衍生自hbs细胞的新型肝细胞样细胞和成肝细胞样细胞的制作方法

专利名称：：衍生自hbs细胞的新型肝细胞样细胞和成肝细胞样细胞的制作方法衍生自HBS细胞的新型肝细胞样细胞和成肝细胞样细胞
背景技术：
：本发明涉及衍生自hBS细胞的新型肝细胞样细胞群体以及此类肝细胞样细胞在例如药物治疗、药物筛选和毒性测试中的潜在用途。此外，本发明涉及可以具有合适的特征的成肝细胞样细胞，从而使得它们可以用于进行扩增且在需要时进一步分化成功能肝细胞样细胞，且进一步可以用于肝发生的体外和体内研究，例如早期肝发生或肝再生病症。根据本发明的肝细胞样细胞在基因或蛋白质表达水平上表达药物转运蛋白和/或药物代谢特征。
背景技术：
：期望多能性人干细胞彻底变革对于各种人细胞类型的可及性。繁殖多能性人胚泡衍生干(hBS)细胞且随后使其进一步分化成所需靶细胞类型的可能性，将为在体内和体外的一系列应用提供稳定和基本上无限的细胞供应。肝衰竭和晚期肝病造成全世界的大量死亡，并且是卫生保健系统的主要负荷。肝移植仍是最成功的治疗。然而，这种操作的功效是有限的且与许多并发症例(如感染或排斥)相联系。肝移植还面临可用的供体器官的短缺并且被治疗的患者很经常将涉及终生的免疫抑制。通过减少关于器官的需要，基于细胞的治疗对于患有这些严重疾病的社会和个体将具有极大的重要性。此外，肝脏是人体中的代谢和解毒中心，且因此已付出大量努力以便鉴定可靠来源的功能性细胞类型用于体外测试。不幸的是，肝脏的复杂性和功能不能由目前可用的任何细胞类型反映。原代人肝细胞的可用性是有限的，并且当用于体外应用时，还已知所述细胞快速丧失其正常表型和功能性质(即在24小时内)。关于原代细胞的一种常用备选物是反之包含极低水平的代谢酶，且具有基本上不同于体内天然肝细胞的其他重要蛋白质分布的肝细胞系。因此，许多测试仍使用动物材料来进行，尽管已知肝代谢是物种特异性的，且由此产生在预测与测试的物种不同的另一个物种中的肝毒性的困难。在药物开发中，有害肝脏反应仍是最显著的毒性倾向。因此，当选择化合物以进入临床试验时，人肝脏毒性倾向的早期预测具有首要的重要性。改善这个领域中的性能的努力必须解决可用性问题和模型的开发，这提供了对复杂的生物过程的更高的涉及范围，所述生物过程与在人中诱导不利的肝损伤一致。在2个领域中，衍生自hBS细胞的分化细胞的使用提供有希望的机会。因此，迫切需要模拟人肝细胞且能够预测新药物或化学制品的开发中的候选分子效果的模型系统。就可用性和生理学相关性而言，人多能千细胞可以充当功能性人肝细胞的理想的可更新来源。当将hBS细胞置于合适的环境中时，在分化2-4周后观察到某些肝特征。由Rambhatla等人2003，W001/81549和W02005/097980的先前研究已鉴定具有某些肝细胞样特征的细胞，即分化的hBS细胞培养中的CYP和GST活性，但就药物转运蛋白表达以及特异性CYP和GST表达模式而言，迄今为止所产生的细胞未显示出可能替代传统肝脏系统所需的代谢性质。在本发明中呈现了用于药物开发和再生医学的hBS细胞衍生的肝细胞样细胞群体，其具有重要的代谢酶以及药物转运蛋白至少72小时的稳定表达。Cellartis专利申请WO2006034873基于允许以限定方式使用不同因子以跟踪发育生物学的途径的方法。在本发明中，这主要是影响分化的细胞的分泌型内在因子。此外，培养基的替换频率不同。本方法允许较不频繁的替换培养基且因此是较不费力的方法。此外，本发明的细胞是更成熟的且可以在用于药物开发和毒性测试的测定系统中培养更长时间段。WO2005097980和US20030003573都没有教导关于药物转运蛋白或功能转运蛋白的存在。W02005097980仅阐迷CYP3A4、CYP2C9和CYP1A2是用于药物筛选的所需酶(参见表3)。然而，该申请未教导关于这些最重要的CYPs的活性的任何事情。特别地，CYP3A4是用于在药物开发和毒性测试中使用的单个最重要的酶。所有药物中的大多数经由CYP3A4进行代谢。因此，希望衍生自hBS细胞的肝细胞在反映人成年肝细胞的不同个体间组成中显示出功能性CYP3A4、CYP2C9和CYP1A2酶，那么这是希望的。对于药物开发和毒性测试也希望衍生自hBS的肝细胞具有(i)功能性CYP3A4、CYP2C9和CYP1A2酶，(ii)功能性GST酶和(ii)功能性药物转运蛋白的组合。就最重要的CYPs和药物转运蛋白而言，W0200509780中没有详细描述所述细胞，并且此外，它显示有限的GSTs表征数据。相反，本发明具有n期酶的充分描述。发明简述本发明涉及肝细胞样细胞和成肝细胞样细胞，以及用于其分别的制备的方法。本发明的肝细胞样细胞特别良好地适合用于在药物开发和毒性测试中使用，因为它们表达药物转运蛋白和/或代谢酶。人胚泡衍生干细胞(hBS细胞)是多能的且可以产生所有3个胚胎胚层的细胞内胚层、外胚层和中胚层，且进一步产生所有体细胞和生殖细胞。因此，在未来，具有肝细胞的功能特征的衍生自hBS细胞的分化细胞不仅具有用于移植或在生物反应器中用于在具有肝衰竭的患者中额外的体肝支持的潜能，还作为测试系统用于研究药物靶、异生物质的肝代谢和肝毒性。需要时，hBS衍生的肝细胞可以潜在提供来自同一基因供体的功能性人肝细胞的无限来源，并且因此改善体外测试(例如毒性测试)的预测性且减少动物实验的需要。然而，异生物质的毒性通常依赖其生物转化成毒性和反应性代谢物，且因此需要生物转化系统的存在和分布。目前，原代人肝细胞构成用于体外药物代谢和毒性测试的模型。然而，当培养原代肝细胞时，药物代谢酶的活性和许多转运蛋白功能快速丧失和/或改变。此外，用于体外研究的许多肝瘤细胞系(例如HepG2)缺乏许多重要的药物代谢酶的表达。细胞色素P450s(CYP)是混合的功能单加氧酶和异生物质的I期代谢中的主要酶。取决于异生物质的性质，这种氧化代谢导致药物前15体的灭活和促进的消除、激活或代谢激活。CYP表达的主要位点是肝脏，并且CYP3A4是人成年肝脏中最丰富的CYP同工酶。对于药物代谢最重要的酶属于家族1-3，负责临床使用药物的所有I期依赖性代谢的70-80%。由于多态性，CYP表达和活性呈现大的个体间差异。此夕卜，CYP可以由特异性药物诱导几倍或抑制，导致另外的，尽管是暂时的，代谢活性的可变性。值得注意的是，肝细胞内的3个主要CYP-家族(1-3)基本CYP活性的组成对于药物代谢具有极大的重要性。在本文的实施例中描述了hBS细胞衍生的肝细胞样细胞，其中检测到来自大多数CYP酶(包括CYP1A2和CYP3A4/7)的mRNA。检测到主要的CYP家族，更精确地CYP1A2、CYP2C9和CYP3A4的基本CYP活性，并且另外3种提及的CYP的活性的个体间组成类似于人原代肝细胞的那种。因此，本发明提供了用于制备表达功能药物代谢酶的肝细胞样细胞的方法。当分析肝脏的药物代谢和毒性时，肝细胞中的功能药物转运蛋白例如BSEP，MRP2和0ATP:s是必需。因此，本发明提供了用于制备表达功能转运蛋白的肝细胞样细胞的方法。因此，本发明涉及衍生自hBS细胞的细胞群体，其中所述细胞群体中至少20%的细胞显示出至少一个下述特征ot-l-抗胰蛋白酶、细胞角蛋白18、HNF-3P、白蛋白或肝-脂肪酸结合蛋白，并且所述细胞群体具有下述6个特征中的至少3个A.药物转运蛋白i)至少1%的细胞显示出BSEP的蛋白质和/或基因表达，ii)至少1%的细胞显示出MRP2的蛋白质和/或基因表达，iii)至少1%的细胞显示出0ATP-2和/或0ATP-8的蛋白质和/或基因表达，B.药物代谢酶iv)至少20%的细胞显示出GSTAl-l的蛋白质和/或基因表达，v)至少20%的细胞显示出CYP450s-1A2、-2A6、-2B6、-2C8、-2C9、-2C19-2D6、-2E1、-3A4和-3A7中至少2种的蛋白质和/或基因表达，vi)至少20%的细胞未显示出GSTP1-1的蛋白质和/或基因表达。此外，本发明涉及衍生自hBS细胞的细胞群体，其中所述细胞群体中至少约10%的细胞表达HNF3&和AFP中的至少一种，且具有增殖能力，并且所述细胞群体具有下述4个特征中的至少2个A.受体i)至少1%的细胞显示出cc-6-整联蛋白的蛋白质和/或基因表达，ii)至少1%的细胞显示出c-Met的蛋白质和/或基因表达，B.细胞间粘附分子iii)至少1%的细胞显示出ICAM-1的蛋白质和/或表达，C:转录因子iv)至少10%的细胞显示出HNF-4ct的蛋白质和/或表达。D.细胞角蛋白v)至少1%的细胞显示出CK19的蛋白质和/或表达，vi)至少1%的细胞显示出CK7的蛋白质和/或表达，E,上皮细胞粘附分子vii)至少1%的细胞显示出EpCAM的蛋白质和/或表达。尿素是蛋白质和氨基酸代谢的最终降解产物。肝脏中的肝细胞是将氨转化成尿素的机体的唯一细胞类型。因此，本发明提供了用于制备合成尿素的肝细胞样细胞的方法。在本发明的一个实施方案中，hBSC衍生的肝细胞样细胞以类似于原代肝细胞的水平生产尿素，且将尿素分泌到培养基内。与原代肝细胞比较，肝细胞样细胞具有合成至少10%、20%、50%、70%、80%、90%或至少100%尿素的能力。从第IO天到笫20天肝细胞样细胞可以就尿素进行分析并且之后其仍具有高水平的尿素合成。关于更多的细节，参见本文的实施例10。肝细胞样细胞的分离和再种植至不同的无饲养者表面使得以不同形式的纯化的肝细胞样细胞群体成为可能，这是由在药物毒性测试和17需的。因此，本发明提供了以任何形式(例如96孔平板)用于制备纯化的和富集的肝细胞样细胞无祠养者培养物，优选地胶原I培养的方法。在本发明的一个实施方案中，将肝细胞样细胞成功地再种植到不同孔表面上，例如96孔平板。不同表面可以是胶原I、Matrigel或mEF细胞层。再种植原代肝细胞是非常困难的。因此与原代肝细胞比较，真正的优点是肝细胞样细胞具有被再种植的能力。关于更多的细节，参见本文的实施例15。使成肝细胞在增殖许可条件下培养时维持在具有扩增能力的祖先状态和当维持在不同合适的条件下时分化成功能性肝细胞的能力对于维持功能性肝细胞的无限来源是有价值的。因此，本发明提供了通过使成肝细胞样细胞再种植到mEF细胞层上用于使成肝细胞样细胞维持在4且先状态的方法。此外，当再种植到matrigel或胶原包被的表面上时，成肝细胞样细胞分化成肝细胞样细胞。本发明定义定义和缩写如本文所使用的，伺养细胞意指单独或组合使用的支持细胞类型。细胞类型可以进一步具有人类或其他物种起源。衍生饲养细胞的组织包括胚胎、胎儿、新生儿、青少年或成人组织，并且它进一步包括衍生自皮肤的组织，包括包皮、脐带、肌肉、肺、上皮、胎盘、输卵管、腺、间质或乳腺。饲养细胞可以衍生自属于下述的细胞类型人成纤维细胞、纤维细胞、肌细胞、角质形成细胞、内皮细胞和上皮细胞。可以用于衍生伺养细胞的具体细胞类型的例子包括胚胎成纤维细胞、胚外内胚层细胞、胚外中胚层细胞、胎儿成纤维细胞和/或纤维细胞、胎儿肌细胞、胎儿皮肤细胞、胎儿肺细胞、胎儿内皮细胞、胎儿上皮细胞、脐带间充质细胞、胎盘成纤维细胞和/或纤维细胞、胎盘内皮细胞、出生后包皮成纤维细胞和/或纤维细胞、出生后肌细胞、出生后皮肤细胞、出生后内皮细胞、成人皮肤成纤维细胞和/或纤维细胞、成人肌细胞、成人输卵管内皮细胞、成人腺子宫内膜细胞、成人间质子宫内膜细胞、成人乳腺癌实质细胞、成人内皮细胞、成人上皮细胞或成人角质形成细胞。当饲养细胞衍生自hBS细胞时，该细胞可以是成纤维细胞。如本文所使用的，术语"3D"意指三维的。如本文所使用的，术语"胚泡衍生千细胞，，指BS细胞，和人形式命名为"hBS细胞"。如本文所使用的，术语如本文所使用的，术语如本文所使用的，术语如本文所使用的，术语换4吏用)，其具有不同亚型细胞角蛋白7。如本文所使用的，术语因子受体(scatterfactor如本文所4吏用的，术语如本文所〗吏用的换使用)。如本文所使用的使用)。如本文所使用的有人和/或重組来源FGF2)和FGF4。如本文所使用的如本文所使用的术语"AAT"意指肝脏标记物ot-抗胰蛋白酶。"AFP"意指肝脏标记物甲胎蛋白。"BSEP"意指胆汁盐输出泵。"CK，，意指肝脏标记物细胞角蛋白(可互例如细胞角蛋白18、细胞角蛋白19和"c-Met"意指肝细胞生长因子和/或分散receptor)。"ICAM-1"意指细胞内粘附分子l。"LFABP"意指肝-脂肪酸结合蛋白(可互术语"EpCAM，，意指上皮细胞粘附分子(可互换术语"FGF"意指成纤维细胞生长因子，优选具并且属于其的亚型是例如bFGF(有时还称为术语"DMS0"意指二甲基亚砜。"CYP"意指细胞色素P，并且更具体而言是细胞色素P450,是由许多不同亚单位组成的肝脏的主要1期代谢酶，亚单位例如1A1、1A2、3A4等。如本文所使用的，术语"GST，，意指谷胱甘肽转移酶，并且其亚型的例子是GSTA1-1、GSTM1-1和GSTPl-l。如本文所使用的，"HNF3P"和/或"HNF3b"可互换用于意指肝细胞核因子3,是调节内胚层衍生组织，例如肝脏、胰岛和脂肪细胞中的基因表达的转录因子。HNF3P有时还可以称为Foxa2,这是源于叉头框转录因子家族成员的转录因子的名字。如本文所使用的，术语"0ATP，，意指有机阴离子转运多肽，其介导肝脏中有机阴离子的钠(Na+)-依赖性转运，例如磺溴酞(BSP)以及缀合的(牛黄胆酸盐)和未缀合的(胆酸盐)胆酸(类似地)。如本文所使用的，术语"UGT"意指尿苷二磷酸葡糖醛酸基转移酶，这是催化葡糖醛酸化活性的一类肝脏酶。如本文所使用的，术语"无异物"意指直接或间接暴露于非人动物组分的完全回避。如上文所述，本发明提供了衍生自hBS细胞的改善的肝细胞样细胞和成肝细胞样细胞。所述改善的肝细胞样细胞表达药物转运蛋白和/或代谢酶，确保与肝细胞在体内使用相同的药物转运蛋白和代谢酶类似的药物摄取、分泌和代谢。因此，所有这些特征的表达是关于待在药物开发和毒性测试中使用的细胞的所需特征，因为预期它们针对药物和化学制品的反应类似于体内的肝细胞。因此，本发明中公开的成肝细胞样细胞或肝细胞样细胞有利地用于许多研究目的，例如在药物开发过程中，在体外模型中用于研究药物转运蛋白，在体外模型中用于研究药物代谢酶，在体外模型中用于研究肝发生，例如早期肝发生，在体外模型中用于研究人肝再生性病症，用于体外肝毒性测试。此外，根据本发明的成肝细胞样细胞和肝细胞样细胞可以有利地用于治疗和/或预防几种肝疾病和病症。因此，根据本发明的成肝细胞样细胞和肝细胞样细胞可以在药物中使用。成肝细胞样细胞是肝细胞样细胞的祖细胞，且因此它们适合例如用于获得代谢活性的肝细胞样细胞，或用于研究朝向肝细胞样细胞的成熟。，滅摔雄20在本文中，术语"肝细胞样细胞"意指显示出至少一个下述特征的细胞oc-l-抗胰蛋白酶、细胞角蛋白18、HNF-3P、白蛋白或肝-脂肪酸结合蛋白。根据本发明的肝细胞样细胞进一步具有涉及药物转运和药物代谢的重要和稳定的特征。因此，在一个实施方案中，本发明涉及衍生自hBS细胞的细胞群体，其中所述细胞群体中至少20%的细胞显示出至少一个下述特征a-l-抗胰蛋白酶(AAT)、细胞角蛋白18(CK18)、HNF-3P、白蛋白或肝-脂肪酸结合蛋白(LFABP)，并且所述细胞群体具有下述6个特征中的至少3个A.