
本发明涉及的是一种纳米药物技术领域的制备方法，具体是一种壳聚糖或海 藻酸钠改性碳纳米管靶向缓释载体的制备方法。
背景技术：
碳纳米管(Carbon Nanotube，简称CNT)是近年来被发现的一种新型碳结 构(S. Iijima，yVa^;re1991,354,56)，是由碳原子形成的石墨烯片层巻曲而成的 无缝中空碳管，两端各有半个富勒烯分子封端，是一种具有高度离域化n电子 共轭体系的一维量子材料。碳纳米管分为单壁碳纳米管(Single-wall Nanotube, SWCNT)和多壁碳纳米管(Multi-wall Nanotube，丽CNT)。其制备方法主要有催 化热解、电弧放电、模板法、化学气相沉积法等。自碳纳米管问世以来，以其独 特的电子和力学性质及准一维管状分子结构和潜在的巨大应用价值，迅速成为物 理、化学、材料研究的热点。
癌症是现代社会威胁人类健康的一大顽疾，目前的治疗方法主要有手术、放 疗和化疗，但无论哪种方法都不能达到完全根治的效果。靶向药物被人们视为未 来可能提高患者生活质量、实现带瘤生存的一柄利器。开发抗肿瘤药物的多功能 新型靶向载体系统成为目前全球肿瘤临床研究的攻坚课题。近年来，人们发现碳 纳米管具有常规药物载体不具备的良好的跨膜性，这使得研究者将目光转向构建 和开发碳纳米管基的抗癌靶向药物载体系统。但由于碳纳米管管壁光滑且高度可 极化，在强的范徳华力作用下容易团聚成束，几乎不溶于水和各种有机溶剂，难 以分散，因此需要对碳纳米管进行适当改性以提高其水溶性。另一方面，要在碳 纳米管上实现靶向和载药两方面功能，也需要对碳纳米管进行功能化改性。
经过对现有技术的文献检索发现，Hanene Ali-Boucetta等在《Chem. Commun.》(《化学通讯》)(2008， 4， 459)上发表的文章"Multiwalled carbon nanotube - doxorubicin supramolecular complexes for cancer therapeutics" 使用了聚氧丙烯嵌段共聚物Pluronic F127对多壁碳纳米管进行修饰以提高其水 溶性，随后以非共价的方式将阿霉素吸附于多壁碳纳米管上，得到的碳管阿霉素复合物具有较纯阿霉素更大的毒性，但不足之处在于制备出的碳纳米管载体不具 有靶向性。壳聚糖(Chitosan， CHI)和海藻酸钠(Alginate sodium， ALG)是 自然界中广泛存在的两种多糖，由于其出色的生物相容性，近来被广泛的应用于 生物医药领域的研究。利用这两种多糖对碳纳米管进行非共价的物理包覆， 一方 面可以提高碳纳米管在水中的分散性，另一方面壳聚糖表面的氨基官能团可以使 我们对其进一步改性实现靶向和载药功能的结合。
发明内容
本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种壳聚糖或海藻酸钠改性碳纳 米管靶向缓释载体的制备方法，即用壳聚糖和海藻酸钠对碳纳米管进行非共价的 物理包覆，并将具有靶向性功能的叶酸连接至多糖表面，得到的碳纳米管药物载 体兼具靶向和缓释的功能。
本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括以下步骤
步骤(a):将1重量份碳纳米管原料和1 100重量份的氧化性混合酸混合，， 依次通过超声处理和搅拌处理后抽滤，然后用去离子水反复洗涤至pH值为7， 真空干燥后得到截短碳纳米管；
所述的碳纳米管原料是指通过催化热解、电弧放电、模板法或化学气相沉积 法方法制备得到的单壁或多壁碳纳米管；
所述的氧化性混合酸是指1 5mol/L的硝酸、0. 1 100%重量酸浓度硫酸、 1/100 100/1摩尔比硝酸和硫酸的混合溶液、1/100 100/1摩尔比高锰酸钾和 硫酸混合溶液或1/100 100/1摩尔比HA和硫酸混合溶液中的一种；
