通过调节gat-1表达促进肝再生的制作方法

专利名称：通过调节gat-1表达促进肝再生的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过调节GAT-I表达促进肝再生。
背景技术：
人类和哺乳动物的肝脏在物理、化学、感染或缺血性损伤后具有很强的再生能力。 在某些条件下(如外科因肿瘤或移植手术切除部分肝脏或肝叶；移植一个小的供体肝脏到 一个大的受体；因化学药物、病毒等引起肝细胞破坏等)，肝脏的体积发生变化，触动肝脏 再生。自20世纪以来，肝脏疾病的发病率的逐渐攀升成为严重威胁人类健康的疾病之一。 我国各型肝病患者正在呈上升趋势，每年有近40万人死于肝脏疾病。目前，肝脏切除手术 已被许多医院广泛应用于治疗多种肝脏疾病。当部分肝脏切除后，肝脏面临着剩余肝脏功 能的代偿问题。剩余肝脏功能若能代偿，则会引起肝再生而逐渐康复。反之，则会走向急性 肝功能衰竭，导致患者死亡。研究表明对肝再生的人为诱导可能会提高肝切除导致的急性 肝衰竭患者的生存率和缩短其康复时间。如何有效地提高及促进肝脏再生、肝功能恢复成 为目前亟待解决的问题。研究肝再生最常用的动物模型是小鼠或大鼠的部分肝切除(约70%肝脏切除)模 型。在肝脏切除后的短短几分钟之内，肝细胞的活化即被触动。在这一过程中，多种细胞因 子、生长因子、神经内分泌调节因子等均参与调节激酶的活化、转录因子的激活以及肝细胞 的增殖和肝功能的恢复。评价肝再生的指标有肝脏重量的变化、肝细胞有丝分裂指数等。γ -氨基丁酸(GABA)作为重要的抑制性神经递质，与兴奋型神经递质谷氨酸相互 平衡维持中枢神经系统的正常功能。由神经元释放至突触间隙的GABA部分与位于突触后 膜的GABA受体结合，而大部分GABA则通过突触前膜的GABA转运体转运至细胞内。GAT-I 作为抑制性神经递质的主要转运体之，最早被科学家们所发现，目前认为其主要表达在嗅 球、神经皮质、小脑、上丘、基质核，并且主要分布在突触前膜末端、神经元及胶质细胞，对于 维持体内较低浓度的GABA起着重要的作用。目前有研究证明，GABA可以负向调节肝再生， 但是对于GAT-I是否参与这一过程尚不清楚。

发明内容
本发明利用肝再生的动物模型，证明了 GAT-I的表达在肝切后的24小时明显上 升。利用GAT-I基因缺陷小鼠，首次发现GAT-I缺失后小鼠肝再生能力明显下降，证实了 GAT-I在肝再生病理生理机制中发挥重要作用。进一步的研究显示，利用RNAi技术干扰小 鼠肝脏中GAT-I表达后，小鼠肝再生能力明显减弱。因此，本发明提供Y-氨基丁酸转运蛋白亚型1或其编码序列在制备促进肝再生 用的物质中的用途。在一优选实施例中，所述物质是含有所述编码序列的表达载体。在另一优选实施例中，所述物质是Y-氨基丁酸转运蛋白亚型1的激动剂。在其它优选实施例中，所述物质为用于促进肝再生用的药剂。在优选实施例中，所
3述药剂含有本发明所述的供Y-氨基丁酸转运蛋白亚型1、其编码序列或含有所述编码序 列的表达质粒。在其它优选实施例中，所述药剂含有Y-氨基丁酸转运蛋白亚型1的激动 剂。本发明提供Y-氨基丁酸转运蛋白亚型1的激动剂在制备促进肝再生用的药物中 的用途。在一优选实施例中，所述的Y-氨基丁酸转运蛋白亚型1的激动剂选自(但不限 于)雌激素、蛋白酶C激动剂、磷脂酶抑制剂。在其它优选实施例中，所述药剂含有有效促进肝再生的量的所述Y-氨基丁酸转 运蛋白亚型1的激动剂。在其它实施例中，所述药剂还含有药学上可接受的载体和/或赋 形剂。本发明提供含Y-氨基丁酸转运蛋白亚型1的编码序列的表达载体在制备促进肝 再生用的药物中的用途。本发明提供一种筛选用于促进肝再生的潜在物质的方法，所述的方法包括(1)将候选物质与表达Y-氨基丁酸转运蛋白亚型1的体系接触；(2)检测候选物质对Y -氨基丁酸转运蛋白亚型1的影响；若所述候选物质可提高Y-氨基丁酸转运蛋白亚型1的表达、活性或分泌，则表明 该候选物质是可用于促进肝再生的潜在物质。