药物转运蛋白i)至少1%的细胞显示出BSEP的蛋白质和/或基因表达，ii)至少1%的细胞显示出MRP2的蛋白质和/或基因表达，iii)至少1%的细胞显示出0ATP-2和/或0ATP-8的蛋白质和/或基因表达，B.药物代谢酶iv)至少20%的细胞显示出GSTAl-l的蛋白质和/或基因表达，v)至少20%的细胞显示出下述的至少2种蛋白质和/或基因表达CYP450s-1A2、-2A6、-2B6、-2C8、-2C9、-2C19-2D6、-2E1、-3A4和-3A7，vi)至少20%的细胞未显示出GSTP1-1的蛋白质和/或基因表达。此外或作为要求vi)的代替，至少5%的细胞显示出GSTMl-l的蛋白质和/或基因寿达，在本发明的一个实施方案中，肝细胞样细胞可以经由I期细胞色素p450酶代谢药物。特别地，可以在不存在诱导物的情况下代谢cyplA2、cyp2C9和cyp3A4。在一个实施方案中，由肝细胞样细胞代谢的物质是非那西丁、双氯芬酸和咪达唑仑，并且代谢产物通过LC-MS进行分析。必须指出肝细胞样细胞能够代谢药物而不影响诱导物(如例如在WO2005097980中描述的)。在另一个实施方案中，肝细胞样细胞具有类似于人原代肝细胞培养物中的cyp活性组成的cyp-活性组成。特别地，肝细胞样细胞中的CyplA2、Cyp3A4和Cyp2C9的组成与人原代肝细胞培养中的组成相当。与人原代肝细胞培养物中的组成比较，CyplA2、Cyp3A4和Cyp2C9之间的Cyp-活性组成有30%、50%、75%和100%的差异。在本发明的一个实施方案中，肝细胞样细胞表达功能性药物转运蛋白。特别地，通过ICG染料的摄取测量的0ATP-2是活性的，所述ICG染料指示细胞内的功能性药物转运蛋白的存在(图48)。在本发明的另一个实施方案中，细胞群体衍生自hBS细胞，其中所述细胞群体中至少20%的细胞显示出至少一个下述特征a-l-抗胰蛋白酶、细胞角蛋白18、HNF-3P、白蛋白或肝-脂肪酸结合蛋白，并且所述细胞群体具有2个下述特征A.药物转运蛋白iii)至少1%的细胞显示出功能活性的0ATP-2和/或0ATP-8，B.药物代谢酶iv)至少20%的细胞显示出GSTA1-1的功能活性，v)至少20%的细胞显示出通过分析药物代谢产物测量的功能活性的CyplA2、Cyp3A4和/或Cyp2C9。在本发明的另一个实施方案中，细胞群体衍生自hBS细胞，其中所述细胞群体中至少75%的细胞显示出下述特征ot-l-抗胰蛋白酶、细胞角蛋白18、HNF-3P、白蛋白或肝-脂肪酸结合蛋白，并且所述细胞群体具有至少2个下述特征A.药物转运蛋白iii)至少10%的细胞显示出功能活性的0ATP-2和/或0ATP-8,B.药物代谢酶iv)至少30%的细胞显示出GSTAl-l的功能活性，v)至少50%的细胞显示出通过分析所述药物代谢产物测量的功能活性的CyplA2、Cyp3A4和/或Cyp2C9。糖原贮积是肝细胞样细胞的另一个显著特征。此外，肝细胞样细胞和成肝细胞样细胞的百分比对于Notch-2是阳性的。Notch信号传导通路广泛用于成人中的胚胎发育和稳态的维持。它也是构成干细胞信号网络的关键通路之一。在哺乳动物中，迄今为止已鉴定了4种Notch受体(Notchl-Notch4)和5种结构上相似的Notch配体(Delta-样1[也称为Deltal]、Delta-样3、Delta-样4、Jaggedl和Jagged2)。Notch配体是单次跨膜蛋白质。通过与邻接细胞上表达的配体结合，激活Notch受体，这导致蛋白水解释放和Notch的细胞内结构域的核转位，这反过来调节分化。Notch-2在胚胎发育期间广泛表达且在许多器官中具有关键作用。在肝脏中，Notch-2涉及肝内导管的形成和分化(Ader等人，2005，Kodaaia等人，2006)。因为肝脏样细胞由干细胞产生，所以了解notch信号传导在这些细胞类型中的作用是重要的。肝细胞样细胞显示出肝细胞一般的形态，即它们具有多角形细胞形状、大细胞直径(约25-50mM)、通常是双核的且显示出积聚脂质颗粒的趋势。AAT、CK18、HNF-3P、白蛋白和LFABP都是肝特异性标记物，并且像这样它们的表达是肝细胞样细胞标志。然而，并非所有这些肝特异性标记物都必须在根据本发明的细胞群体的所有细胞中表达。依赖它们假定的用途，即使仅表达这些标记物中的1种，例如仅2种、仅3种或仅4种的细胞也可以类似于肝细胞地发挥作用，且因此用于上述目的。为了研究例如通过细胞裂解的代谢，需要至少CYP和GST。为了研究摄取，0ATP是重要的，且此外对于排泄研究，需要例如BSEP或MRP-2。研究越可能在体内进行，需要越多的这些特征。更好的是可能具有肝细胞样细胞连同其他肝细胞类型，例如巨噬细胞和枯否细胞(Kuppffercell),提供肝环境以及细胞间相互作用。这种类型的培养系统可以是一种或多种细胞类型包埋在其内的夹层形状，并且这个3D结构以及更多的体内模拟情况可以潜在地进一步使得肝细胞样细胞显示出极性，即显示朝向血液的一个亲水侧和朝向胆汁一个疏水侧。对于毒性研究，由于它们的相互作用，i和n期代谢酶都是需要的。此外，希望所述细胞群体与已知药物诱导物反应，由此例如I期23和/或II期代谢酶是可诱导的。在本发明的一个实施方案中，具有上述特征i)-vi)中的至少3个的细胞群体中至少约30%,例如至少约40%、至少约50%、至少约60°/。、至少约70%、至少约80%、至少约90或至少约95%的细胞，显示出至少2个，例如至少3个、至少4个、至少5个或所有下述特征oc-l-抗胰蛋白酶、CK18、HNF-3p、白蛋白或LFABP。在一个具体实施方案中，至少一个特征属于药物转运蛋白类(即特征i)-iii))和至少一个特征属于药物代谢酶类(即特征iv)-vi))。因此，除了一种或多种肝特异性标记物外，所述细胞群体可以进一步具有至少一个所述药物转运蛋白特征和至少一个所述药物代谢特征。更具体而言，根据本发明的细胞群体具有特征i)-vi)中的至少4个，例如至少约5个或所有6个。特征i)涉及包含肝细胞样细胞的细胞群体中的细胞百分比，所述细胞在根据本发明的细胞群体中显示出药物转运蛋白BSEP的蛋白质和/或基因表达。BSEP代表胆汁盐输出泵且是ATP结合盒(ABC)转运蛋白，其使用ATP水解的能量催化分子通过细胞外和细胞内膜的转运，且因此例如将药物输出到胆汁内(通常位于体内称为肝细胞的顶侧上)。在本发明的一个实施方案中，包含肝细胞样细胞的细胞群体中至少5%，例如至少10%、至少15%、至少20%、至少30%、至少40%或至少50%的细胞显示出BSEP的蛋白质和/或基因表达。特征ii)涉及包含肝细胞样细胞的细胞群体中的细胞百分比，所述细胞在根据本发明的细胞群体中显示出药物转运蛋白MRP2的蛋白质和/或基因表达。MRP2代表多药物抗性蛋白质2，并且也是ABC转运蛋白家族的成员且将药物代谢产物输出到胆汁内。在本发明的一个实施方案中，包含肝细胞样细胞的细胞群体中至少5%，例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%或至少80%的细胞显示出MRP2的蛋白质和/或基因表达。特征Ui)涉及包含肝细胞样细胞的细胞群体中的细胞百分比，所述细胞在根据本发明的细胞群体中显示出药物转运蛋白0ATP2和/或0ATP8的蛋白质和/或基因表达。0ATP-2和0ATP-8代表有机阴离子转运蛋白2和8,并且都是已知例如摄取来自血液的有毒内源性代谢产物和异生物质的OATP家族的成员。OATP在体内位于肝细胞朝向血液的底外侧上。在本发明的一个实施方案中，包含肝细胞样细胞的细胞群体中至少5%，例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%或至少80%的细胞显示出0ATP2和/或0ATP-8的蛋白质和/或基因表达。特征iv)涉及包含肝细胞样细胞的细胞群体中的细胞百分比，所述细胞在根据本发明的细胞群体中显示出药物代谢酶GSTAl-l的蛋白质和/或基因表达。谷胱甘肽转移酶(GST)催化异生物质与谷胱甘肽的缀合并且是II期解毒系统的重要部分。此外在17种不同的人细胞溶质GST亚单位中分成7个类别，命名为例如A、M、P和S。GSTA1-1是成年人肝脏中体内最丰富的亚单位。GSTM1-1也在成年人肝脏中表达，而GSTP1-1在胎儿肝脏中表达至更高程度。在本发明的一个实施方案中，包含肝细胞样细胞的细胞群体中至少30%，例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%或至少80%的细胞显示出GSTAl-l的蛋白质和/或基因表达。特征v)涉及包含肝细胞样细胞的细胞群体中的细胞百分比，所述细胞在根据本发明的细胞群体中显示出选自下述的至少2种药物代谢酶的蛋白质和/或基因表达CYP450s-1A2、-2A6、-2B6、-2C8、-2C9、-2C19一2D6、-2E1、-3A4和-3A7。CYP代表细胞色素P450并且是位于肝脏的内质网中的一类酶。它们的作用是内源性化合物和异生物质的代谢和解毒。高浓度的这些酶出现在肝脏和小肠中，但许多CYP也出现在其他组织中。CYP可以通过许多机制包括抑制和诱导加以改变并且可以在人与人之间不同。CYP系统对于理解药物代谢、药物相互作用和药物诱导的肝毒性是重要的。在本发明的一个实施方案中，包含肝细胞样细胞的细胞群体中至少30%，例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%或至少80%的细胞显示出选自下述的至少2种药物代谢酶的蛋白质和/或基因表达CYP450s-lA2、-2A6、-2B6、-2C8、-2C9、-2C19-2D6、-2E1、-3A4和-3A7。此外，一般的CYP450酶活性可以在此类细胞群体中显示，并且所述细胞群体可以进一步显示出这些CYP450蛋白质中的至少1种，例如至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种或全部IO种的酶促活性。特征vi)涉及包含肝细胞样细胞的细胞群体中的细胞百分比，所述细胞在根据本发明的细胞群体中未显示出II期酶GSTPl-l的蛋白质和/或基因表达。在本发明的一个实施方案中，包含肝细胞样细胞的细胞群体中至少10%，例如至少20%、至少30%,至少40%、至少50%、至少60%、至少70%或至少80%的细胞未显示出GSTP1-1的蛋白质和/或基因表达。此外，表明所述细胞群体可以显示出GST酶促活性，其可以是所述细胞群体的裂解物中的至少0.01jumol/分钟/mg，例如至少0.03Hmol/分钟/mg、至少0,05pimol/分钟/mg、至少1.0nmol/分钟/mg、至少0.07jumol/分钟/mg、至少0,09jiimol/分钟/mg、至少0.11ymol/分钟/mg、至少0.13nmol/分钟/mg或至少0，15iumol/分钟/mg蛋白质。在本发明的一个具体实施方案中，所述细胞群体包括共表达CK18和一种或多种CYP药物代谢酶的细胞，所述CYP药物代谢酶例如，CYP1A2，CYP2A6，CYP2B6，CYP2D6，CYP2E1，CYP2C8、CYP2C9和CYP2C19的组合，或CYP3A4和CYP3A7的组合。除了上述特征外，根据本发明的细胞群体中至少约5%的细胞具有至少一个下述附加特征A.受体vii)至少5%的细胞显示出c-Met的蛋白质和/或基因表达，B.细胞间粘附分子viii)至少5%的细胞显示出ICAM-1的蛋白质和/或基因表达，C.药物代谢酶ix)至少1%的细胞显示出UGT的蛋白质和/或基因表达，26D:转录因子x)至少90%的细胞未显示出0ct-4的蛋白质和/或基因表达。优选地，所述细胞群体具有特征vii)、viii)、ix)或x)中的至少2个，例如至少3个、或全部4个。特征vii)涉及根据本发明的细胞群体中的受体c-Met的蛋白质和/或基因表达的水平。c-Met是肝细胞生长因子和/或分散因子受体，由此预期肝细胞样细胞响应细胞内调节和机制(甲基化)且具有与体内人肝细胞相同的细胞内调节和机制(甲基化)。在本发明的一个实施方案中，包含肝细胞样细胞的细胞群体中至少10%，例如至少20%、至少30%，至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%的细胞显示出c-Met的蛋白质和/或基因表达。特征viii)涉及根据本发明的细胞群体中的细胞间粘附分子ICAM-1的蛋白质和/或基因表达的水平。ICAM-1是对于肝脏中的细胞间相互作用重要的细胞内粘附分子。在本发明的一个实施方案中，包含肝细胞样细胞的细胞群体中至少10%,例如至少20%、至少30%,至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%的细胞显示出ICAM-1的蛋白质和/或基因表达。特征ix)涉及根据本发明的细胞群体中药物代谢酶UGT的蛋白质和/或基因表达的水平。尿苷二磷酸葡糖醛酸基转移酶同样是负责给脂溶性化学制品、2种内源性底物以及药物和其他异生物质酶促添加糖的GSTII期代谢酶。在哺乳动物中，葡糖醛酸是用于阻止代谢的废弃物和来自环境或药物的脂溶性化学制品在体内积聚至可能有毒的水平的主要糖。特别地UGT2B7是成年人肝脏中重要的II期酶，例如它与Cyp2C9和Cyp3A4合作以代谢药物双氯芬酸。在本发明的一个实施方案中，包含肝细胞样细胞的细胞群体中至少5%，例如至少10%、至少20%、至少30%,至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%的细胞显示出UGT的蛋白质和/或基因表达。此外，表明所述细胞群体可以显示出UGT酶促活性。特征x)涉及包含根据本发明的肝细胞样细胞的细胞群体中的细胞百分比，所述细胞未显示出转录因子0ct-4的蛋白质和/或基因表达。0ct-4是其表达是未分化的hBS细胞的特征的转录因子，其在包含肝细胞样细胞的细胞群体中的存在是不希望的。因此，无或低0ct-4表达表明它们不再是未分化的hBS细胞，这例如在再生医学中是有利的，因为未分化的细胞群体随后可以潜在地产生畸胎瘤样组织。在本发明的一个实施方案中，包含肝细胞样细胞的细胞群体中至少10%，例如至少20%、至少30%，至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少8(Jo/。或至少90%的细胞显示出0ct-4的蛋白质和/或基因表达。上述特征i)-x)中的一些可在添加诱导物后被诱导，所述^"导物可以选自单独或组合的地塞米松、奥美拉唑。诱导物还可以包含利福平、地塞米松、脱氧苯巴比妥、乙醇、奥美拉唑和异烟肼。这样至少一种CYP450蛋白质的表达可在添加诱导物后被诱导。此外，GSTAl-l和/或GSTMl-l蛋白质的表达可在添加诱导物后被诱导。