所述的超声处理是指采用20kHz 100kHz频率的超声波处理1 100min;
所述的搅拌处理是指在0 2(TC的环境下搅拌反应1 50h;
所述的抽滤是指以4)0.22 um聚四氟乙烯微孔滤膜进行抽滤。
歩骤(b):将所得的截短碳纳米管水溶液通过超声处理后加入海藻酸钠或壳 聚糖水溶液，然后再进行超声处理和搅拌处理后依次进行抽滤和水洗后真空千 燥，得到改性碳纳米管；
所述的截短碳纳米管水溶液的浓度为1 100mg/mL;
所述的海藻酸钠或壳聚糖溶液的浓度为1 10mg/mL，该海藻酸钠或壳聚糖
水溶液与截短碳纳米管水溶液的体积比为1: 1 1: 10;
歩骤(C):将改性碳纳米管配置成碳纳米管磷酸缓冲液经过超声处理后依次加入叶酸和多肽縮合剂，然后再通过通过超声处理和搅拌处理，并经抽滤水洗， 室温下真空干燥，得到改性碳纳米管靶向缓释载体；
所述的碳纳米管磷酸缓冲液的浓度为1 50mg/mL;
所述的叶酸用量为1 50mg，多肽缩合剂用量为1 50mg;
步骤(d):将改性碳纳米管靶向缓释载体配置成改性碳纳米管靶向缓释载体 磷酸缓冲液溶液并经超声处理后加入蒽环类抗癌药物水溶液，最后经超声处理和 搅拌处理，并经抽滤水洗，室温下真空干燥，得到加载药物后的壳聚糖或海藻酸 钠改性碳纳米管靶向缓释载体。
所述的改性碳纳米管靶向缓释载体磷酸缓冲液溶液的浓度为1 20mg/mL;
所述的蒽环类抗癌药物是指阿霉素(Doxorubicin, D0X)或表阿霉素 (Epirubicin， EPB)。
所述的蒽环类抗癌药物磷酸缓冲液溶液的浓度为1 100mg/mL，该蒽环类抗 癌药物水溶液与改性碳纳米管耙向缓释载体磷酸缓冲液溶液的体积比为1:1 1: 10。
本发明提供的制备方法简单易行，可控性强。所得碳纳米管载体水溶性好， 可实现对阿霉素等蒽环类抗癌药物的酸性pH下缓释效果，并具有对癌细胞的靶 向功能，对癌细胞的毒性作用远大于纯药物效果，对用于癌症治疗的纳米靶向载 药系统的构建有着重要的指导意义。
图la为截短碳纳米管的透射电子显微镜照片；
图lb为叶酸靶向壳聚糖或海藻酸钠改性碳纳米管载体装载阿霉素后的透射 电子显微镜照片；
图2为加载阿霉素后的叶酸靶向壳聚糖或海藻酸钠改性的碳纳米管在不同 pH环境中的药物缓释示意曲线图3为人类子宫癌细胞经过叶酸耙向壳聚糖或海藻酸钠改性碳纳米管载体 (FA-CHI/ALG -SWCNTs)，载药的叶酸靶向壳聚糖或海藻酸钠改性碳纳米管(DOX-FA-CHI/ALG-SWCNTs)和纯阿霉素(D0X)处理lh后继续培养24 h、 48 h和72 h 后的存活率示意图4为叶酸耙向壳聚糖或海藻酸钠改性碳纳米管载体进入癌细胞的作用机 制示意图。
具体实施例方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下 进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限 于下述的实施例。
实施例l、以化学气相沉积法方法制备的单壁碳纳米管(SWCNTs)为最初原 料，经过酸化截短后，通过非共价的物理包覆将壳聚糖或海藻酸钠及叶酸功能化 到单壁碳纳米管表面，并采用阿霉素(D0X)为模型药物，得到叶酸靶向的壳聚 糖或海藻酸钠改性单壁碳纳米管阿霉素耙向药物载体，具体步骤如下
步骤(a):在300 mL体积比为3: 1的98% H2S0^[1 65% HMV混酸中加入单 壁碳纳米管原料500 mg， 0° C冰水浴下超声24 h，用$ 0.22 um孔径的聚四 氟乙烯微孔滤膜抽滤，并用大量去离子水反复洗涤多次至中性，5(TC真空干燥 24h后得到截短的单壁碳纳米管；