在一优选实施例中，所述步骤(1)包括在测试组中，将候选物质加入到组成性表 达或诱导性表达Y-氨基丁酸转运蛋白亚型1的体系中；和/或步骤(2)包括检测测试组的体系中Y-氨基丁酸转运蛋白亚型1的表达或活性， 并与对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达Y-氨基丁酸转运蛋白 亚型1的体系；如果测试组中Y-氨基丁酸转运蛋白亚型1的表达、活性或分泌在统计学上高于 对照组，就表明该候选物质是可用于促进肝再生的潜在物质。在一优选实施例中，所述体系选自细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、 器官体系或动物体系。在一优选实施例中，所述方法还包括对获得的潜在物质进行进一步的细胞实验 和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于促进肝再生有用的组合物。


图1显示在肝切后的不同时间点，GAT-I在肝脏中的表达情况。C57BL/6小鼠(每 个时间点3-4只)，通过给小鼠在第0天进行肝脏切除术(约70%肝脏切除)，触动剩余肝 脏再生。在肝切后的第0小时、12小时、24小时和48小时，处死小鼠，取出小鼠的肝脏抽取 RNA。通过实时定量PCR的方法检测GAT-I的表达水平。所示数据代表3次试验的结果。图2显示肝切后，GAT-I-/-小鼠肝脏再生明显下降。对照组(野生型)和实验组 (GAT-1-/-)，每组9-10只小鼠，通过给小鼠在第0天进行肝脏切除术(约70%肝脏切除)， 以触动剩余肝脏再生。在肝切后的第24小时、48小时和72小时，分别称量小鼠体重，处死 小鼠，取出小鼠的肝脏并称其重量。根据小鼠肝脏重量/小鼠的体重X 100计算每只小鼠 的肝脏与体重比率。所示数据代表3次试验的结果。
图3显示通过RNAi技术干扰GAT-I表达后，小鼠肝脏再生明显下降。对照组和实 验组(GAT-1 siRNA)，每组3-4只小鼠，在第0天，给小鼠尾静脉注射2ml的0.9%生理盐水 或GAT-I siRNA。48小时后，给小鼠实施肝脏切除术(约70%肝脏切除)，触动小鼠肝再生。 肝切后48小时，处死小鼠，按照图2所述的方法计算每只小鼠的肝脏与体重比率。图4显示利用分子生物学技术上调肝脏中GAT-I表达后，小鼠肝脏再生明显增加。 对照组和实验组(GAT-1质粒)，每组3-4只小鼠，在第0天，给小鼠尾静脉注射2ml的空质 粒或GAT-I的表达质粒。48小时后，给小鼠实施肝脏切除术(约70%肝脏切除)，触动小鼠 肝再生。肝切后48小时，处死小鼠，按照图2所述的方法计算每只小鼠的肝脏与体重比率。图5显示GAT-I质粒图谱。
具体实施例方式γ -氨基丁酸(GABA)作为重要的抑制性神经递质，与兴奋型神经递质谷氨酸相互 平衡维持中枢神经系统的正常功能。由神经元释放至突触间隙的GABA部分与位于突触后 膜的GABA受体结合，而大部分GABA则通过突触前膜的GABA转运体转运至细胞内。Y -氨 基丁酸转运蛋白亚型I(GAT-I)作为抑制性神经递质的主要转运体之一，最早被科学家们 所发现，目前认为其主要表达在嗅球、神经皮质、小脑、上丘、基质核，并且主要分布在突触 前膜末端、神经元及胶质细胞，对于维持体内较低浓度的GABA起着重要的作用。本发明利用GAT-I基因缺失动物，首次发现GAT-I缺失后小鼠肝再生能力明显下 降，证实了 GAT-I在肝再生病理生理机制中发挥重要作用。进一步的研究显示，利用RNAi 技术干扰小鼠肝脏中GAT-I表达后，小鼠肝再生能力明显减弱。因此，本发明一方面涉及促进对象肝再生的方法，该方法包括促进该对象GAT-I 基因的表达。GAT-I基因的核苷酸序列的GenBank登录号为NM_178703，氨基酸序列的GenBank 登录号为NP_848818。所述对象包括各种哺乳动物，例如人、各种驯养动物、宠物等等。促进GAT-I基因表达的方法包括采用生物技术向对象细胞中转入含有该GAT-I基 因的表达载体，该表达载体能够在所述对象细胞中表达GAT-I蛋白。或者，通过给予GAT-I 基因表达的激动剂来促进细胞中GAT-I基因的表达。本发明另一方面涉及促进对象肝再生的方法，该方法包括向该对象提供GAT-I蛋 白或GAT-I的激动剂。所用的GAT-I蛋白可以是天然存在的，比如其可被分离或纯化自哺乳动物。此外， 所述的GAT-I蛋白也可以是人工制备的，比如可以根据常规的基因工程重组技术来生产重 组GAT-I蛋白。