UGT蛋白质的表达也可在添加诱导物后被诱导。些特征i)-x)。在本文中:术语"维持的特征,意指经过限定培养和分析阶段稳定的蛋白质表达，这可以例如用免疫组织化学以及测量和比较表达强度被进一步显示。因此，包含根据本发明的肝细胞样细胞的细胞群体可以在体外培养至少1个月，例如至少1周、或至少72小时，仍保持特征。在本发明的一个实施方案中，所述包含肝细胞样细胞的细胞群体或其亚群进一步表达AFP。对于某些其它器官模拟的应用，可能还需要其他肝细胞类型，例如枯否细胞和/或巨噬细胞。各自特征中的某些选择前使用，、获得更高的得i。'可以通过使用就细胞表面上表达的肝标记物的抗原检测和后续的FAC分选纯化所述细胞。关于基于抗原的分选的其他备选方法是用特异性抗体包被培养亚，加入皿中且使得具有正确抗原的细胞结合，并且弃去其余细胞，并且收获结合的细胞用于进一步使用。这种方法有时称为免疫淘选且还可以作为阴性选择来进行，即将不需要的细胞类型与包被抗原结合，并且保存在悬浮液中具有肝细胞样细胞的培养基。这种方法也可以在磁珠上良好地执行，所谓的MAC分选或使用柱层析良好执行。纯化细胞的其他的方法，例如具有特异性特征的肝细胞样细胞，包括使用密度梯度培养基用于在离心下基于浮力密度或大小的细胞分离。用于获得肝细胞样或成肝细胞样细胞的纯化群体的另外一种备选方法是对hBS细胞衍生的细胞的混合群体执行阳性或阴性选择。2种选择方法可以通过下述手工进行将细胞切割成片或添加并暴露于酶(例如胶原酶IV或胰蛋白酶)或螯合剂(例如EDTA)，或甚至合适的酶和螯合剂的混合物。在本发明的一个具体实施方案中，将培养i用无钙/镁PBS洗涤2次，且随后在无钙/镁PBS中稀释的0.5mMEDTA中温育，这导致去掉非肝细胞样或非成肝细胞样细胞，并且留下在小鼠胚胎饲养者上完整生长的肝细孢样细胞类型的阴性选择。另外暴露于所述螯合剂和/或酶后，使肝细胞样细胞与饲养细胞和皿分离以进一步集中并且在实验中使用。在本文中，术语"肝细胞样细胞"意指表达HNF3P和AFP中的至少一种，且具有增殖能力的细胞。因此，本发明的一个实施方案涉及衍生自hBS细胞的细胞群体，其中所述细胞群体中至少约10%的细胞表达HNF3P和AFP中的至少一种，且具有增殖能力，并且所述细胞群体具有下述4个特征中的至少2个A.受体i)至少1%的细胞显示出oc-6-整联蛋白的蛋白质和/或基因表达，ii)至少1%的细胞显示出c-Met的蛋白质和/或基因表达，B.细胞间粘附分子iii)至少1%的细胞显示出ICAM-1的蛋白质和/或表达，C:转录因子iv)至少10%的细胞显示出HNF-4a的蛋白质和/或表达。D.细胞角蛋白v)至少1%的细胞显示出CK19的蛋白质和/或表达，vi)至少1%的细胞显示出CK7的蛋白质和/或表达，E.上皮细胞粘附分子vii)至少1%的细胞显示出EpCAM的蛋白质和/或表达。它们具有高核质比且在形状上是立方形也是成肝细胞样细胞的显著特征。此外，它们可以具有在细胞质中的小核仁和颗粒。优选地所述细胞可以是直径10-30jam。成肝细胞样细胞是具有内胚层起源的细胞，其具有进一步分化成肝细胞样细胞的能力。HNF3P是内胚层标记物，并且内胚层沿着发育路径朝向肝细胞。也已知HNF3P在胰腺中表达。在本文中，术语"增殖能力"意指细胞群体中的细胞处于分裂中。可以由朝向成肝细胞样和肝细胞样细胞分化的hBS细胞表达的除HNF3P外的其它内胚层标记物的例子是Gata4、Cdx2(尾相关同源异形盒转录因子)、Sox17(含Sry盒的基因17的基因产物)、Pdxl(胰腺十二指肠同源异形盒因子-l)和AFP，其中后者通常视为胎儿肝脏标记物。此外，成肝细胞样细胞可以是增殖的，这是其祖先状态的一个标志，即它们是未成熟的和完全分化的肝细胞样细胞。细胞的增殖状态可以通过多种方法进行显示，例如BrdU掺入和后续染色，或使用对于增殖细胞特异的蛋白质标记物例如KI67的另一种染色，所述KI67在固定时染色群体中的增殖细胞。关于成肝细胞样细胞的特征i)-vii)是对于肝发育重要的体内关联标记物。特征i)涉及包含成肝细胞样细胞的细胞群体中的细胞的百分比，所述细胞显示出ot-6-整联蛋白受体的蛋白质和/或基因表达。oc-6-30整联蛋白是层粘连蛋白受体。层粘连蛋白受体是例如发育中的肝脏中的细胞外基质的部分，且在体内在许多细胞类型例如成肝细胞和肝细胞上表达。在本发明的一个实施方案中，包含成肝细胞样细胞的细胞群体中至少5%，例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%的细胞显示出oc-6-整联蛋白受体的蛋白质和/或基因表达。特征ii)涉及包含成肝细胞样细胞的细胞群体中的细胞的百分比，所述细胞显示出c-Met受体的蛋白质和/或基因表达。在本发明的一个实施方案中，包含成肝细胞样细胞的细胞群体中至少5%，例如至少10%、至少20°/。、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%的细胞显示出c-Met受体的蛋白质和/或基因表达。特征iii)涉及包含成肝细胞样细胞的细胞群体中的细胞的百分比，所述细胞显示出细胞间粘附分子ICAM-1的蛋白质和/或基因表达。在本发明的一个实施方案中，包含成肝细胞样细胞的细胞群体中至少5%，例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%的细胞显示出细胞间粘附分子ICAM-1的蛋白质和/或基因表达。特征iv)涉及包含成肝细胞样细胞的细胞群体中的细胞的百分比，所述细胞显示出转录因子HNF-4oi的蛋白质和/或基因表达。这种转录因子在内胚层细胞类型中特异表达，且因此是成肝细胞样细胞的标志。在本发明的一个实施方案中，包含成肝细胞样细胞的细胞群体中至少5%，例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70。/。、至少80%或至少90%的细胞显示出HNF-4ot的蛋白质和/或基因表达。特征v)涉及包含成肝细胞样细胞的细胞群体中的细胞的百分比，所述细胞显示出细胞角蛋白19的蛋白质和/或基因表达。这种细胞角蛋白在肝干细胞和成肝细胞但不在肝细胞中特异表达，且因此是成肝细胞样细胞的标志。在本发明的一个实施方案中，包含成肝细胞样细胞的细胞群体中至少5%，例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%的细胞显示出细胞角蛋白19的蛋白质和/或基因表达。特征vi)涉及包含成肝细胞样细胞的细胞群体中的细胞的百分比，所述细胞显示出细胞角蛋白7的蛋白质和/或基因表达。这种细胞角蛋白在肝干细胞和成肝细胞但不在肝细胞中特异表达，且因此是成肝细胞样细胞的标志。在本发明的一个实施方案中，包含成肝细胞样细胞的细胞群体中至少5%，例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%的细胞显示出细胞角蛋白7的蛋白质和/或基因表达。特征vii)涉及包含成肝细胞样细胞的细胞群体中的细胞的百分比，所述细胞显示出上皮细胞粘附分子的蛋白质和/或基因表达。这种上皮细胞粘附分子在肝祖先但不在肝细胞中特异表达，且因此是成肝细胞样细胞的标志。在本发明的一个实施方案中，包含成肝细胞样细胞的细胞群体中至少5%，例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%的细胞显示出上皮细胞粘附分子的蛋白质和/或基因表达。在本发明的一个实施方案中，具有上述特征i)-vii)中的至少2个的细胞群体中至少15%，例如至少20%、至少25%、至少30%、至少35%、至少40%、至少45%、至少50%、至少55%、至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%或至少95%的细胞表达HNF3P和AFP中的至少一种，且具有增殖能力。此外，包含成肝细胞样细胞的细胞群体可以具有特征i)-vii)中的至少3个或全部4个。在本发明的另一个实施方案中，包含成肝细胞样细胞的细胞群体进一步具有至少一个下述特征F.药物转运蛋白viii)至少1%的细胞显示出BSEP的蛋白质和/或基因表达，ix)至少1%的细胞显示出MRP2的蛋白质和/或基因表达，BSEP和MRP2对于已在朝向肝细胞样细胞的发育期间执行药物转运过程可能是重要的，因为代谢、解毒和排泄也可能是这个发育阶段所需的。^它^途才面由于药物转运和药物代谢酶的表达，本发明的肝细胞样细胞和成肝细胞样细胞都很好地适合于在中使用。因此，本发明中描迷的细胞群体可以用于制备用于预防和/或治疗由下述引起的病理状态和/或疾病的药物产品组织变性例如肝脏组织的变性，肝脏病症，例如选自下述的肝脏病症自身免疫病症包括原发性胆汁性肝硬变；代谢病症包括血脂异常；由例如酒精滥用引起的肝脏病症；由病毒引起的疾病，例如乙型肝炎、丙型肝炎和甲型肝炎；由对于例如药学药物的急性毒性反应引起的肝脏坏死；和在患有例如肝细胞癌的患者中的肿瘤摘除，以及K谢病理状态和/或疾病。此外，根据本发明的肝细胞样细胞和成肝细胞样细胞适合用于筛选目的。例如所述细胞可以在用于就肝细胞毒性筛选化合物的方法中使用，所述方法包括使来自根据本发明的细胞群体的细胞暴露于化合物，且测定化合物对于细胞是否是毒性的。所述细胞还可以在用于就其调节肝细胞功能的能力筛选化合物的方法中使用，所述方法包括使来自根据本发明的细胞群体的细胞暴露于化合物，测定细胞中起因于与化合物接触的任何表型或代谢变化，且使变化与调节肝细胞功能的能力相关联。对于在再生医学中的用途，hBS细胞必须已衍生自无异物hBS细胞(参见实施例1),并且另外在分化、分离和可能的次代培养期间从不直接或间接地暴露于非人动物衍生的组分。这可以通过专有地使用人衍生的组分例如重组培养基和添加剂来实现。^,斧/务W才法根据本发明的细胞群体无需使用分化试剂而获得，所述分化试剂通常被其他人使用。分化试剂具有对细胞有毒的缺点，这导致通过此厶—一一一"一一"，,33量。本发明人已鉴定了无需使用分化试剂而允许hBS细胞分化成肝细胞样细胞和/或成肝细胞样细胞的培养条件。用于制备根据本发明的肝改善的得率。此外，获得的细胞具有本文描述的特征，所述特征使得这些细胞特别适合于本文其他地方提及的应用。在本发明的一个实施方案中，成功地进行了hBS细胞在96孔平板中分化成肝细胞样细胞。96孔的至少50%、60%、70%、80%、90%或100%在hBS细胞分化成肝细胞样细胞中是成功的。hBS细胞将在根据本发明的方案，例如在第20、25、30或35天时分化成肝细胞样细胞。此外，根据本发明的方法是比已知方法较不费力的。不需要昂贵的因子作为培养基的添加剂，除bFGF外，其以比先前报告更低量且更不频繁地添加，这些一起使得该方法比已知方法更便宜。该方法依赖从细胞分泌的内在因子，而不是具有或多或少毒性特征的任何潜在添加剂，即，温和的、更生理学相关的环境。因此，该方法依赖很少发生的培养基替换和部分培养基替换。毒性物质仅用于证实某些诱导酶的可诱导性。此外，该方法依赖对于朝向肝细胞样细胞的分化关键的mEF细胞。关于hBS细胞分化的mEF细胞浓度可以是20.000细胞/cm2-200.000细胞/cm2，例如约30.000-100.000细胞/cm2，例如40.000-70.000细胞/cm2，例如52.000细胞/cm2。对于朝向肝细胞样细胞的分化法重要的一种其他因子是bFGF的存在，其在分化前加入培养基中。用于本发明的原材料适当地是多能未分化的hBS细胞，例如未分化的hBS细胞系。此类材料可以得自CellartisAB且还可通过NIH干细胞登记处http://stemcells.nih.gov/research/registry/获得。CellartisAB具有2种hBS细胞系(SAOOl和SA002)和可通过NIH获得的SA002的一种亚克隆(SA002.5)。这些hBS细胞系已在本发明中频繁使用。推荐作为原材料的hBS细胞的特征是下述对于碱性辨酸酶、SSEA-3-SSEA-4、TRA1-60、TRA1-81、0ct-4是阳性，对于SSEA-1、端粒酶活性以及在体外和体内的多能性是阴性(后者通过免疫缺陷小鼠中的端粒形成显示)(图1)。在使用前，用作原材料的hBS细胞系可以衍生自实施表征程序的LOT制备。hBS细胞系的LOT制备构成根据标准方法(审理中的专利，W02004098285)的hBS细胞的扩展和随后冷冻一次单次传代中超过100个吸管。在冷冻前和后以及在细胞从LOT解冻后的后续培养的连续传代中监控hBS细胞系的形态。LOT冷冻的质量通过检查解冻回收率进行验证，这应当显示对于IO次解冻的每一个吸管100%的解冻率。随后对冷冻的传代中的细胞和培养基执行对于微生物学安全性的安全性测试，以确保细胞不含污染物。执行的表征程序包括广泛范围的方法以验证hBS细胞系的分化状态。首先执行对于未分化的细胞的通常接受的标记物(SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-l-60、TRA+81、Oct-4和ALP)的标记物表达分析。通过核型分析和FISH检查细胞经过传代和冷冻-解冻循环的遗传稳定性。使用TeloTAGGGTelomerasePCRELISA簡试剂盒测量端粒酶活性。通过体外分化经由胚状体步骤和通过体内分化经由将hBS细胞移植在免疫缺陷SCID小鼠的肾囊下检查hBS细胞的多能性。本文使用的原材料另外可以是完全无异物衍生的，由此可以获得完全无异物的肝细胞样细胞用于在再生医学中的可能用途。对于hBS细胞的无异物衍生，使用的所有培养基和基质组分、伺养细胞和其他材料可以不衍生自任何非人动物材料或未与任何非人动物材料接触，对于hBS细胞的无异物衍生和此外无异物肝细胞样细胞的合适组分是无异物衍生的人成纤维细胞，例如人包皮成纤维细胞，具有重組生长因子、分化因子和/或潜在的其他添加剂的无血清或基于人血清的培养基，以及用于细胞的分离和繁殖的人重组酶或无菌机械工具。备选原材料是内胚层细胞，即已朝向内胚层谱系(例如内胚层祖细胞)定型的hBS细胞衍生的细胞。此类细胞可以表达一种或多种下述内胚层标记物HNF3P(肝细胞核因子3)、Gata4、Cdx2(尾相关同源异形盒转录因子)、Soxl7(含Sry盒的基因17的基因产物)和Pdxl(胰腺十二指肠同源异形盒因子-1)。本发明的一个实施方案涉及用于制备包含根据本发明的成肝细胞样细胞和/或肝细胞样细胞的群体的方法，其包括下述步骤i)在无血清培养基中的支持基质上，使hBS细胞或衍生自hBS细胞的祖先在体外分化至少5天，ii)约每5天-约每25天替换培养基，iii)通过机械分离来分离细胞，iv)通过用酶处理任选地分离步骤iii)中获得的细胞，v)基于表面抗原表达任选地分选细胞。衍生自hBS细胞的祖先可以表达HNF3P和AFP且具有增殖能力步骤i)中的体外分化执行至少10天，例如至少20天、至少30天或至少40天。对于这个步骤中的分化的给定时间决定获得的细胞具有肝细胞样细胞的特征还是成肝细胞样细胞的特征。