步骤(b):在已装有磁力搅拌转子的单颈圆底烧瓶中，加入40mL 2mg/mL步 骤(a)所得截短后的单壁碳纳米管水溶液，用40kHz超声波处理20min后，加入 80mL 2mg/mL海藻酸钠的水溶液，用40kHz超声波处理lh后，室温下搅拌12h，用 (J)0.22ym聚四氟乙烯微孔滤膜抽滤，用大量去离子水反复洗涤，室温下干燥得 到海藻酸钠改性的单壁碳纳米管；随后在已装有磁力搅拌转子的单颈圆底烧瓶 中，加入30mL2mg/mL所得海藻酸钠改性的单壁碳纳米管水溶液，用40kHz超声波 处理20min后，加入60raL 2mg/mL壳聚糖的醋酸(0.05 M)水溶液，用40kHz超声 波处理lh后，室温下搅拌12h，用4 0.22ym聚四氟乙烯微孔滤膜抽滤并用大量去 离子水洗涤，得到壳聚糖或海藻酸钠改性的单壁碳纳米管；
歩骤(c):将20mL 2mg/mL歩骤(b)所得壳聚糖或海藻酸钠修饰的单壁碳 纳米管磷酸缓冲液溶液用40kHz超声波处理20min后，加入60mg的叶酸和50mg 的多肽縮合剂(EDC)，用40kHz超声波处理20min，室温下搅拌12h，经抽滤水 洗，室温下真空干燥，得到叶酸耙向的壳聚糖或海藻酸钠改性的单壁碳纳米管抗 癌药物靶向缓释载体；
歩骤(d):将15mL lmg/mL步骤(c)所得叶酸靶向的壳聚糖或海藻酸钠修 饰的单壁碳纳米管的磷酸缓冲液溶液用40kHz超声波处理10min后，加入15mL 3mg/tnL阿霉素的磷酸缓冲液溶液，用40kHz超声波处理20min，室温下避光搅拌' 12h，经抽滤水洗，室温下真空干燥，得到加载阿霉素后的壳聚糖或海藻酸钠的
7改性单壁碳纳米管抗癌药物靶向缓释载体。
如图1所示，为单壁碳纳米管和壳聚糖或海藻酸钠改性单壁碳纳米管靶向载 体的结构特点。如图la可以看出单壁碳纳米管清晰的管壁结构，如图lb所示， 由于阿霉素、壳聚糖或海藻酸钠吸附层的覆盖和屏蔽，已经不能清楚看到碳管的 管壁。同时经测算壳聚糖或海藻酸钠改性单壁碳纳米管靶向载体对阿霉素的载药 率可达(156±5%)。
如图2所示，为壳聚糖或海藻酸钠单壁碳纳米管靶向载体负载抗癌药物后在 不同PH值下的药物释放特点。在pH7. 4的中性环境中阿霉素与碳管的结合较为 稳定而当pH降至5. 5后阿霉素呈现出随时间不断缓慢释放的特点。
如图3所示，为壳聚糖或海藻酸钠改性单壁碳纳米管叶酸抗癌药物载体 (FA-CHI/ALG-SWCNTs )本身没有明显细胞毒性，其载带抗癌药物后 (DOX-FA-CHI/ALG-SWCNTs)比纯阿霉素能更显著的抑制人类子宫癌细胞的生长。
如图4所示，为壳聚糖或海藻酸钠改性单壁碳纳米管叶酸抗癌药物载体进入 癌细胞的作用机制示意图。
实施例2、以化学气相沉积法方法制备的单壁碳纳米管(SWCNTs)为最初原 料，经过酸化截短后，通过非共价的物理包覆将壳聚糖或海藻酸钠及叶酸功能化 到单壁碳纳米管表面，并采用表阿霉素(EPB)为模型药物，得到叶酸靶向的壳 聚糖或海藻酸钠改性单壁碳纳米管阿霉素靶向药物载体，具体步骤如下
步骤(a):在300 mL体积比为3: 1的98% H2SO^[] 65% HN(V混酸中加入单 壁碳纳米管原料500 mg， 0° C冰水浴下超声24 h，用O 0.22 y m孔径的聚四 氟乙烯微孔滤膜抽滤，并用大量去离子水反复洗涤多次至中性，50'C真空干燥 24h后得到截短的单壁碳纳米管；
歩骤(b):在已装有磁力搅拌转子的单颈圆底烧瓶中，加入40mL 2mg/mL歩 骤(a)所得截短后的单壁碳纳米管水溶液，用40kHz超声波处理20min后，加入 80mL 2mg/mL海藻酸钠的水溶液，用40kHz超声波处理lh后，室温下搅拌12h，用 ci)0.22um聚四氟乙烯微孔滤膜抽滤，用大量去离子水反复洗涤，室温下干燥得 到海藻酸钠改性的单壁碳纳米管；随后在已装有磁力搅拌转子的单颈圆底烧瓶 中，加入30mL2mg/mL所得海藻酸钠改性的单壁碳纳米管水溶液，用40kHz超声波 处理20min后，加入60mL 2mg/mL壳聚糖的醋酸(0.05 M)水溶液，用40kHz超声 波处理lh后，室温下搅拌12h，用(t)0.22um聚四氟乙烯微孔滤膜抽滤并用大量去离子水洗涤，得到壳聚糖或海藻酸钠改性的单壁碳纳米管；