优选的，本发明可采用重组的GAT-I蛋白。任何适合的GAT-I蛋白均可用于本发明。所述的GAT-I蛋白包括全长的GAT-I蛋 白或其生物活性片段。优选的，所述的GAT-I蛋白的氨基酸序列可以与GenBank登录号 NP_848818所示的序列基本上相同。经过一个或多个(例如几个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的GAT-I蛋 白的氨基酸序列也包括在本发明中。GAT-I蛋白或其生物活性片段包括一部分保守氨基酸 的替代序列，所述经氨基酸替换的序列并不影响其活性或保留了其部分的活性。适当替换
5氨基酸是本领域公知的技术，所述技术可以很容易地被实施并且确保不改变所得分子的生 物活性。这些技术使本领域人员认识到，一般来说，在一种多肽的非必要区域改变单个氨 基酸基本上不会改变生物活性。见Watson等，Molecular Biology of The Gene，第四版， 1987, TheBenjamin/Cummings Pub.Co.P224。具体而言，氨基酸一般被分成四类(1)酸性——天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱 性——赖氨酸、精氨酸、组氨酸；(3)非极性——丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、 苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸；(4)无电荷的极性——甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨 酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸。有时将苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸归为芳族氨基酸。例如，有 理由预测单独用异亮氨酸或缬氨酸取代亮氨酸、用谷氨酸取代天冬氨酸、用丝氨酸取代苏 氨酸，或者用结构上相关的氨基酸取代类似的保守的氨基酸，这样的替代将不会对生物活 性有重要影响。例如，本发明的GAT-I蛋白可包括多达约5-10个保守的或不保守的氨基酸 取代，甚至多达约15-25个保守的或不保守的氨基酸取代，或2-25之间任何整数，只要该 分子的所需功能仍维持完整。本领域的熟练技术人员可结合本领域熟知的Hopp/Woods和 Kyte-Doolittle曲线图，容易地测定感兴趣的分子中可耐受改变的区域。任何一种GAT-I蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，GAT-I蛋白 的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的GAT-I蛋白的全部或部分 功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50%的全长GAT-I蛋白的活性。在更优 选的条件下，所述活性片段能够保持全长GAT-I蛋白的60%、70%、80%、90%、95%、99%、 或100%的活性。本发明也可采用经修饰或改良的GAT-I蛋白，比如，可采用为了促进其半衰期、有 效性、代谢、和/或蛋白的效力而加以修饰或改良的GAT-I蛋白。所述经过修饰或改良的 GAT-I蛋白可以是一种GAT-I蛋白的共轭物，或其可包含被取代的或人工的氨基酸。所述经 过修饰或改良的GAT-I蛋白可以是与天然存在的GAT 1蛋白具有较小的共同点，但也能促 进肝再生，且不会带来其它不良影响或毒性。也就是说，任何不影响GAT-I蛋白的生物活性 的变化形式都可用于本发明中。根据GAT-I蛋白的氨基酸序列可以方便地得出其相应的核苷酸编码序列。优选 的，所述的GAT-I蛋白的核苷酸序列可以与GenBank登录号NM_178703所示的序列基本上 相同。因此，本发明的蛋白质包括(1)如GenBank登录号NP_848818所示的蛋白质；和 (2)在GenBank登录号NP_848818所示的氨基酸序列中，经过取代、缺失或添加一个或几个 氨基酸且具有GenBank登录号NP_848818所示蛋白的活性的由GenBank登录号NP_848818 衍生的蛋白质。