因此，为了获得肝细胞样细胞，在无血清培养基中的支持基质上的hBS细胞或衍生自hBS细胞的祖先的体外分化执行约18天-约30天，优选20-27天，更优选约25天，而对于获得成肝细胞样细胞仅需要约5-约10天，优选15天。无血清培养基可以选自VitroHES、补充有bFGF的VitroHESTM和自体同源预适应的VitroHES(已对于肝细胞样细胞进行适应)。无血清培养基可以进一步包含bFGF,优选以约4ng/ml-约200ng/ml，例如约4ng/ml-约150ng/ml、约4ng/ml-约100ng/ml、约4ng/ml-约50ng/迈l或约4ng/ml-约10ng/ml的浓度。在本发明的一个实施方案中，无血清培养基是包含bFGF的VitroHES,bFGF的浓度可以是约4ng/ml-约200ng/ml，例如约4ng/ml-约150ng/ml、约4ng/ml-约100ng/ml、约4ng/m卜约50ng/ml或约4ng/ml-约10ng/迈l。bFGF的浓度可以是4ng/ml。在步骤ii)中，可以从约每10天至每20天，例如每约U-18天，例如每14-15天替换无血清培养基。支持基质可以包含饲养细胞，例如人或小鼠飼养细胞，或它可以包含具有限定或未限定组成的细胞外基质。备选地，支持基质可以包含在用于细胞培养的塑料细胞培养瓶的内部上包被的，单独或组合的一种或多种蛋白质的包被，或它可以包含3D环境，例如多孔滤器。在使用多孔滤器作为支持基质的情况下，这种多孔滤器具有直径约4jam的孔径，并且它可以用单独或组合的一种或多种蛋白质进行包被。如上所述用于包被瓶或滤器的一种或多种蛋白质可以选自胶原、层粘连蛋白及其组合。步骤iii)中执行的细胞的机械分离可以通过切割通过细胞形态的目测判断的成肝细胞样细胞和/或肝细胞样细胞来进行。肝细胞样细胞显示肝细胞一般的形态，即它们具有多角形细胞形状、大细胞直径(約25-50mM)、通常是双核的且趋于积聚脂质颗粒。通过经验和充分的实验，已使形态与肝脏标记物例如oc-l-抗胰蛋白酶、CK18、HNF-3卩、白蛋白或LFABP的表达相关。执行的选择可以通过经由免疫组织化学鉴定进一步验证为成肝细胞样细胞或肝细胞样细胞。机械分离的备选方法是通过例如酶或螯合剂或其組合使细胞与其在之上生长的表面和彼此分离，并且这之后通过例如FAC分选、磁珠或免疫淘选来分选细胞。随后可以将细胞以或多或少限定的数目种植在合适的培养瓶和/或分析瓶例如多孔平板中，以进一步用于体外分析。根据本文描述的方法，根据本发明的细胞群体可以在祠养细胞(例如人或小鼠饲养细胞)的存在下获得，或者它们可以在不存在飼养细胞的情况下获得。在不存在饲养细胞的情况下，根据本发明的细胞群体可以使用具有限定或未限定组成的细胞外基质获得，或使用在内部已用单独或组合的一种或多种蛋白质进行包被的塑料细胞培养瓶获得。用于这个目的的合适蛋白质可以选自胶原、层粘连蛋白及其组合。备选地，根据本发明的细胞群体可以使用3D环境(例如多孔滤器)获得。获得肝细胞样细胞的另外方法是经由通过例如不同培养基组成刺胞。随后可以添加且在类型和浓度方面改变不同因子或组分，例如培养基中的血清、生长因子和其他刺激因子。简言之，可以切割勾画的(out-lined)、未分化的hBS细胞片且转移至例如24孔平板的滤器插件。所有培养物随后可以在不同培养基组成中生长，且在不同时间点上实施分析，例如免疫组织化学分析，以找到用于使肝细胞样细胞或成肝细胞样细胞的得率最大化的最佳时间窗。获得肝细胞样细胞或成肝细胞样细胞的另外一种方法可以是使hBS细胞或衍生自hBS细胞的内胚层祖细胞与例如肝脏片，例如与如下文实施例2中说明的人成年肝脏或与另一个物种的器官片或细胞类型共培养，例如刺激朝向肝细胞样细胞分化的出租小鼠胚胎肝脏共培养。在此类系统中的共培养对于3D结构，例如肝细胞和导管的簇的形成是有利的。此外，朝向肝细胞样和成肝细胞样细胞的增殖状态的诱导可以通过在针对肝细胞调整的包含例如生长因子的培养基中培养被诱导。在本发明的一个具体实施方案中，获得的细胞群体可以是无异物的。本发明的一个实施方案涉及用于制备包含根据本发明的肝细胞样细胞的群体的改良方法，其包括下迷步骤i)在适合于培养hBS细胞的培养基例如VitroHESTM培养基中使hBS细胞体外分化多至10-30天、优选13-27天的时间段，例如直至第15天或23天。例如，100%的培养基可以用新肝细胞培养基替换，且随后替换50%，ii)在第10-40天时、优选在第13-35天时，例如在第l5天时或第23天时替换成针对培养肝细胞优化的新培养基，例如HCM培养基。所述培养基可以包含一种或多种下述组分牛血清白蛋白、抗坏血酸、表皮生长因子、转铁蛋白、胰岛素、氢化可的松和抗生素。用于替换的培养基量可以是30%直至100%。所述培养基可以每周替换3次或每周1次，优选每周1次。此外，该方法可以包括下述步骤iii)任选地添加高浓度的地塞米松多至10天、优选8天iv)任选地添加丁酸钠(NaB)和HGF多至10天、优选5天v)分离细胞vi)通过用酶处理任选地分离步骤ii)中获得的细胞，vii)基于表面抗原表达任选地分选细胞。在一般方法下提及的所有内容和细节就实际的情形应用于上文提及的具体实施方案。试剂盒本发明的另一方面涉及试剂盒，其包括i)包含肝细胞样细胞和/或成肝细胞样细胞的细胞群体，ii)一种或多种成熟因子和/或成熟培养基，和iii)任选地，使用说明书。所述成熟培养基可以选自VUroHESTM、补充有bFGF的VitroHESTM和自体同源预适应的VitroHES(已对于肝细胞样细胞进行适应)。一种或多种成熟因子选自bFGF、表皮生长因子、肝细胞生长因子和制瘤素M。此外，所述试剂盒可以包含用于监控成熟的工具。在一个实施方案中，用于监控成熟的工具包括i)针对编码选自下述的表达标记物的基因中的至少3种，例如至少4种或至少5种的PCR引物:HNF3P、AFP、白蛋白、BSEP、MRP2、0ATP-2、0ATP-8、GSTAl-l、CYP450-1A2、CYP450-2A6、CYP450-2B6、CYP450-2C8、CYP450-2C9、CYP450-2C19CYP450-2D6、CYP450-2E1、CYP450-3A4、CYP450-3A7、GSTMl-l和UGT,和ii)用户手册。在另一个实施方案中，用于监控成熟的工具包括i)针对选自下述的表达标记物抗原中的至少3种，例如至少4种或至少5种的抗体:HNF3p、AFP、白蛋白、BSEP、MRP2、OATP-2、0ATP-8、GSTAl-l、CYP450-1A2、CYP450-2A6、CYP450-2B6、CYP450-2C8、CYP450-2C9、CYP450-2C19CYP450-2D6、CYP450-2E1、CYP450-3A4、CYP450-3A7、GSTMl-l和UGT，和ii)用户手册。39用于监控细胞的其它工具是PROD测定法组分和用于培养基中的尿素和/或白蛋白检测的组分。参考文献Schwarz，Robert.E，等人,DefinedconditionsfordevelopmentoffunctionalHepaticCellsfromhumanembryonicstemcells,STEMCELLSANDDEVELOPMENT14:643-655(2005).Rambhatla，Generationofhepatocyte-likecellsfromhumanembryonicstemcells,CellTransplant.2003;12(1):l-llHeins等人，Derivation，characterization，anddifferentiationofhumanembryonicstemcells;StemCells;2004;22(3):367-76.WO03055992,用于建立多能胚泡衍生干细胞系的方法W02005/097980W001/81549图例厉J原材料hBS细胞的特征，即U)形态、(B)SSEA-1(阴性)、(C)SSEA-3、(D)SSEA-4、(E)TRA-l-60、(F)TRA-1-81、(G)0ct-4、(H)ALP(全部来自hBS细胞系SA002、LOTAL002)和(I)通过来自免疫缺陷小鼠的苏木精如伊红染色的畸胎瘤切片举例说明的体内多能性，其中外胚层组织标记直至右上侧、内胚层组织至右下侧、和中胚层组织至左侧(来自hBS细胞系SAin)。痴2显示了对于肝脏标记物(A)白蛋白和(B)CK-18连同(C)DAPI(核)和(D)阶段对照染色阳性的肝细胞样细胞，全都针对SA002，第56代，在mEF上分化U天后。窗J显示了对于肝脏标记物(A)AAT和(B)HNF3P连同(C)DAPI染色阳性的肝细胞样细胞，全都针对SA034，第137代，在mEF上分化32天后。窗^显示了针对SA034，第135代，在mEF上分化25天后对于肝脏标记物(A)LFABP染色阳性的肝细胞样细胞，和针对SA002,第56代，在mBF上分化23天后对于早期肝脏标记(B)AFP弱阳性的肝细胞样细胞。窗J显示了针对SA002，第63代，在mEF上分化23天后与(B)CyplA2共表达的(A)CK18。反应性可以以显微镜和颜色清楚显现。窗f显示了针对SA002，第63代，在mEF上分化23天后与(B)Cyp2A6共表达的U)CK18。Cyp蛋白质表达还可以使用利福平、地塞米松、脱氧苯巴比妥、乙醇、奥美拉唑和异烟肼的CYP诱导物混合物被进一步诱导(数据未显示)。反应性可以以显微镜和颜色清楚显现。街7显示了针对SA002,第63代，在mEF上分化U天后与(B)Cyp286共表达的(A)CK18。反应性可以以显微镜和颜色清楚显现。显示了针对SA002，第63代，在mEF上分化23天后与(B)Cyp2C8/9/19共表达的(A)CK18。Cyp蛋白质表达还可以使用利福平、地塞米松、脱氧苯巴比妥、乙醇、奥美拉唑和异烟肼的CYP诱导物混合物被进一步诱导(数据未显示)。反应性可以以显微镜和颜色清楚显现。^夕显示了针对SA002,第63代，在mEF上分化23天后与(B)Cyp206共表达的(A)CK18,Cyp蛋白质表达还可以使用利福平、地塞米松、脱氧苯巴比妥、乙醇、奥美拉唑和异烟肼的CYP诱导物混合物被进一步诱导(数据未显示)。反应性可以以显微镜和颜色清楚显现。显示了针对SA002,第63代，在mEF上分化23天后与(B)Cyp2El共表达的(A)CK18。Cyp蛋白质表达还可以使用利福平、地塞米松、脱氧苯巴比妥、乙醇、奥美拉唑和异烟肼的CYP诱导物混合物被进一步诱导(数据未显示)。反应性可以以显微镜和颜色清楚显现。显示了针对SA002，第63代，在mEF上分化23天后与(B)Cyp3A4/7共表达的(A)CK18。Cyp蛋白质表达还可以使用利福平、地塞米松、脱氧苯巴比妥、乙醇、奥美拉唑和异烟肼的CYP诱导物混合物被进一步诱导(数据未显示)。反应性可以以显微镜和颜色清楚显现。窗"显示了在用诱导混合物处理后，通过蛋白质印迹显现的肝细胞样细胞中的Cyp3A4/7和Cyp1A2的可诱导性。诱导的hBS细胞(利福平、地塞米松、脱氧苯巴比妥、乙醇、奥美拉唑和异烟肼的Cyp诱导物混合物96小时):针对SA002(LOTAL002)第51、53、54和55代，在mEF上分化23-25天后，以及SA002.5(LOTBE002.5)第51、52、54和55代，在mEF上分化23-24天后。未处理的hBS细胞针对SA002(LOTAL002)第47、52和56代，在mEF上分化19-23天后，以及SA002.5(LOTBE002.5)第48、53和55代，在mEF上分化19-26天后'HepG2(目录号HB-8065，ATCC):第23代作为阴性对照。原代角质形成细胞(目录号C-12003,Promocell)以笫2代作为阴性对照。解冻且新鲜制备的人原代肝细胞(男性和女性)用作阳性对照。P-肌动蛋白用作内部装载对照。痴"显示了使用PROD测定法的一般Cyp活性。本文通过照片亮度显现的，该活性在用Cyp诱导物(如上)处理后得到增加。阶段对照(A)和PROD荧光(B)中的未处理细胞，阶段对照(C)和PROD荧光(D)中的诱导细胞。阶段对照(E)和PROD荧光(F)中的技术对照(未给细胞添加PR0D)。所有照片针对SA002笫56代，在mEF上分化26天后。照片使用AdobePhotoshop从红色转变成黄色以更好地以灰度等阶显现亮度。显示了通过添加利福平、地塞米松、脱氧苯巴比妥、乙醇、奥美拉唑和异烟肼的混合物诱导前(A)和后(B)的GSTAl-l、诱导前(C)和后(D)的GSTMl-1以及诱导前(E)和后(F)的GSTPl-l表达。对于GSTM1-1和GSTP1-1,无法观察到明确的诱导，而对于GSTA1-1观察到轻微诱导。照片使用AdobePhotoshop从红色转变成黄色以更好地以灰度等阶显现亮度。窗"显示了在用诱导混合物处理后通过蛋白质印迹在肝细胞样细胞中的GSTAl-1诱导。SA002.5(LOTBE002.5)第35、36、43和46代，以及SA167(LOTCE167)第17、18、25和28代，在mEF上分化20-26天后，两者未处理或用利福平、地塞米松、脱氧苯巴比妥、乙醇、奥美拉唑和异烟肼的CYP诱导物混合物处理96小时。GST蛋白质制剂以及人男性和女性新鲜制备的(解冻的)原代肝细胞用作对照。痴"针对衍生自3种不同的hESC系的肝细胞样细胞以及人肝细胞和HepG2细胞中的CDNB的GST酶促活性，表示为jamol缀合的底物/分钟/mg总蛋白(平均值±SD，n-3)。街〃显示了对于II期代谢酶UGT1A1和UGT1A6的肝细胞样细胞的免疫反应性。UGT1A1(A)与CK18(B)共表达，和UGT1A6(C)与CK18(D)双重染色，全都针对SA002第59代，在mEF上分化24天后。反应性可以以显微镜和颜色清楚显现。43显示了对药物转运蛋白0ATP-2/8的肝细胞样细胞的免疫反应性。针对SA002第56代，在mEF上分化23天后的(A)DAPI、(B)0ATP-2/8、(C)阶段对照。照片使用AdobePhotoshop从红色转变成黄色以更好地以灰度等阶显现亮度。反应性可以以显微镜和颜色清楚显现。显示了对药物转运蛋白BSEP的肝细胞样细胞的免疫反应性。针对SA002第32代，在mEF上分化23天后的(A)DAPI、(B)BSEP、(C)阶段对照。照片使用AdobePhotoshop从红色转变成黄色以更好地以灰度等阶显现亮度。反应性可以以显微镜和颜色清楚显现。窗M显示了对药物转运蛋白MRP-2的肝细胞样细胞的免疫反应性。关于SA002第33代，在mEF上分化22天后的(A)DAPI、(B)MRP-2、(C)阶段对照。照片使用AdobePhotoshop从红色转变成黄色以更好地以灰度等阶显现亮度。反应性可以以显微镜和颜色清楚显现。窗"显示了来自细胞系SA002,L0TAL002，第l5代在分化第n天时肝细胞样细胞中的糖原贮积。糖原通过PAS染色系统检测为淡红色染色。