步骤(c):将20mL 2mg/mL步骤(b)所得壳聚糖或海藻酸钠修饰的单壁碳 纳米管磷酸缓冲液溶液用40kHz超声波处理20min后，加入60mg的叶酸和50mg 的多肽縮合剂(EDC)，用40kHz超声波处理20min,室温下搅拌12h，经抽滤水 洗，室温下真空干燥，得到叶酸靶向的壳聚糖或海藻酸钠改性的单壁碳纳米管抗 癌药物靶向缓释载体；
步骤(d):将15mL lmg/mL步骤(c)所得叶酸靶向的壳聚糖或海藻酸钠修 饰的单壁碳纳米管的磷酸缓冲液溶液用40kHz超声波处理10min后，加入15mL 3mg/mL表阿霉素的磷酸缓冲液溶液，用40kHz超声波处理20min，室温下避光搅 拌12h，经抽滤水洗，室温下真空干燥，得到加载表阿霉素后的壳聚糖或海藻酸 钠的改性单壁碳纳米管抗癌药物靶向缓释载体。
实施例2得到的加载表阿霉素后的壳聚糖或海藻酸钠的改性单壁碳纳米管 载体具有较好的水溶性，载药率也可达到144±6%。
实施例3、以化学气相沉积法方法制备的多壁碳纳米管(MWCNTs)为最初原 料，经过酸化截短后，通过非共价的物理包覆将壳聚糖或海藻酸钠及叶酸功能化 到多壁碳纳米管表面，并采用阿霉素(DOX)为模型药物，得到叶酸靶向的壳聚 糖或海藻酸钠改性多壁碳纳米管阿霉素耙向药物载体，具体步骤如下
步骤(a):在300 mL体积比为3: 1的98%跳和65% HN(V混酸中加入多 壁碳纳米管原料500 mg， 0° C冰水浴下超声24 h，用①0.22 ixm孔径的聚四 氟乙烯微孔滤膜抽滤，并用大量去离子水反复洗涤多次至中性，5(TC真空干燥 24h后得到截短的多壁碳纳米管；
歩骤(b):在己装有磁力搅拌转子的单颈圆底烧瓶中，加入40raL 2mg/mL步 骤(a)所得截短后的多壁碳纳米管水溶液，用40kHz超声波处理20min后，加入 80mL 2mg/mL海藻酸钠的水溶液，用40kHz超声波处理lh后，室温下搅拌12h，用 4 0.22um聚四氟乙烯微孔滤膜抽滤，用大量去离子水反复洗涤，室温下干燥得 到海藻酸钠改性的多壁碳纳米管；随后在已装有磁力搅拌转子的单颈圆底烧瓶 中，加入30niL2mg/mL所得海藻酸钠改性的多壁碳纳米管水溶液，用40kHz超声波 处理20min后，加入60tnL 2tng/mL壳聚糖的醋酸(0.05 M)水溶液，用40kHz超声 波处理lh后，室温下搅拌12h，用(J)0.22ym聚四氟乙烯微孔滤膜抽滤并用大量去 离子水洗涤，得到壳聚糖或海藻酸钠改性的多壁碳纳米管；步骤(c):将20mL 2mg/mL步骤(b)所得壳聚糖或海藻酸钠修饰的多壁碳 纳米管磷酸缓冲液溶液用40kHz超声波处理20min后，加入60mg的叶酸和50mg 的多肽縮合剂(EDC)，用40kHz超声波处理20min，室温下搅拌12h，经抽滤水
洗，室温下真空干燥，得到叶酸耙向的壳聚糖或海藻酸钠改性的多壁碳纳米管抗 癌药物靶向缓释载体；
步骤(d):将15mL lmg/mL步骤(c)所得叶酸耙向的壳聚糖或海藻酸钠修饰 的多壁碳纳米管的磷酸缓冲液溶液用40kHz超声波处理10min后，加入15mL 3nig/niL表阿霉素的磷酸缓冲液溶液，用40kHz超声波处理20fflin，室温下避光搅拌 12h，经抽滤水洗，室温下真空干燥，得到加载表阿霉素后的壳聚糖或海藻酸钠 的改性多壁碳纳米管抗癌药物靶向缓释载体。