可采用各种方法制备本发明的蛋白质。通常用重组方法制备本发明的蛋白质。可 以用标准分子生物学方法制备编码本发明蛋白质的多核苷酸。例如，用重组方法可以获得 编码上述分子的多核苷酸序列，例如通过从表达该基因的细胞筛选cDNA和基因组文库，或 通过从已知的包括该基因的载体衍生该基因。也可合成而非克隆制备感兴趣的基因。可用 适当的特定序列的密码子消化该分子。然后将用标准方法制备的重叠的寡核苷酸装配完 整的序列，并装配入完整的编码序列中。参见如Edge (1981)Nature 292 :756 ;Nambair等 (1984)Science223 1299 ；和 Jay 等(1984) J. Biol. Chem. 259 :6311。
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因此，从携带所需序列的载体可获得具体的核苷酸序列，或用本领域已知的各 种寡核苷酸合成方法，如定位诱变和聚合酶链式反应(PCR)，完全或部分合成。参见如 Sambrook，《分子克隆实验室手册》(Molecular Cloning :aLaboratory Manual)，第二版， 1989。具体说，获得编码所需序列的核苷酸序列的方法是用常规的自动多核苷酸合成仪制 备的退火补集的重叠的合成的寡核苷酸，然后用适当的DNA连接酶连接，并用PVR扩增连接 的核苷酸序列。参见如 Jayaraman 等(1991)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:4084-4088。另 外，在本发明中也可使用寡核苷酸定向的合成(Jones等，(1986)Nature 54:75-82)、先有 核苷酸区域的寡核苷酸定向诱变(Riechmann等，(1988)Nature 332 :323_327和Verhoeyen 等(1988) Science 239 1534-1536)和用T4DNA聚合酶进行的酶促补平带缺口的寡核苷酸 合成(Queen 等(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA86 10029-10033)。一旦制备或分离了编码序列，就可将这些序列克隆入任何合适的载体或复制子 中。对本领域技术人员而言，各种克隆载体是已知的，且适当的克隆载体的筛选只是选择问 题。合适的载体包括(但并非限制于)质粒、噬菌体、转座子、粘粒、染色体或当与适当的 控制元件结合时能复制的病毒。然后将克隆序列置于合适的控制元件的控制下，这取决于用于表达的系统。因此， 可以将编码序列置于启动子、核糖体结合位点(用于细菌表达)和任选地操纵子的控制下， 从而由合适的转化体将感兴趣的DNA序列转录到RNA中。该编码序列可以包含或不包含 信号肽或前导序列(随后可由宿主在翻译后加工除去)。参见如美国专利No. 4，431，739; 4，425，437 ；4，338，397。除了控制序列外，可以添加调节序列，从而可以相对于宿主细胞的生长调节序列 的表达。调节序列是本领域技术人员已知的，其实例包括那些能导致应答化学或物理刺激 (包括调节化合物的存在)启动或关闭基因表达的调节序列。载体中还可存在其它类型的 调节元件。例如，可以使用增强子元件以增加构建物的表达水平。实例包括SV40早期基因 增强子(Dijkema等(1985) EMB0J. 4 :761)；从Rous肉瘤病毒的长末端重复序列(LTR)衍生 的增强子 / 启动子(Gorman 等(1982)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 6777)；和从人 CMV 衍 生的元件(Boshart等，(1985) Cell 41 :521)，如CMV内含子A序列中包括的元件(美国专 利No. 5，688，688)。表达盒中还可包括在合适的宿主细胞中自主复制的复制起点、一种或多 种可选择的标记物、一个或多个限制酶切位点、高拷贝数量的势能和强启动子。