培养物在糖原检测前用人唾液进行处理(B和D)或未处理(A和C)。资"显示了对在Matrigel上分化的肝细胞样细胞的CYP和GST免疫染色。(A)CyplA2与(B)Cyp2B6共表达，和(C)CK18与(D)GSTAl-l共表达，全都针对SA002,第57代，在Matrigel上分化"天后。照片使用AdobePhotoshop从红色转变成黄色以更好地以灰度等阶显现亮度。忠"显示了与来自相同量cDNA的未分化的hBS细胞的对照样品(BE002.5，第W代，笫5天(对照样品1)和BE002，第62代，第4天(对照样品2))相关，使用QPCR在来自细胞系SA002.5，LOTBE002.5，第2代分化第21天的高MRP-2表达。表达水平由针对3种细胞样品获得的CT值(阈值循环)进行计算且进一步与对照样品2的表达进行比较。肝细胞样细胞中的MRP2表达在未分化的细胞中高11-32倍。窗W显示了肝细胞样细胞中的Cyp1A2表达的诱导，未处理的肝细胞样细胞(A)和相应的阶段对照(B)以及诱导的(C)和相应的阶段对照(D)。照片使用AdobePhotoshop从红色转变成黄色以更好地以灰度等阶显现亮度。窗"显示了肝细胞样细胞中的Cyp2B6表达的诱导。未处理的肝细胞照片使用AdobePhotoshop从红色转变成黄色以更好地以灰度等阶显现亮度。窗"显示了通过与胚胎小鼠肝脏共培养的hBS细胞形成的AFP阳性成肝细胞样细胞。红色的人特异性核抗原(差异染色核)显示hBS细胞产生绿色的内胚层衍生的AFP阳性大簇(参见实施例2)。显示了衍生自细胞系SA167(A和B)、SA002(CandD)和SA002.5(E和F)的未处理的和诱导的肝细胞样细胞中的CyplA2、3A4/7和1A1蛋白质表达的蛋白质印迹分析。A、C、E:未处理的细胞，B、D、F:用诱导物混合物处理的细胞。G:人肝细胞LotGIU22(对于CYP1AlLotMY0)，H:未处理的hESC系SA002.5，I:MEF，J:HepG2细胞和K:重组CYP1A1.窗"(A)显示了针对肝/内胚层标记物HNF4a的反应，(B)显示了针对用于显示群体中的增殖细胞比例的标记物Ki67的反应，(C)显示了在许多成肝细胞样细胞中共定位的HNF4cc和Ki67，(D)显示DAPI(染色核)和(E)显示形态。窗"显示了涉及作为响应培养基的增殖能力及其诱导的结果。(参见实施例4)。(A)-(C)显示在VitroHESTM中培养的SA002细胞的肝细胞样细胞，其中(A)显示形态，(B)显示对于KI67标记物无反应(即无增殖)和(C)显示对于肝脏标记物ot-1-抗胰蛋白酶的反应。(D)-(F)显示在WillimasE培养基中培养的肝细胞样SA002细胞，其中(D)显示形态，(E)显示对于KI67标记物的反应(增殖)和(F)显示对于肝脏标记物ot-l-抗胰蛋白酶的反应。窗"显示了肝细胞样细胞和原代肝细胞中的EROD反应。左列显示在(从顶部)未处理的、奥美拉唑+利福平诱导的和6组分混合物诱导的肝细胞样细胞中的EROD活性，并且右列显示原代肝细胞中的相应结果。肝细胞样细胞因此具有特异性Cyp1A2反应性，这也在用Cyp诱导物处理前检测到，尽管那时非常微弱。(参见实施例13)。资X显示了与HepG2比较，hBS细胞衍生的肝细胞样细胞中的Cyp活性。(A)和(D)显示了未处理的肝细胞样细胞，(B)和(E)显示了诱导的肝细胞样细胞，并且(C)和(F)显示了HepG2。窗W显示了肝细胞样细胞和原代肝细胞中的PROD反应。左列显示在(从顶部)未处理的、朴米酮诱导的和6组分混合物诱导的肝细胞样细胞中的PROD活性，并且右列显示原代肝细胞中的相应结果。肝细胞样细胞因此在用Cyp诱导物处理前也具有一般的Cyp活性。(参见实施例4)。窗"显示了具有标记出来的肝细胞小管的大鼠肝细胞(照片来自ProfessorIanCotgreave)(左)和具有小管类似结构的肝细胞样细胞(右)。显示了用于经由成肝细胞样细胞从hBS细胞衍生肝细胞样细胞的流程图。显示了在培养17天后细胞系SA461(第26代)中膜表达的Notch2(绿色，膜中)和核染色(蓝色)的表达。箭头指示双核的肝细胞样细胞。放大倍数250x。街W显示了在肝细胞样细胞、HepG2和人肝提取物的诱导和非诱导培养物中通过实时PCR技术测量和比较的Cyp3A4、3A7、1A1、1A2和Cyp2A6的相对基因表达水平。人肝提取物的测量设为1，并且将所有其他样品就每种细胞色素p450与人肝脏参照相比。关于所有基因的表达针对GAPDH(CYP1A1/1A2、CYP2A6)或TBP(CYP3A4/3A7)进行标准化。窗"显示了用于培养肝细胞样细胞的培养基的改善的研究设计。研究设计A;在15天后将100%的培养基从VUroHESTM替换成HCM，和在23天时将50%的HCM用新HCM培养基进行替换。用细胞系SA002进行该实验。研究设计B;在23天后将100%的培养基从VUroHESTM替换成HCM,用细胞系SA348进行该实验。痴J《显示了根据实验设计A和B，图37和实施例1、2，表5，分别在VitroHES(A)和HCM(B)中培养的肝细胞样细胞的形态。痴"显示了根据实验设计A和B，图37和实施例1、2，表5，与HCM比较，HNF4-ot、白蛋白、CYP3A4和UGT2B7在VitroHES中的相对mRNA表达水平。来自参考方案(VitroHES)的数据设为1，并且在图中呈47现了经由HCM培养基的不同基因的表达水平中的倍数增加。窗"显示了关于用于培养肝细胞样细胞的培养基中的补充和诱导因子的研究设计。研究设计C;在22-24天后添加50iam地塞米松。实验用细胞系SA002、SA167和SA348进行。研究设计D;VitroHESTM培养基在21天后替换成补充有HGF和丁酸钠(NaB)的HCM培养基另外5天。窗W显示了根据实验设计C,图40和实施例1、2、3，表6，在VUroHES(A)和补充有50um地塞米松的VitroHES(B)中培养的肝细胞样细胞的形态。以及，根据实验设计D，图40和实施例1、2，表7，在C)VitroHESTMD)补充有HGF和丁酸钠的HCM中培养的肝细胞样细胞。A)显示了根据实验设计C，图40和实施例1、2、3，表6，在用50jum地塞米松处理后肝细胞样细胞中HNF4-a、白蛋白、CYP3A4和UGT2B7的相对mRM表达水平。B)根据实验设计D，图40和实施例1、2，表7,在用丁酸钠和HGF处理后的相对mRNA表达水平。来自参考方案(VitroHES)的数据设为1,并且在图中呈现了经由不同处理的不同基因的表达水平中的倍数增加。窗"显示了关于培养基替换频率，很少和频繁的培养基替换的研究设计。使用HCM和VitroHES,窗"显示了根据实验设计E，图43和实施例1,表8在很少(A)对频繁(B)的培养基替换后肝细胞样细胞的形态，窗W显示了根据实验设计E，图43和实施例1，表8，与频繁的培养基替换比较，很少的培养基替换后HNF4-ct、白蛋白、CYP3A4和UGHB7的相对mRNA基因表达水平。来自频繁的培养基替换的数据设为1，并且在图中呈现了很少的培养基替换后不同基因的表达水平中的倍数增加。窗"在胶原I包被的96孔上再种植38天大的肝细胞样细胞后3(A)-6(B-C)天。在再种植前用无Ca和MgPBS(A)或胶原酶(B-D)处理肝细胞样细胞的外植体。培养物针对肝细胞标记物CK18(B、D)和HNF3P(C)进行双重染色。比例尺100|im(A)和50|im(B-C)。关于实验细节参见实施例15。窗"显示了在再种植到胶原I包被的(A-C和G-I)和mEF细胞层(D-F和J-L)96孔上5天后，肝细胞样细胞的免疫组织化学和形态。培养物针对成肝细胞标记物HNF4a(A、B、D、E)和CK19(G、H、J、K)进行染色。B、E、H和K中显示了关于核染色的标记物与Dapi的覆盖图。在C、F、I和L中分别可见关于每次染色的相应形态图。图C中的箭头指示双核细胞。比例尺25jum;使用40x物镜。关于实验细节参见实施例18。窗"显示在30天大的培养物中肝细胞样细胞的ICG摄取。显示在15天大的培养物的成肝细胞。该细胞对于CK19(A)、CK7(B)和EpCam(C)是阳性的。实施例实施例1M并用于本发明的原材料是适当地多能未分化的hBS细胞，例如未分化的hBS细胞系。此类材料可以得自CellartisAB且还可通过NIH干细胞登记处http:〃stemcells.nih.gov/research/registry/获得。CellartisAB具有2种hBS细胞系(SA001和SA002)和可通过NIH获得的SA002的一种亚克隆(SA002.5)。此外，在UK干细胞库中列出了20种Cellartis细胞系。这些hBS细胞系和来自CellartisAB的另外SA167和SA348已在本发明中频繁使用。推荐作为原材料的hBS细胞的特征是下述对于碱性磷酸酶、SSEA-3、SSEA-4、TRA1-60、TRA1-81、Oct-4是阳性,对于SSEA-1、端粒酶活性以及在体外和体内的多能性是阴性(后者通过免疫缺陷小鼠中的端粒形成显示)(参见图l)(方法和方案如先前所示，Heins等人，WO03055992)。，浙务和4在勤hBS细胞系的LOT制备构成根据标准方法(审理中的专利，WO2004098285)的hBS细胞的扩展和随后冷冻一次单次传代中超过100个吸管。在冷冻前和后以及在细胞从LOT解冻后的后续培养的连续代中监控hBS细胞系的形态。LOT冷冻的质量通过检查解冻回收率进行验证，这应显示对于10次解冻的每一个吸管100%的解冻率，即在解冻后细胞材料可以从每个单个验证的吸管进行次代培养。随后对冷冻的传代中的细胞和培养基执行关于微生物学安全性的安全性测试，以确保细胞不含污染物。执行的表征程序包括广泛范围的方法，以验证hBS细胞系的分化状态。首先执行对于未分化的细胞的通常接受的标记物(SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-l-60、TRA-1-81、0ct-4和ALP)的标记物表达分析。通过核型分析和FISH检查细胞经过传代和冷冻-解冻循环的遗传稳定性。使用TeloTAGGGTelomerasePCRELISAPLUS试剂盒测量端粒酶活性。通过体外分化经由胚状体步骤和通过体内分化经由将hBS细胞移植在免疫缺陷SCID小鼠的肾囊下检查hBS细胞的多能性。本文使用的原材料另外可以是完全无异物衍生的，由此可以获得完全无异物的肝细胞样细胞用于在再生医学中的可能用途，且因此显著降低移植物排斥的风险和非人病原体的可能转移。对于hBS细胞的无异物衍生，使用的所有培养基和基质组分、伺养细胞和其他材料可以不衍生自任何非人动物材料或未与任何非人动物材料接触。对于hBS细胞的无异物衍生和此外无异物肝细胞样细胞的合适组分是无异50物衍生的人成纤维细胞，例如人包皮成纤维细胞，具有重组生长因子、分化因子和/或潜在的其他添加剂的无血清或基于人血清的培养基，以及用于细胞的分离和繁殖的人重組酶或无菌机械工具。实施例2絲助麟勿應財#内在因子方案(通过暴露于分泌至培养基的内在因子诱导)分化a)对IVF培养皿(Falcon)中的mEF细胞层生长的hBS细胞实施在37^C、5。/。C02和95%湿度下多至40天的分化，以获得肝细胞样细胞。使用的培养基(具有添加的4ng/ml人重组bFGF[Invitrogen]的VitroHES[VitrolifeAB])通过弃去约1-2ml旧培养基且添加l-2ml新鲜培养基每7-21天，通常每14天进行替换。18-30天后，使用锋利的微毛细管或StemCellTool(VitrolifeAB)作为切割和转移工具从培养物中分离肝细胞样细胞，并且随后合并细胞用于长期贮藏(冷冻)或立即使用，或备选地在培养皿中直接固定和染色或用作活细胞用于例如Cyp活性测定法。mEF看起来提供了支持肝细胞样细胞发育的重要信号，因为hBS细胞的分化在不存在mEF的情况下显著改变(例如在Matrigel上的hBS细胞培养中)并且从此类培养得到少得多的肝细胞样细胞(数据未显示)。这可以通过使用用于此类培养mEF适应的培养基的得到部分挽救，说明因子经由mEFs分泌到培养基内。一致地，我们已观察到在培养期间超过2次地替换培养基看起来对于获得肝细胞样细胞是不利的。用于获得肝细胞样细胞的另一个重要因素是用bFGF补充培养基。b)对在补充有4ng/mlbFGF的mEF适应培养基中在Matrigel(Becton-Dickinson)上生长的hBS细胞实施在37t\5%0)2和95%湿度下多至40天的分化，以获得肝细胞样细胞。每7-21天替换使用的培养基。18-30天后，使用锋利的微毛细管或StemCellTool作为切割和转移工具从培养物中分离肝细胞样细胞，并且随后合并细胞用于长期贮藏(冷冻)或立即使用，或进行固定且用于表征例如免疫组织化学。人工且主要依赖形态来进行培养皿中的具有分化细胞群体的肝细胞样细胞和成肝细胞样细胞的选择。通过先前的经验和充分的实验，已主要使用免疫组织化学使形态与肝脏标记物例如实施例3-7中列出的那些的表达相关。使用那些经验，技术人员可以通过形态主动选择肝细胞样细胞。为了获得成肝细胞样细胞，使用相同方案但将温育期缩短至10-20，优选15天。将在IVF皿中在mEF上培养5-IO天的未分化的hBS细胞(BE002.5第42代)切割成小片，且通过使用玻璃毛细管转移至包含400)il培养基的24孔平板的滤器插件(孔径4jumcJ)，对于外植体培养专用的，Millipore)。滤器与培养基表面接触，允许细胞的营养摄取和产生潮湿环境同时防止培养基中的细胞淹没，由此模拟体内情况。所述培养基由50%VitroHES頂和来自补充有4ng/mlbFGF的mEF上的未分化hBS细胞的50%条件培养基构成。每隔天或每第3天替换一半培养基。细胞在分析前分别分化7、14、21和31天。通过免疫组织化学分析W-hBS细胞培养物。在4%PFA中固定培养物，随后在30%蔗糖中低温保存，且包埋在SakuraO.C.T.Ussue-tek中。在形态上和就不同内胚层和肝细胞样标记物的免疫反应性分析10pm的冷冻切片。共培养方案小鼠胚胎肝脏的器官发生可以刺激hBS细胞在3维滤器系统中分化成肝细胞样细胞。分离处于不同发育阶段的EGFP(增强的绿色荧光蛋白)转基因小鼠胚胎的肝脏外植体，且移植到紧挨滤器系统中培养的hBS细胞。作为对照培养，单独的hBS细胞或除肝脏外的小鼠胚胎外植体(心脏和卵黄囊)紧挨hBS细胞移植且在滤器上进行培养。共培养物在补充有4ng/mlbFGF的VitroHES中进行生长，并且每第2或3天替换50%的培养基。第7和14天，制备共培养用于免疫组织化学分析。分析内胚层和肝标记物例如HNF3P、AFP、HNF4oc、CK18、CYP3A4/7和CYP1A2/1。将内胚层衍生结构的量或数目分成4个类别---卜蔟、大蔟、导管和衬里、上皮(参见本文下文的定义)，除上皮外的结构对于内胚层和早期肝标记物AFP、HNF3P和ot-l-抗胰蛋白酶是阳性的。