实施例3得到的加载表阿霉素后的壳聚糖或海藻酸钠的改性多壁碳纳米管抗 癌药物靶向缓释载体具有较好的水溶性，载药率较单壁碳纳米管载体稍大，可达 172±5% 。
权利要求
1、一种壳聚糖或海藻酸钠改性碳纳米管靶向缓释载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤步骤(a)将1重量份碳纳米管原料和1～100重量份的氧化性混合酸混合，，依次通过超声处理和搅拌处理后抽滤，然后用去离子水反复洗涤至pH值为7，真空干燥后得到截短碳纳米管；步骤(b)将所得的截短碳纳米管水溶液通过超声处理后加入海藻酸钠或壳聚糖水溶液，然后再进行超声处理和搅拌处理后依次进行抽滤和水洗后真空干燥，得到改性碳纳米管；步骤(c)将改性碳纳米管配置成碳纳米管磷酸缓冲液经过超声处理后依次加入叶酸和多肽缩合剂，然后再通过通过超声处理和搅拌处理，并经抽滤水洗，室温下真空干燥，得到改性碳纳米管靶向缓释载体；步骤(d)将改性碳纳米管靶向缓释载体配置成改性碳纳米管靶向缓释载体磷酸缓冲液溶液并经超声处理后加入蒽环类抗癌药物水溶液，最后经超声处理和搅拌处理，并经抽滤水洗，室温下真空干燥，得到加载药物后的壳聚糖或海藻酸钠改性碳纳米管靶向缓释载体。
2、 根据权利要求1所述的壳聚糖或海藻酸钠改性碳纳米管靶向缓释载体的制备方法，其特征是，所述的碳纳米管原料是指通过催化热解、电弧放电、模板法或化学气相沉积法方法制备得到的单壁或多壁碳纳米管。
3、 根据权利要求1所述的壳聚糖或海藻酸钠改性碳纳米管靶向缓释载体的制备方法，其特征是，所述的氧化性混合酸是指1 5mol/L的硝酸、0. 1 100%重量酸浓度硫酸、1/100 100/1摩尔比硝酸和硫酸的混合溶液、1/100 100/1摩尔比高锰酸钾和硫酸混合溶液或1/100 100/1摩尔比HA和硫酸混合溶液中的一种。
4、 根据权利要求1所述的壳聚糖或海藻酸钠改性碳纳米管靶向缓释载体的制备方法，其特征是，所述的超声处理是指采用20kHz 100kHz频率的超声波处理1 100min。
5、 根据权利要求1所述的壳聚糖或海藻酸钠改性碳纳米管靶向缓释载体的制备方法，其特征是，所述的搅拌处理是指在0 2(TC的环境下搅拌反应1 50h。
6、 根据权利要求1所述的壳聚糖或海藻酸钠改性碳纳米管靶向缓释载体的制备方法，其特征是，所述的抽滤是指以(^0.22ym聚四氟乙烯微孔滤膜进行抽滤。
7、 根据权利要求1所述的壳聚糖或海藻酸钠改性碳纳米管靶向缓释载体的制备方法，其特征是，所述的截短碳纳米管水溶液的浓度为1 100mg/mL。
8、 根据权利要求1所述的壳聚糖或海藻酸钠改性碳纳米管靶向缓释载体的制备方法，其特征是，所述的海藻酸钠或壳聚糖溶液的浓度为1 10mg/mL，该海藻酸钠或壳聚糖水溶液与截短碳纳米管水溶液的体积比为1: 1 1: 10。
9、 根据权利要求1所述的壳聚糖或海藻酸钠改性碳纳米管靶向缓释载体的制备方法，其特征是，所述的碳纳米管磷酸缓冲液的浓度为1 50mg/mL。
10、 根据权利要求1所述的壳聚糖或海藻酸钠改性碳纳米管靶向缓释载体的制备方法，其特征是，所述的改性碳纳米管靶向缓释载体磷酸缓冲液溶液的浓度为1 20mg/mL。
全文摘要
一种纳米材料技术领域的壳聚糖或海藻酸钠改性碳纳米管靶向缓释载体的制备方法，包括制备截短碳纳米管；制备改性碳纳米管；制备改性碳纳米管靶向缓释载体以及加入蒽环类抗癌药物水溶液，最后经超声处理和搅拌处理，并经抽滤水洗，室温下真空干燥，得到加载药物后的壳聚糖或海藻酸钠改性碳纳米管靶向缓释载体。本发明经测算对阿霉素的载药率可达156±5％。
文档编号A61K47/48GK101590242SQ20091005431
公开日2009年12月2日 申请日期2009年7月2日 优先权日2009年7月2日
发明者孟令杰, 张晓科, 林高锋, 路庆华 申请人:上海交通大学