构建表达载体，使具体的编码序列位于该具有适合调节序列的载体中，与控制序 列有关的编码序列的位置和取向使编码序列在控制序列的“控制”下转录(即，结合于控制 序列中DNA分子的RNA聚合酶转录该编码序列)。可能需要对编码感兴趣分子的序列进行 修饰来实现此目的。例如，在一些情况中可能需要修饰该序列，从而使其连接于适合取向的 控制序列，即维持读框。在插入到载体之前，控制序列和其它调节序列可能连接于编码序 列。或者，可以将编码序列直接克隆入已包含控制序列和合适的限制酶切位点的表达载体 中。通过缺失一部分编码感兴趣的多肽的序列、插入序列、和/或替代该序列内 的一个或多个核苷酸，可以制备用于分析的本发明蛋白的突变体或类似物。修饰核 苷酸序列的方法，如定向诱变等是本领域技术人员所熟知的。参见如Sambrook等， 上述；Kunkel，T. A. (1985)Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1985)82 448 ；Geisselsoder 等(1987)BioiTechniques 5 :786 ;Zoller 禾口 Smith(1983)Methods Enzymol.100 468 ； Dalbie-McFarland 等(1982)Proc. Natl. Acad. SciUSA79 :6409。这种分子可以在各种系统中表达，包括本领域熟知的昆虫、哺乳动物、细菌、病毒 和酵母表达系统。例如，昆虫细胞表达系统如杆状病毒系统是本领域技术人员已知的，描述于如 Summers 禾口 Smith，Texas Aguricultural Experiment Station BulletinNo. 1555 (1987)。 用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法都是可以试剂盒形式购得的，尤其是 Invitrogen, San Diego CA(" MaxBac"试剂盒)。类似地，细菌和哺乳动物细胞表达系统 也是本领域熟知的，其描述见如Sambrook等，如上。酵母表达系统也是本领域熟知的，其描 述见如《酵母遗传工程》(YeastGenetic Engineering) (Barr 等编辑，1989)Butterworths， London。许多用于上述系统的适合的宿主细胞也是已知的。例如，哺乳动物细胞系是本 领域已知的，其包括可从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得的无限增殖化的细胞系， 如(但并非限制于)中国仓鼠卵巢细胞(CH0)、Hela细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细 胞(COS)、人胚肾细胞、人肝细胞癌细胞(如H印G2)、Madin-Darby牛肾(〃 MDBK")细 胞等。类似地，在本发明的表达构建物中也可使用细菌宿主，如大肠杆菌、枯草杆菌和链 球菌。在本发明中还可用酵母宿主，特别包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、 麦芽糖假丝酵母(Candidamaltosa)、白色念珠菌(Candida albicans)、多形汉逊酵 母(Hansenulapolymorpha)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromyces fragilis)、乳酸克鲁 维酵母(Kluyveromyces lactis)、季也蒙氏毕赤酵母(Pichia guillerimondii)、巴 斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe)和 yarrowia lipolytic^。可与杆状病毒表达系统一起使用的昆虫细胞特别包括埃及伊 岐(Aedes aegypti)、苜猜丫 纹夜蛾(Autographacalifornica)、家香(Bombyx mori)、黑
(Drosophila melanogaster) >(Spodoptera frugiperda)禾口D"!^*.