就每种切片和培养物计数不同结构的数目。将每个结构的总数目除以对于每种共培养物计数的切片数目。这得到测量每切片中该结构多长时间发生一次的值，这将给出在3维hBS细胞共培养物中内胚层结构的量的指示。计算每个组(n-3)的平均值和平均值的标准误(SEM)。该研究重复2次。将小簇定义为小于或等于5个对于AFP是阳性的细胞的细胞聚集。将大簇定义为大于或等于6个对于AFP是阳性的细胞的细胞聚集。将形成共同分类的导管和衬里定义为单或多层空心结构。将上皮定义为以与AFP阳性衬里或细胞簇结合的紧密行中的具有延长核的组构结构。上皮对于AFP从不是阳性的。在第14天时，所有组已发生类似量的小簇，而导管和衬里仅存在于包含小鼠胚胎外植体移植物的组中，因此自发分化的hBS细胞不易于形成导管和衬里。然而，与卵黄囊和心脏共培养物以及自发分化的hBS细胞比较，大簇更常存在于肝共培养物中，诸如大簇和导管的结构对于内胚层和肝标记物例如HNF3p、AFP、oc-l-抗胰蛋白酶、HNF-4a、CYP3A4/7和CYP1A2/1是阳性的。然而，簇对于CK18是阴性的，可能指示未成熟的肝细胞样细胞。总之，数据指出hBS细胞可以在与来自E10.5小鼠胚胎的肝脏的胞。表1列出了在与hBS细胞与El0.5胚胎小鼠肝脏共培养14天后通过免疫组织化学分析的肝标记物。<table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>实施例3眉肝标记浙付或在J々W肝细胞样细胞显示出肝细胞的一般形态，即它们具有多角形细胞形状、大细胞直径(约25-50juM)、通常是双核的且趋于积聚脂质颗粒。此外，它们表达对于肝细胞类型描述的几种标记物，例如白蛋白、ocl-抗胰蛋白酶、LFABP、CK18和HNF3P。它们不再表达用于未分化细胞的干细胞标记物，Oct-4。某些推测为较不成熟的肝细胞样细胞仍表达胎儿肝脏标记物AFP。这些细胞优先在分化的hBS细胞的集落内发现。DAPI(4'，6'-二脒基-2-苯吲哚盐酸，SigraaAldrich)作为对照以显现细胞核。(关于在MatrigelTM上分化的肝细胞样细胞中的CK18表达，参见图22。)对于增殖成肝细胞样祖细胞的鉴定，使用AFP、HNF4ct、CK19、CK7和EpCam。(图49)-使用的一抗白蛋白(兔)1:500，DAKOCytomation,A0001AAT(兔)1:200，DAKOCytomation,A0012CK18(小鼠)1:200，DAKOCytomation,M7010LFABP(山羊)1:500，SantaCruz，sc-16064HNF3b(山羊)1:250,SantaCruz，sc-65540ct-4(小鼠)1:500,SantaCruz，sc—5279c-Met(HGF受体，小鼠)1:100，upstate,05-237oc6-integrin(CD49f，大鼠)1:250,BDBiosciences,555736ICAM-1(CD54，小鼠)1:500,BDPharmingen，559047AFP(小鼠)1:200,SIGMA,A8452HNF4alpha(兔)1:400，SantaCruz,sc-8987CK19(小鼠)1:200，Novocastra，NCL-CK19CK7(小鼠)1:200，Novocastra,NCL-L-CK7-560EpCAM-FITC，1:200，GeneTex，Inc.GTX28666使用的二抗-驴抗山羊-Alexa488，1:500-驴抗小鼠-Cy3，1:1000#715-165-151-驴抗-小鼠-Cy2，1:100#715-225-151-驴抗-兔-Alexa488，1:1000，-驴抗-兔-Alexa594，1:1000，-驴抗-大鼠-Cy3,1:500#712-165-153-驴抗-大鼠-Cy2,1:100#712-225-153免疫染色方案白蛋白、AAT、CK18,HNF3b，Oct-4，CK19，CK7，AFP:在4%PFA中固定15分钟、2xPBS洗涤、在溶于0.1%PBT的5%FBS中30分钟，一抗在溶于0.1。/。PBT的1%FBS中于4"温育过夜，二抗在溶于0.1%PBT的1%FBS中在RT下温育3小时，全都在0.1%PBT中洗涤，室温下在0.05mg/ml的DAPI中5分钟，在DAKOCytomation固定介质中进行固定。LFABP、c-Met、oc6-整联蛋白、ICAM-1，CXCR4:在4%PFA中固定15分钟、2xPBS洗涤、在溶于PBS的5%FBS中30分钟，一抗在溶于PBS的1%FBS中于4t:温育过夜，二抗在溶于PBS的1%FBS中在RT下温育3小时，全都在PBS中洗涤，室温下在0.05mg/ml的DAPI中5分钟，在DAKOCytomation固定介质中进行固定。EpCam:在4%PFA中固定15分钟、2xPBS洗涤、在溶于0.1%PBT的5%FBS中30分钟，FITC直接缀合的一抗在溶于0.1%PBT的1%FBS中于4，MolecularProbes,#A-11055,JacksonImmunoResearch，，JacksonImmunoResearch，MolecularProbes,#A-21206MolecularProbes,#A-21207，JacksonImmunoResearch，，JacksonImmunoResearch，55C温育过夜，在PBS中洗涤，室温下在0.05mg/ml的DAPI中5分钟，在DAKOCytomation固定介质中进行固定。实施例44在I期代谢酶肝细胞样细胞展示针对下述Cyp的免疫反应性1A2、2A6、2B6、2C8/9/19(3个亚型之间潜在的抗体交叉反应)、2D6、2E1、3A4/7(2个亚型之间潜在的抗体交叉反应)。(关于在mEF上分化的肝细胞样细胞，参见图5-11，和关于在MatrigerM上分化的肝细胞样细胞中CyplA2和Cyp2B6的表达，参见图22)。在暴露于Cyp诱导混合物96小时后可见Cyp表达的可诱导型性，所述Cyp诱导混合物包含25juM利福平、20juM脱氧苯巴比妥(朴米酮)、100jiM地塞米松、88mM乙醇、25juM奥美拉唑和100juM异烟肼。(关于在mEF上的肝细胞样细胞中的Cyp1A2和2B6的诱导，参见图24和25)。Cyp也在HepG2中进行免疫组织化学分析，这不产生任何反应(参见图31)。使用的一抗CyplA2(兔)1:100,biomol，CR3130Cyp2A6(兔)1:100，biomol,CR3260Cyp2B6(绵羊)1:100，biomol，CR3295Cyp2C8/9/19(兔)1:100，biomol，CR3280Cyp2D6(绵羊)1:100，biomol,CR3245Cyp2El(兔)1:100，Chemicon，AB1252Cyp3A4/7(绵羊)1:100，biomol,CR3345Cyp2El(兔)1:1000，OxfordBiomedicalResearch,PA26Cyp3A4/7(兔)1:1000，OxfordBiomedicalResearch,PA324吏用的二抗-驴抗-山羊-Alexa488，1:500，MolecularProbes,#A-11055一驴抗小鼠一Cy3，1:1000，JacksonImmunoResearch，#715-165-151-驴抗-小鼠-Cy2，1:100，JacksonImmunoResearch,#715-225-151一驴抗-兔-Alexa488，1:1000，MolecularProbes,#A—21206-驴抗-兔-Alexa594，1:1000，MolecularProbes,#A-21207-驴抗-大鼠-Cy3，1:500，JacksonImmunoResearch,#712-165-153-驴抗-大鼠-Cy2,1:100，JacksonI咖unoResearch，#712-225-153-驴抗-绵羊画Alexa488,1:1000,#A-11015-驴抗-绵羊-Alexa594，1:1000,#A-11016免疫染色方案在4。/。PFA中固定15分钟、2xPBS洗涤、在溶于0.1%PBT的5%FBS中30分钟，一抗在溶于0.1%PBT的1%FBS中于4t:温育过夜，二抗在溶于0.1%PBT的1%FBS中在RT下温育3小时，全都在0.1%PBT中洗涤，室温下在0.05mg/ml的DAPI中5分钟，在DAKOCytomaUon固定介质中进行固定。蛋白质印迹在蛋白质印迹中证实CyplA2和3A4/7的表达(参见图12)。在用Cyp诱导药物处理后，与来自未处理和诱导的细胞的蛋白质条带比较，1A2和3A4和或3A7(潜在交叉反应)的蛋白质量明显增加，显现肝细胞样细胞的可诱导性。使用补充有1:100蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-A1drich)的M-PER蛋白质提取试剂(Pierce)从细胞中提取蛋白质。通过电泳在12%SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白质，然后将其转移至硝酸纤维素膜(Biorad，Hercules,CA)。对于免疫印迹，针对(CyplA2(兔)和Cyp3A4/7(兔)，两者都来自Biomol)的一抗在1。/。BSA封闭緩冲液中进行稀释。二抗是相应的HRP-缀合抗体(分别为山羊抗兔、山羊抗小鼠和兔抗山羊(1:2000;DAKO，Glostrup，Denmark))。根据制造商的说明书(Amersham，Piscataway,NJ)使用增强化学发光(ECL)。HepG2细胞用作阴性对照。原代人肝细胞(InVitroTechnologies,Leipzig,Germany)用作P曰性对照。在另外的操作中使用来自Biomol(兔pAb，CR130)的CyplA2特异性抗体。来自分别针对诱导的和未处理的SA002,LOTAL002和SA167,LOTAL002的该操作的结果指出在2种hBS细胞衍生的肝细胞样细胞群体中的特异性CyplA2反应(尽管很弱)。(参见图27)。Cyp活性测定法(参见图13、30和32):PROD测定法显示出未处理的肝细胞样细胞中的组成性PROD活性和用Cyp诱导混合物处理细胞96小时后PROD活性的强诱导。另外执行EROD测定法，显示特异性组成性的和可诱导的Cyp1A2活性(参见图30)。2种测定法都显示出与原代肝细胞中一样可诱导的活性，并且此外，在hBS细胞衍生的肝细胞样细胞中的任何诱导前，事实上存在基础表达，尽管很弱。混合物包含25jiiM利福平、20jaM脱氧苯巴比妥(朴米酮)、100HM地塞米松、88mM乙醇、25pM奥美拉唑和lOOiiM异烟肼。PROD(Pentoxyresorufin)是一般的Cyp活性测定法并且ER0D(乙氧基试卤灵)对于CyplA2特异。PROD或ER0D母液(分别来自SigmaAldrich目录号77105和46121的2种产品)在DMS0中以2mM的浓度进行制备。对细胞用各种诱导物进行诱导96小时或不予以处理作为对照。在执行该测定法前，将细胞用PBS仔细洗涤2次，并在新鲜的PBS中温育15-30分钟以洗掉残留量的诱导物。将细胞与PBS中的25)iMPR0D或与PBS中的50pMER0D在黑暗中于37X:温育60分钟。然后再次用PBS将细胞洗涤2次并在显微镜下进行分析。在肝细胞样细胞、HepG2和人肝提取物的诱导的和未诱导的培养物中，通过实时PCR技术测量并比较Cyp3A4、3A7、1A1、1A2和Cyp2A6的相对基因表达水平。人肝提取物的测量设为1，并且所有其他样品就每种细胞色素p450与人肝参考相关。关于所有基因的表达针对GAPDH(CYP1A1/1A2、CYP2A6)或TBP(CYP3A4/3A7)进行标准化，参58见图36。实施例5表在II期代谢酶肝细胞样细胞展示针对GSTAl-l的强免疫反应性和针对GSTMl-l较弱的免疫反应性。针对胎儿GSTP1-1未显示或显示出低免疫反应性(关于在mEF上分化的肝细胞样细胞，参见图14)。此外，肝细胞样细胞显示出针对UGT1A1和UGT1A6的免疫反应性(参见图17)。用诱导药物处理后，观察到针对GSTA1-1的轻微诱导，但未观察到针对GSTMl-l或GSTPl-l的明确诱导。(关于在MatrigeT上生长的肝细胞样细胞中的GSTA1-1表达，参见图22)。使用的一抗GSTA1-1(兔)1:500，OxfordBiomedicalResearch,GS62GSTMl-l(兔)1:500，OxfordBiomedicalResearch,GS67GSTPl-l(兔)1:500，OxfordBiomedicalResearch,GS72UGT1A1(兔)1:500，BDBiosciences,458411UGT1A6(兔)1:500,BDBiosciences,458416使用的二抗-驴抗-兔-Alexa488，1:1000，MolecularProbes,#A-21206-驴抗-兔-Alexa594，1:1000，MolecularProbes,#A-21207免疫染色方案在4%PFA中固定15分钟、2xPBS洗涤、在溶于0.1%PBT的5%FBS中30分钟，一抗在溶于0.1%PBT的1%FBS中于41C温育过夜，二抗在溶于0.1%PBT的1%FBS中在RT下温育3小时，全都在0.1%PBT中洗涤，室温下在0.05mg/ml的DAPI中5分钟，在DAKOCytomation固定介质中进行固定。蛋白质印迹蛋白质印迹证实在来自hBS细胞系SA002.5(LOTBE002，5)、SA167(LOTCE167)(参见图15)和SA002(LOTAL002)(数据未显示)的肝细胞样细胞中的GSTAl-l(25kDa)表达。关于更胎儿的GST亚型GSTP1-1(25kDa)，通过蛋白质印迹未检测到表达。来自过表达人GST的V79细胞的细胞裂解物用作阳性对照。B-肌动蛋白(42kDa)用作内部上样对照。在来自品系SA002或SA002.5的未分化的hBS细胞中无法检测到GSTAl-l或GSTPl-l的表达。使用补充有1:100蛋白酶抑制剂混合物(Sigma-A1drich)的M-PER蛋白质提取试剂(Pierce)从细胞中提取蛋白质。通过电泳在12°/oSDS聚丙烯酰胺凝胶上分离蛋白质，然后将其转移至硝酸纤维素膜(Biorad，Hercules,CA)。对于免疫印迹，针对GSTA1-1和GSTPl-l(1:1000)的一抗在1%BSA阻断緩冲液中进行稀释。二抗是相应的HRP-缀合抗体(分别为山羊抗兔、山羊抗小鼠和兔抗山羊(1:2000;DAKO，Glostrup,Denmark))。根据制造商的说明书(Amersham，Piscataway，NJ)使用增强化学发光(ECL)。原代人肝细胞(InVitroTechnologies,Leipzig,Germany)和GST蛋白质制剂用作阳性对照。