(Trichoplusia ni)。用本领域熟知的各种基因送递的方法，可将包含感兴趣的核苷酸序列的核酸分子 稳定地整合入宿主细胞基因组中或在合适的宿主细胞中的稳定的附加型元件上维持。参见 如美国专利No. 5，399，346。根据所选用的表达系统和宿主，在表达蛋白质的条件下，培养用如上所述的表达 载体转化的宿主细胞制备该分子。然后从宿主细胞分离出表达的蛋白质并纯化。如果表达 系统将蛋白质分泌到培养基中，则直接从培养基纯化产物。如果不是分泌的，则从细胞裂解 液分离。适合的培养条件和回收方法的选择都是在本领域技术人员能力之内。因此，本发明也包括编码本发明GAT-1蛋白质的核苷酸序列和含有该核苷酸序列 的表达载体，以及使用这类核苷酸序列或其表达载体促进肝再生。本发明还涉及所述GAT-1蛋白、其编码序列以及含有所述编码序列的表达载体在 制备促进肝再生用的物质中的用途。所述制备也包括基于所述GAT-1蛋白、其编码序列以 及含有所述编码序列的表达载体而筛选能够促进肝再生的物质。因此，再一方面，本发明提供一种筛选用于促进肝再生的潜在物质的方法，该方法 包括
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(1)将候选物质与表达、_氨基丁酸转运蛋白亚型1的体系接触；(2)检测候选物质对、_氨基丁酸转运蛋白亚型1的影响；若所述候选物质可提高氨基丁酸转运蛋白亚型1的表达、活性或分泌，则表明 该候选物质是可用于促进肝再生的潜在物质。在本发明的优选方式中，在进行筛选时，为了更易于观察到GAT-1的表达或活性 的改变，还可设置对照组，所述的对照组可以是不添加所述候选物质的表达GAT-1的体系。所述的表达GAT-1的体系例如可以是细胞(或细胞培养物)体系，所述的细胞可 以是内源性表达GAT-1的细胞；或可以是重组表达GAT-1的细胞。所述的表达GAT-1的体 系还可以是(但不限于)亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物 模型)等。作为本发明的一种优选方式，所述的体系是表达GAT-1的细胞体系。较佳地，表达 GAT-1的免疫细胞可来源于以下3种制备方法①来源于正常哺乳动物的单个核细胞取正常哺乳动物单个核细胞(淋巴结、外周血、脾脏)经过，例如(但不限于) anti-⑶3和anti-⑶28或佛波脂和离子酶素刺激后，该细胞可表达GAT-1蛋白。将该种细 胞作为用于筛选促进肝再生的药物的细胞模型。②T淋巴细胞系，选自(但不限于)0VA-特异性T细胞系、M0G-特异性T细胞系、 MBP-特异性T细胞系、Jurkat细胞系、YAC-1细胞系、人T淋巴细胞系(H9)、Hut-102等。取T淋巴细胞系经过抗原或anti-⑶3和anti-⑶28或佛波脂和离子酶素刺激后， 该细胞可表达GAT-1蛋白。将该种细胞作为用于筛选促进肝再生的药物的细胞模型。③来源于抗原免疫后或疾病状态的哺乳动物的单个核细胞取抗原免疫后或疾病状态的哺乳动物的单个核细胞(外周血、淋巴结、脾脏、病灶 部位等)经过刺激(抗原、anti-⑶3和anti-⑶28、佛波脂和离子酶素)活化后，该细胞可 表达GAT-1蛋白。将该种细胞作为用于促进肝再生的药物的细胞模型。作为本发明的另一种优选方式，所述的体系是动物模型体系。较佳地，可采用具有 致病性的抗原或致病性的免疫细胞来制备致病的动物模型。所述的动物包括但不限于小 鼠、大鼠、豚鼠、兔等。诱导方法可如下经抗原免疫主动诱导致病；经被动转移致病性(但 不限于)T细胞或B细胞或免疫因子(如抗体等)诱导致病。所述的动物模型也可以是自 发性的发病的动物模型。作为本发明的优选方式，所述的方法还包括对获得的潜在物质进行进一步的细 胞实验和/或动物试验，以进一步选择和确定对于促进肝再生真正有用的物质。本发明对于GAT-1蛋白的表达、活性、存在量或分泌情况的检测方法没有特别 的限制。可以采用常规的蛋白定量或半定量检测技术，例如(但不限于)SDS_PAGE法， Western-Blot 法，ELISA 等。因此，本发明还提供了采用所述筛选方法获得的可用于促进肝再生的潜在物质。 这些初步筛选出的物质可构成一个筛选库，以便于人们最终可以从中筛选出能够对于促进 肝再生真正有用的物质，从而用于临床。因此，本发明再一方面还包括GAT-1的激动剂及其在制备促进肝再生用的药物方 面的用途。
如本文所用，所述的GAT-1的激动剂包括促进剂、上调剂等。任何可提高GAT-1蛋 白的活性、维持GAT-1蛋白的稳定性、促进GAT-1蛋白的表达、促进GAT-1蛋白的分泌、延长 GAT-1蛋白有效作用时间、或促进GAT-1的转录和翻译的物质均可用于本发明，作为可用于 促进肝再生的有效物质。作为本发明的优选方式，所述的GAT-1的激动剂包括(但不限于)雌激素、蛋白 酶C激动剂(佛波脂、(-)-Indolactam V等)、磷脂酶抑制剂(环胞酶素A、Okadaic Acid
寸J <>作为本发明的优选方式，所述的GAT-1蛋白的激动剂包括(但不限于)在转入细 胞后可表达(优选过表达)GAT-1的表达载体或表达构建物。通常，所述表达载体包含一基 因盒，所述的基因盒含有编码GAT-1的基因及与之操作性相连的表达调控序列。所述的“操 作性相连”或“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控 制同一线性DNA序列其它部分的活性。例如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操 作地连于编码序列。本发明中，GAT-1多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。只要能在宿主体内复 制和稳定，任何质粒和载体都可以用于本发明。表达载体的一个重要特征是通常含有复制 起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。如前文所述，本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含GAT-1的DNA序列和合 适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体 内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合 成。转化载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。本发明还提供了一种组合物，它含有有效量(如0.000001-50wt% ；较佳的 0. 00001-20衬％;更佳的，0. 0001-10wt% )的所述的GAT-1蛋白或其激动剂，以及药学上可 接受的载体。本发明的组合物可直接用于促进肝再生。此外，还可同时与其它治疗剂或辅剂联 合使用。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其 中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。如本文所用，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物 中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。如本文所用，术 语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物 所接受的量。如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良 副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上 可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。本发明的组合物含有安全有效量的GAT-1蛋白以及药学上可接受的载体。这类载 体包括(但并不限于)盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与 给药方式相匹配，本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄 糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。 活性成分的给药量是治疗有效量。本发明的药物制剂还可制成缓释制剂。
本发明所述的GAT-1蛋白或其激动剂的有效量可随给药的模式和待处理的肝损 伤的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来 确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于所述的GAT-1蛋白或其激动剂的 药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者 的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的GAT-1蛋白或其激动剂每天以 约0. 00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0. 0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得 到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂 量按比例地减少。作为本发明的优选方式，所述的激动剂是雌激素，当每天以0. 1-800 yg/kg动物 体重给药时，具有较好的效果；优选地每天以0. 5-300 u g/kg动物体重给药；更优选地每天 以1-200 u g/kg动物体重给药。本发明还提供了一种促进肝再生的方法，包括给予受试者有效量的GAT-1蛋白或 其激动剂。本发明的GAT-1蛋白或其激动剂的给药方式没有特别的限制，可以是全身的或局 部的。例如，本发明的GAT-1蛋白或其激动剂可通过腹腔注射、静脉注射、口服、皮下注射、 皮内注射等的方式给予动物，较为优选的是静脉注射。在得知了所述的GAT-1蛋白的用途后，可以采用本领域熟知的多种方法来将所述 的GAT-1蛋白或其编码基因、或其药物组合物给药于哺乳动物。优选的，可采用基因治疗的 手段进行，比如可直接将GAT-1蛋白通过诸如注射等方法给药于受试者；或者，可通过一定 的途径将携带GAT-1基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到靶点上，并使之表 达活性的GAT-1蛋白。作为本发明的一种实施方式，可将所述的GAT-1蛋白直接给药于哺乳动物(比如 人)，或者，可将编码GAT-1蛋白的基因通过常规的方法克隆到适当的载体(如常规原核或 真核表达载体、或病毒载体如疱疹病毒载体或腺病毒载体)中，将所述的载体导入到可表 达所述GAT-1蛋白的细胞中，使所述的细胞表达GAT-1蛋白。可通过将适量的所述细胞引 入到哺乳动物身体的适当部位，实现GAT-1蛋白的表达。GAT-1蛋白的激动剂的给药方式主要取决于所述激动剂的类型和特性，这是本领 域人员可以评估的。