GST活性测定法(参见图16):使用Habig等人1974的分光光度计测量测定法测定针对l-氯-2，4-二硝基苯(CDNB)的GST催化活性。CDNB(l-氯-2，4-二硝基苯)是一般的GST参考底物(Mannervikl988)。反应混合物由在M-PER裂解緩冲液中的85ju1的0.1M磷酸钾(pH6.5)、2.5|a1的0.2MGSH、2.5|al的20mMCDNB和10n1蛋白质裂解物组成。含lOpl的M-PER裂解緩沖液不含蛋白质的完全测定法混合物用作对照。^使用PhilipsPU8720UV/VIS扫描式分光光度计于340nm处和30C监控吸光度1分钟。针对CDNB的GST催化活性在衍生自hBS细胞系SA002(LOTAL002)、SA002.5(LOTBE002.5)和SA167(LOTCE167)的肝细胞样细胞以及人原代肝细胞样培养物和HepG2培养物中进行测定。衍生自hBS的肝细胞样细胞显示出与人原代肝细胞类似的GST活性和比HepG2培养物明显更高的GST活性。参见图16。60实施例6药物转运蛋白免疫组织化学肝细胞样细胞显示出针对转运蛋白MRP2、BSEP和0ATP-2和/或0ATP-8(潜在的抗体交叉反应)的免疫反应性(参见图18、19、20)。OATP-2/8和MRP2看起来在大多数肝细胞样细胞中表达，而BSEP仅在成肝细胞和肝细胞样细胞的小群体中表达。使用的一抗MRP2(兔)1:50,SantaCruz，sc-20766BSEP(山羊)1:50，SantaCruz，sc-172920ATP-2(小鼠)预稀释的，ProgenBiotechnikGmbH，克隆mMDQ使用的二抗-驴抗-山羊-Alexa488，1:500，MolecularProbes,#A-11055-驴抗小鼠-Cy3，1:1000，JacksonI迈munoResearch，#715-165-151-驴抗-小鼠-Cy2，#715-225-151-驴抗-兔-Alexa488，1-驴抗-兔-Alexa594，1-驴抗-大鼠-Cy3，#712-165-153-驴抗-大鼠-Cy2，#712-225-153-驴抗-绵羊-Alexa488，-驴抗-绵羊-Alexa594，免疫染色方案MRP2、0ATP-2:在4%PFA中固定15分钟、2xPBS洗涤、在溶于0.1%PBT的5%FBS1:100，JacksonImmunoResearch，:1000，MolecularProbes,#A-21206:1000，MolecularProbes,#A-212071:500，JacksonImmunoResearch,1:100，JacksonImmunoResearch，1:1000，#A-110151:1000,#A-11016中30分钟，一抗在溶于0.l"/。PBT的1%FBS中于4x:温育过夜，二抗在溶于0.10/。PBT的1%FBS中在RT下温育3小时，全都在0.1%PBT中洗涤，室温下在0.05mg/ml的DAPI中5分钟，在DAKOCytomation固定介质中进行固定。BSEP:在4%PFA中固定15分钟、2xPBS洗涤、在溶于PBS的5%FBS中30分钟，一抗在溶于PBS的1%FBS中于4X:温育过夜，二抗在溶于PBS的1%FBS中在RT下温育3小时，全都在PBS中洗涤，室温下在0.05mg/ml的DAPI中5分钟，在DAKOCytomation固定介质中进行固定。MRP2基因表达的分析(参见图23)与未分化的细胞比较，在肝细胞样细胞中的MRP2表达分别高11-32使用来自Gibco的TrizolReagent从肝细胞样细胞(SA002.5，LOTBE002.5第2代，在mEF上分化21天后)和未分化的hBS^胞(SA002.5，LOTBE002.5第24代，第5天(对照样品1)和SA002,LOTBE002,第62代，第4天(对照样品2))中提取总RNA。使用Supercriptll试剂盒(InvitrogenLtd)在用脱氧核糖核酸酶I(InvitrogenLtd，Paisley,UK)处理后将5jag总RNA逆转录成互补DNA(cDNA)。^使用Primer3软件程序和Netprimer设计用于转运蛋白的基因特异性引物和探针。使用用于相关基因的引物与SensiMixSybrGreenMix(1.5mM最终MgCl2);(CelticDiagnostics)，0.7单位AmpliTaqGoldDNA聚合酶)，300nM基因特异性正向和反向引物，通过聚合酶链反应(PCR)扩增200ngcDM。使用的引物序歹'J是正向tgcagcctccataaccatga和反向iggacttcagatgcctgcca。在CorbettRotorgene上进行PCR，其中起始步骤于501C2分钟，于95匸10分钟以及随后于951C15秒和于62X:60秒的40个循环。每种样品的PCR扩增一式两份地进行以使吸量误差降到最低。对于每次运行包括无模板对照作为阴性对照。使用标准ABI方案记录关于每种样品的Ct值，并使用2"4°—")计算关于每种样品的相对基因表达。通过将最低的样品设为零来估计在90%效率的假设下的相对表达。实施例7遞过AS染悉在勿^^W潜/^^积趁浙(^er/od/cJc/d-^cA/TT染^系鍵，5TY7船一Ji:/W/(^，军^子"J一》乂通过PAS染色法检测肝细胞样细胞贮积糖原(参见图21)。作为技术阴性对照，唾液处理的培养物证实95-99%培养物中糖原检测的减少。无论何时存在葡萄糖剩余时，糖原合成和贮积是人体的许多细胞类型的共同功能。然而，肝细胞和骨骼肌在贮积糖原方面特别特化。在分化的hBS细胞培养中，在选择或切割肝细胞样细胞前，观察到可要的是，在不贮积糖原的培养物中存在非肝细胞样细胞。细胞在室温下在甲醇中稀释的4%低聚甲醛中固定15分钟，然后在PBS中洗涤3次。作为技术阴性对照，培养物在室温下用人唾液处理20分钟，然后在PBS中进行洗涤。人唾液包含消化糖原的ot-淀粉酶。在室温下将使乙二醇氧化成醛的高碘酸加入处理的和未处理的培养物中5分钟，随后在PBS中反复洗涤。然后，培养物在Schiffs试剂中在室温下温育15分钟，使得碱性副品红和偏亚硫酸氢钠之间反应，这产生使含乙二醇的细胞区室染成亮粉色的碱性副品红产物。在PBS中洗涤后，将细胞在苏木精中在室温下复染90秒，并且在固定介质中固定前在H20中进行漂洗。苏木精染色细胞的核(淡蓝色)。实施例8遽传为、浙分析目的特定基因，例如下文公开的那些的另一种方法是通过使用定量PCR(QPCR)。这样做的一种此类操作如下首先选择合适的基因，设计与那些基因互补的匹配引物，通过PCR分析进行定量，并且使目的基因的表达水平与看家基因(如果已知在分化期间稳定表达)或在分化期间下调的基因进行比较。在几种hBS细胞系中在分化期间下调的合适基因的例子是Cripto、Nanog和0ct-4。hBS细胞衍生的肝细胞样细胞可以进一步在遗传水平(mRNA表达水平)上进行表征，通过常规技术，例如具有合适选择的基因例如下表中列出的那些(表1)的微阵列、微流体卡或基因芯片。衍生自样品的总RNA的cDNA可以与例如微流体卡杂交，并且实验在PCR设置中运行，并使用合适的软件进行进一步分析。表2CYPsUGTs转运蛋白转录因子其他1A11A1OATP-AAh白^白1A21A3OATP-BPXR葡萄糖-6-磷酸酶1B11A4OATP-CCAR2A61A6NTCPRXR2B61A70CT1HNF-1oc2C81A8HPGTHNF-4cc2C91A9MDR32C191A10MDR12D62B7BSEP2E1MRP23A43A53A74A114B1根据指导手册(AppliedBiosystems7900HTMicroFluidicCardGettingStartedGuide)和下述缩短方案，细胞系SA167,L0TCA167和SA002,LOTAL002的未分化的hBS细胞以及衍生自2种细胞系用诱导物混合物处理和未处理的肝细胞样细胞在重复实验中在LDA芯片上平行运行由总RNA制备cDNA且在无RNA酶/DNA酶水中将它稀释，以接受合适的浓度(参见下文)。将下述组分混合c薩(1-100ng)，5|a1无RNA酶/DNA酶水TaqManUniversalPCR,45ja164Master混合物(2X)，50ju1总计IOO|il此后将样品装栽到LDA卡上(每种样品混合物是100ul和170ngcDNA/样品)并且进行离心，然后密封LDA卡。最后，根据手册中的说明书使卡在ABI7900HT实时PCR系统上运行，并且通过使用SDS2.2.1软件和相对定量方法分析结果。在hBS细胞衍生的肝细胞样细胞中迄今为止检测的(通过LDA分析或QPCR)肝蛋白质的概括呈现于下表3和4中。表3CYPsUGT转运蛋白l'l1A1，3，4，5,6，7，8，9，10OATP-Al'21A30ATP-C1B11A6NTCP2a61A80CT12B62B72C8MDR12C9BSEP2C19MRP22D62E13A43A53A7表4转录因子其他PXR白蛋白CAR葡萄糖-6-磷酸酶FXRRXRa载脂蛋白ERXRp醇脱氢酶1ARXRyHNF-1aHNF-3a,-3PHNF-4a,6DBPC/EBPAC/EBPB65实施例9^f勿應举勿應邦^*及hBS细胞及其衍生的细胞类型，例如成肝细胞样细胞或肝细胞样细胞可以在3-D空间中进行培养，所述3-D空间可以通过例如人工空心纤维毛细管膜进行划分。这种系统将使得细胞能够在毛细管之间生长成更大的细胞群，并通过灌注培养基和气体(如氧)提供优化的、天然环境。可以开发闭合的生物反应器系统以生产更大量的细胞(多至10"1细胞)，并且支持细胞的功能性质的维持。经由酶灌注的细胞分离随后将允许在闭合GMP系统中按比例增加。随后可以使用例如基于例如膜抗原表达的FAC分选或使用密度梯度介质和离心进行细胞纯化。实施例10尿素合成是肝特异性特征，因此来自分化成肝细胞样细胞的不同细胞系的培养基的尿素水平在诱导24小时后的不同时间点上进行测量。收集培养基样品并送出用于分析。在KliniskKemi，C-lab，SahlgrenskaUniversityHospital,Gothenburg使用用于尿素/尿素氮的动态UV测定法的试剂盒(Roche/Hitachi)分析尿素分泌。在血清/血浆中的预期值是10-50mg/dL(1.7-8.3mmol/L)。根据该方法关于尿素检测的更低水平是0.8mmol/L。<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>hBSC衍生的肝细胞样细胞以类似于原代肝细胞的水平生产尿素且将其分泌到培养基内。有趣的是，仅在肝细胞样细胞出现在培养物内时，即约20天和其后，能检测到足够的、显著的尿素水平。进一步的功能测试关于例如白蛋白分泌并可以如Schwarz等人，2002和2005中所述进行。肝细胞样细胞和成肝细胞样细胞再进一步的功能表征可以就其执行LDL摄取和糖原异生的能力进行分析。实施例11勿應农^##教^夹心培养系统可以随着肝细胞样细胞的时间过去进一步改善细胞极性和功能性。在此类培养系统中，肝细胞样细胞的包埋提供了除更低水平的氧化性应激以外的模拟体内肝脏的3D环境，由此肝细胞样细胞可以显示极性，即形成具有顶侧(疏水性，朝向体内胆汁侧)和底外侧(亲水性，朝向体内血液侧)的上皮样结构。在夹心培养中对于肝细胞样细胞的另一个潜在改善是甚至更强的Cyp表达可诱导性。其滋部">^€^逸织必夢#^t在.'将在IVF皿中生长的培养的hBS细胞用4%低聚甲醛在室温下固定15分钟。细胞随后与一抗(Notch2，1:200，Santacruz，sc5545，USA)于4t:温育过夜。第二天将细胞用1XPBS洗涤2次10分钟，然后与二抗(抗兔-FITC，l:500)—起在IXPBS中在室温下温育1小时，洗涤2次各5分钟并暴露于1jug/mlDAPI溶液5分钟。细胞用水洗涤2次各5分钟后，将它们固定在Aquamount中并通过荧光显微镜进行分析。近来已显示未分化的hBS细胞表达Notch2(Noggle等人，2006)。在CellartishBS细胞系SA002中，极其大量的细胞在分化的第一天中是弱Notch2阳性的。2周后，Notch2仅在肝细胞样和/或成肝细胞样细胞的少数子集中发现，即类似肝形态的双核细胞(参见图35)。67实施例13根据实施例2中的内在因子方案通过使hBS细胞分别培养14和21天来测试成肝细胞样细胞和肝细胞样细胞的增殖状态。分析当天使培养物在4%PFA中在室温下固定15-20分钟，在PBS中洗涤几次并在PBS中稀释的0.1-0.5%TritonX100中进行渗透化处理。对于成肝细胞样细胞，使用内胚层/早期肝脏标记物HNF4oc(兔pAb，SantaCruz，SC-8987,1:400稀释)，和对于肝细胞样细胞，使用内胚层/肝脏标记物HNF3P(Foxa-2)(IgG，SantaCruz,SC-6554,1.200稀释)。为了研究2种肝细胞样细胞群体的增殖，加入抗体Ki67(BDPharmingen,#556003，1:500稀释)在冰箱中过夜温育。几次洗涤后，施加二抗并在室温下温育2小时。洗涤培养物并在最后一次洗涤中包括DAPI以便检测核。通过与Ki67共定位显示的，对于HNF4ot阳性的成肝细胞样细胞是增殖的(参见图28)。肝细胞样细胞对于Ki67不是阳性的，显示是非增殖细胞。此外，测试hBS细胞衍生的肝细胞样细胞的增殖诱导，以察看通否可以诱导在肝细胞样细胞中的增殖能力。允许hBS细胞(细胞系SA002)在先前描述的条件下分化17天成为成肝细胞和肝细胞样细胞。将培养基替换成补充有10%FBS(或血清替代物)、1%PEST、1%Glutamax、lxITS、0.25ng/ml地塞米松、2%DMS0、20ng/mlHGF、10ng/mlEGF、10ng/ml制瘤素M、10mM烟酰胺和4ng/mlbFGF的Williams培养基E(Sigma、W-4128)。hBS细胞另外培养5-15天，其中约每5天替换培养基。其后如上所述在另外11天后分析细胞的增殖能力，当在如上所述补充的WilliamsE培养基中培养时，衍生自hBS细胞的肝细胞样细胞增殖，而在补充有4ng/mlbFGF的VitroHES中生长的肝细胞样细胞中未检测到增殖(参见图29)。因此，如果在因此合适的培养基中培养时，可以刺激肝细胞样细胞为增加的增殖能力。实施例144%孔乎我*力^勿應^，叙應脊勿應W为V么将4-5天大的hBS细胞手工切成小片并转移至丝裂霉素C处理的mEF包被的96孔。每个孔中加入2-3片hBS细胞。培养物在补充有4ng/mlbFGF的VitroHESTM中在37^、50线和95%湿度下温育20-30天。在第10天时用补充有4ng/mlbFGF的新鲜VitroHESTM替换50%的培养基和在第20天时替换100%。hBS细胞集落以与在MEF包被的IVF皿中培养的hBS细胞集落类似的方式分化，因此约第14天在集落的周围出现用HNF4oc免疫反应阳性的、成肝细胞样细胞，和在第20天时出现肝细胞样细胞。