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如 Sambrook 等人，分子克隆实验室指南(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和 份数按重量计算。实施例1实施例中实验所用材料及试剂1.动物:C57BL/6小鼠、GAT-l-/-小鼠的构建方法参考Cai YQ等，Journalof Neuroscience Research, 2006,84 :255_67。2.试剂GAT_1和0 -actin引物合成于上海英骏生物技术有限公司；RNA抽 提试剂盒、RNA 逆转试剂盒购 Invitrogen ;SYBR Green PCR master mix 购自 Applied
11Biosystems ；自GAT-1 siRNA合成于上海吉玛制药技术有限公司。3.测试方法实时定量PCR1)RNA的提取和逆转录①RNA的提取使用Qiagen公司Rneasy Mini Kit，按照说明书操作，简述如下从-80°C取出装有350 u 1细胞裂解液的EP管，等待其融化|加入等体积350 ill 70 %乙醇，颠倒混勻数次|全部转移至Rneasy mini colume，放在2ml收集管上|>= 8000g( >= 10000转/分钟)，常温离心约15秒，倒去收集管内液体(如果样品超过700 ill，再重复一次)|加入 350 ill RW1 溶液，>=8000g( >= 10000 转 / 分钟)，常温离心约15秒，倒去收集管内液体，置换新2ml收集管|加入80 ill DNA酶(尽量直接加到膜上)，室温作用15分钟|加入 350 ill RW1 溶液，>=8000g( >= 10000 转 / 分钟)，常温离心约15秒，倒去收集管内液体，置换新2ml收集管|加入 500 u 1 RPE 溶液(工作浓度)，>=8000g( > = 10000 转 / 分钟)，常温离心约15秒，倒去收集管内液体|加入 500 u 1 RPE 溶液(工作浓度)，>=8000g( > = 10000 转 / 分钟)，常温离心约2分钟，倒去收集管内液体|将Rneasy mini colume放在新的1. 5ml收集管上|加入 30-50 ii 1 RNAse-free 水，>=8000g( >= 10000 转 / 分钟)，常温离心约1分钟，收集管内液体，测0D值|如果 RNA > 30u g,重复加入 30-50 u 1 RNAse-free 水，>= 8000g( >= 10000转/分钟)，常温离心约1分钟，收集管内液体，测0D值|紫外分光光度仪检测RNA浓度|分装并标记，于_80°C保存
②逆转录使用Qiagen公司的Sensiscript RT Kit，按照说明书操作，简述如下(合成cDNA的引物为核苷酸的随机六聚体)
权利要求
γ 氨基丁酸转运蛋白亚型1或其编码序列在制备促进肝再生用的物质中的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述物质是含有所述编码序列的表达载体。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述物质是Y-氨基丁酸转运蛋白亚型1的 激动剂。
4.Y-氨基丁酸转运蛋白亚型1的激动剂在制备促进肝再生用的药物中的用途。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的Y-氨基丁酸转运蛋白亚型1的激动 剂选自雌激素、蛋白酶C激动剂、和磷脂酶抑制剂。
6.含Y-氨基丁酸转运蛋白亚型1的编码序列的表达载体在制备促进肝再生用的药物 中的用途。
7.一种筛选用于促进肝再生的潜在物质的方法，其特征在于，所述的方法包括(1)将候选物质与表达Y-氨基丁酸转运蛋白亚型1的体系接触；(2)检测候选物质对Y-氨基丁酸转运蛋白亚型1的影响；若所述候选物质可提高Y-氨基丁酸转运蛋白亚型1的表达、活性或分泌，则表明该候 选物质是可用于促进肝再生的潜在物质。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括在测试组中，将候选物质加 入到组成性表达或诱导性表达Y-氨基丁酸转运蛋白亚型1的体系中；和/或步骤(2)包括检测测试组的体系中Y-氨基丁酸转运蛋白亚型1的表达或活性，并与 对照组比较，其中所述的对照组是不添加所述候选物质的表达Y-氨基丁酸转运蛋白业型 1的体系；如果测试组中Y-氨基丁酸转运蛋白亚型1的表达、活性或分泌在统计学上高于对照 组，就表明该候选物质是可用于促进肝再生的潜在物质。
9.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的体系选自细胞体系、亚细胞体系、溶 液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对获得的潜在物质进行 进一步的细胞实验和/或动物试验，以从候选物质中进一步选择和确定对于促进肝再生有 用的组合物。
全文摘要
本发明提供γ-氨基丁酸转运蛋白亚型1(GAT-1)的编码序列或γ-氨基丁酸转运蛋白亚型1在制备促进肝再生用的物质中的用途。本发明还涉及基于所述GAT-1基因或GAT-1蛋白制备或筛选促进肝再生用的物质的方法。
文档编号A61K45/00GK101935673SQ20091005435
公开日2011年1月5日 申请日期2009年7月3日 优先权日2009年7月3日
发明者徐凌云, 王莹 申请人:中国科学院上海生命科学研究院