通过使用这种方案，80%的96孔在第20天时在hBS细胞分化成肝细胞样细胞方面是成功的。实施例15肝细胞样细胞再种植到不同表面上在肝细胞样细胞再种植前，用不同包被预包被96孔平板的孔来自大鼠尾部的胶原I(BDBiosciences,#354236)、10%-100%不同浓度的Matrigel(基膜基质，BDBiosciences,#356237)、或丝裂霉素C处理的inEF细胞层。如下进行包被将胶原I加入96孔中并在37X:、5%(:02和95%湿度下温育30分钟-1小时。从每个孔中弃去多余的胶原I，并且随后将孔用PBS洗涤2次以去除任何痕量酸性酸。使孔充满50-100u1补充有20%FCS的预热的HCM培养基(补充有来自Cambrex的cc-4316BB、cc-4362BB、cc-4335BB、cc-4313BB、cc-4321BB、cc-4317BB、cc-4381BB的HCMSingleQouts的HBM,cc-3199)。对于matrigel包被，使matrigel的冷冻等分试样在冰箱中过夜解冻。将matrigel在HCM培养基中稀释以达到10%-100%的matrigel。将不同浓度的matrigel加入96孔并于37C温育30分钟。在加入补充有20%FCS的HCM培养基前弃去多余的matrigel。通过使用来自BD的微型解剖刀显微切割25-38天大的培养物的肝细胞样细胞区域，并用干细胞刀将其转移至包含VitroHESTM培养基的收集皿。包含显微切割的肝细胞样细胞的区域形成小簇并且将其从几个平板进行集中。在再种植到包含补充有20%FCS的HCM培养基的96孔平板不同包被上之前，簇用无钙和镁PBS于37C处理10分钟、在加热平板上TrypLeSelect(Gibco，#12563)42"C处理3-5分钟，或用胶原酶IV于37X:处理5-15分钟。一天后，具有肝细胞样细胞的簇已与表面附着并开始从簇迁移至表面。对于所有不同种类的包被和肝细胞样细胞的分离处理均是如此。将补充有20%FCS的HCM培养基替换成无血清HCM培养基。每隔一天给培养物提供新鲜HCM培养基。几天后，肝细胞样细胞已经再种植孔。肝细胞样细胞在培养中维持45天仍具有肝一般形态大多角形和多核细胞(参见图46)，并对于肝细胞标记物HNF30和CK18是阳性的(图46)。实施例16/七.浙勿應#輔在不存在诱导物的情况下就其分别经由I期细胞色素p4S0酶一一cyplA2、cyp2C9和cyp3A4代谢非那西丁、双氯芬酸和咪达唑仑的能力测试通过不同分化方案获得的hBS细胞衍生的肝细胞样细胞。通过LC-MS测量分别的物质释放到培养基内的代谢产物。包含来自细胞系SA002、SA002.5和SA348的肝细胞样细胞的混合培养物在26-35天大时进行测试。物质作为混合物在无酚红培养基；26jiM非那西丁、9jaM双氯芬酸和3jnM咪达唑仑中在37X:和5%0)2下温育6小时、12小时和24小时。收集来自每种培养物和时间点的样品，并以高速离心20分钟以去除任何细胞碎片。将100m1澄清的培养基样品转移至96孔平板，并向每个孔中加入15|al乙腈。使样品冷冻直至通过LC-MS进行并分析代谢产物测量。液相层析系统由与HTSPAL注射器(CTCAnalytics,Zwingen,Switzerland)组合的HP1100系列LC泵和柱加热炉(AgilentTechnologiesDeutschland,Waldbronn,Germany)組成。对于4-羟基双氯芬酸和1-羟基咪达唑仑，在反相HyPurityC18(2.lx50mm，5um，ThermoQuest，Runcorn，UK)上于401C用HyPurityC18预柱来进行LC分离。移动相由(A)0.1%(v/v)甲酸和(B)溶于乙腈的0.1%(v/v)甲酸组成。有机改性剂含量经过3分钟从5。/iB线性增加到80。/。B，然后回到5。/。B0.2分钟。对于朴热息痛，在ZorbaxEclipseXDB-C8(4.6x150mm，5jum)上用HyPurityC18预柱来进行层析，使用相同的系统和流动相。有机改性剂含量经过5分钟从2%B线性增加到30%B，然后经过2分钟从30%B线性增加到80%B，然后经过0.1分钟回到2%B。关于4-羟基双氯芬酸、1-羟基咪达唑仑和朴热息痛的保留时间分别为2.9、2.4和6.4分钟。用配备电喷雾接口(AppliedBiosystems/MDSSciex，Concord,Canada)的三元四级质镨仪API4000进行检测。MS对于4-羟基双氯芬酸在涡轮加热器温度为450C下进行操作，而对于1-羟基咪达唑仑和朴热息痛于550X:进行操作，喷雾器气体分别为(GS1)50、30、70和50。涡轮气体(curtaingas)分别为(GS2)50、60、70和70，，并且帘气体分别为20、20、10和20。电喷射电压对于4-羟基双氯芬酸为负模式中的-3kV，而对于1-羟基咪达唑仑和朴热息痛分别为正模式中的5和3.5kV。碰撞能量分别设为-15、39和21V，并且碰撞激活解离气体分别为5、7和5。所选择的MRM跃迁对于4-羟基双氣芬酸为309.9>265.9，对于1-羟基咪达唑仑为342.0>202.7，和对于朴热息痛为152.3>110.0。使用200ms的采样时间。使用AppliedBiosystems/MDSSciexAnalyst1.4软件进行仪器控制、数据采集和数据评估。来自不同年龄和在不存在诱导物的情况下不同的hBS细胞衍生的肝细胞样细胞的Cyp活性。<table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table>实施例17W承'胜付逸成当分析药物代谢以便预测体内的药物代谢时，肝细胞内的cyp活性的组成是基本的。为了分析hBSC衍生的肝细胞样细胞的cyp活性组成如何良好地反映人肝细胞的Cyp活性組成，将药物非那西丁(26mM)、双氯芬酸(9|uM)和咪达唑仑(3HiM)的混合物(分别通过cyplA2、cyp2C9和cyp3A4代谢)加入衍生自细胞系SA348的肝细胞样细胞和人原代肝细胞中。药物混合物12小时温育后，收集样品用于代谢产物的LC-MS检测。如先前在实施例16中所示制备样品并通过LC-MS进行分析。分析测试的3种酶系统之间的cyp活性组成。CyplA2、Cyp3A4和Cyp2C9之间的Cyp活性组成<table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table>肝细胞样细胞的cyp活性组成类似于人原代肝细胞培养中的cyp活性组成。实施例18，勿應摔勿應W炎善为了改善hBSC衍生的肝细胞样细胞，使用基于实时PCR技术的筛选方法。4种基因HNF4cx、Cyp3a4、白蛋白和UGT2B7的相对表达水平指示肝细胞样细胞的改善。Cyp3a4是成人肝脏中重要的细胞色素p450酶。它构成成人肝脏中60%的I期酶活性。白蛋白在成熟的和成人肝细胞中高度表达。UTG2B7是成人肝脏的重要的II期酶(葡糖醛酸基转移酶)。升高水平的Cyp3a4、白蛋白和UTG2B7指示改善的、成熟的和潜在地更有功能的肝细胞样细胞。HNF4ot是成肝细胞样细胞的早期标记物。HNF4cx基因表达中升高的水平指示增加数目的成肝细胞样细胞。高水平的白蛋白、Cyp3A4和UTG2B7以及减少水平的HNF4ot将指出成熟的和更有功能的HCLC群体。使用InvitrogensTrizol方法提取来自不同方案的细胞样品的总RNA(关于详细描述参见下文)。然后使用oligodT从总RM样品制备cDM。其后使用即用型Taqman引物、来自AppliedBiosystems的标准程序和仪器在实时PCR反应中扩增cDNA。为了分析检测所需的循环数目(CT值)，将PCR产物对于相同样品中的看家基因GAPDH的CT值进行标准化。其后通过使用用于相对定量的比较Ct方法(△厶Ct方法)使标准化的CT值与每次实验中对照样品的标准化CT值进行比较。结果随后表示为相同实验中样品和对照样品之间的倍数变化。精心设计不同的参数和培养方案以便改善肝细胞样细胞。测试不同培养基，使肝细胞样细胞在培养中维持更长时间，分析培养基替换中的频率，测试不同的成熟和诱导因子等。用于使hBS细胞分化成肝细胞样细胞的参考方案(类似于实施例2中描述的那种)第1天将hBS细胞手工切割成片，并转移至包含补充有4ng/mlbFGF的VitroHESTM培养基的mEF包被的IVF皿第10天将50。/。的培养基替换为补充有化g/mlbFGF的VUroHES培养基。第14-15天由HNF4oc染色指示的成肝细胞样细胞呈现在集落的周围。第20天将100%的培养基替换为补充有4ng/mlbFGF的VitroHESTM培养基。肝细胞样细胞出现在集落的周围。该方案的关键元素之一是极少发生的培养基替换。内在因子对于不同过程是关鍵的。改善方案i不同培养基来自Cambrex的HCM培养基表5中的实验1，2;图37-3973II补充有成熟和诱导因子a.地塞米松b.HCM培养基，HGF，丁酸钠III培养基替换频率HCM培养基和VitroHES表6中的实验1，2,3;图40-42表7中的实验1，2;图40-42表8中的实验1;图43-4574表5<table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>表6<table>tableseeoriginaldocumentpage76</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage77</column></row><table>I.来自Cambrex的HCM培养基是补充有单个等分试样的牛血清白蛋白(BSA-FAF;10ml/500mlHBM，cc-4362BB，Cambrex)、抗坏血酸(0.5ml/500mlHBM，cc-4316BB，Cambrex)、表皮生长因子(rh-EGF;0，5ml/500ml■，cc-4317BB，Cambrex)、转铁蛋白(0.5ml/500ml隨;cc-4313BB，Cambrex)、胰岛素(0.5ml/500mlHBM;cc-4321BB,Cambrex)、氢化可的松(0.5ml/500mlHBM;cc-4335BB，Cambrex)和抗生素(GA-1000;0.5ml/500mlHBM;cc-4381BB,Cambrex)的无血清基础培养基。培养基针对原代肝细胞培养物进行优化。其中VitroHESTM在第15或23天后用HCM培养基替换的方案产生改善的肝细胞样细胞。衍生自细胞系SA002和SA348的改善的肝细胞样细胞显示出白蛋白、CYP3A4和UGT2B7的基因表达水平升高(图39)。通过形态判断具有肝细胞的集落的外周在改善的培养物中更宽，并且细胞较不硬化(steatotic)(图38)。关于研究设计，参见图37，关于方案细节，参见表5实验1和2。IIa.衍生自细胞系SA167、SA348、SA002的HCLC根据参考方案进行分化，然而，在方案结束时用高浓度地塞米松补充8天以改善HCLC的外观(图41A+B)。此外，显示出其中HNF4oc、白蛋白、cyp3A4和UGT2B7的基因表达水平升高明显的趋势(图42A)。关于研究设计，参见图40,研究设计C，和关于方案细节，参见表6，实验l、2、3。lib.衍生自细胞系SA167和SA002的肝细胞样细胞根据参考方案进行分化直至第21天。在那个时间点上将培养基替换成补充有HGF和丁酸钠(NaB)的HCM培养基III.测试衍生自hBS细胞的肝细胞样细胞的分化和成熟过程的很少培养基替换的重要性，并就几种不同培养基进行分析，其中有VitroHESTM和HCNfM培养基。遵循参考方案直至第15天。第15天后，培养基一周替换3次或1次。关于研究设计，参见图43，和关于方案细节，参见表8中的实验1。对于测试的所有培养基观察到明显趋势。培养基的很少替换在形态方向改善了肝细胞样细胞(图44A+B)，和对于Cyp3A4、白蛋白、UTG2B7和HNF4a升高了基因表达水平(图45)。泉据指出内在因子对于hBSC衍生的肝细胞样细胞的分化过程是关鍵的。实施例19力5S^成，勿應在勿應为了建立成肝细胞祖先细胞系，分离15天大的hBS细胞衍生的成肝细胞样细胞，并且再种植到不同包被上。在成肝细胞样细胞的再种植之前，用不同包被预包被96孔平板的孔具有17-2Oxl(T细胞/cm2的密度的丝裂霹素C处理的mEF细胞，在HCM培养基中1:3稀释的来自大鼠尾部的胶原I(BDBiosciences,#354236)或Matrigel(基膜基质，BDBiosciences,#356237)。包被操作如先前在实施例15中关于胶原I和matrigel所述。使孔充满50-100n1补充有20%FCS的预热的HCM培养基(补充有来自Cambrex的cc-4316BB、cc-4362BB、cc一4335BB、cc-4313BB、cc-4321BB、cc-4317BB、cc-4381BB的HCMSingleQouts的HBMTM，cc-3199)。通过使用来自BD的微型解剖刀显微切割来自15天大的培养物的成肝细胞样细胞区域，并用干细胞刀转移至包含VitroHESTM培养基的收集皿。包含显微切割的成肝细胞样细胞的区域形成小簇并且从几个平板进行收集。将所述簇肝细胞一般特征，而具有小核的成肝细胞样细胞的簇在mEF细胞层上生长(图47D-F和K，L。此外，在mEF上生长的大多数成肝细胞样细胞簇对于成肝细胞标记物CK19是强阳性的(图47J，K)，而仅有部分在胶原I和matrigel上的成肝细胞样细胞对于CK19是阳性的(图47G，H)。在mEF细胞层上的成肝细胞样细胞以及在胶原I和matrigel包被上的肝细胞样细胞显示HNF4oc阳性核，然而，与在迈EF上生长的成肝细胞样细胞比较，后者具有更大的核和更弱染色的核(图47A,B,D，E)。数据指出mEF细胞层具有使成肝细胞样细胞维持在祖先状态的能力，而在胶原I和matrigel包被上允许成肝细胞样细胞分化成肝细胞样细胞。79实施例20《^秀浙脊适f^通过对培养物应用吲哚花青绿(ICG)分析关于hBSC衍生的肝细胞样细胞中的转运蛋白的功能测试。ICG在蒸馏的无菌水中溶解至5mg/ml的浓度，然后在培养基中稀释至1mg/ml的终浓度。将ICG溶液加入细胞培养皿中并且于37t:温育约60分钟。温育后，细胞用磷酸盐緩沖盐水(PBS)进行漂洗，并且用立体显微镜检查ICG的细胞摄取。肝细胞样细胞能够摄取ICG染料，这暗示细胞内的功能药物转运蛋白的存在(图48)。权利要求1.衍生自hBS细胞的细胞群体，其中所述细胞群体中至少20％的所述细胞显示出至少一个下述特征α-1-抗胰蛋白酶、细胞角蛋白18、HNF-3β、白蛋白或肝-脂肪酸结合蛋白，并且所述细胞群体具有下述6个特征中的至少3个A.药物转运蛋白i)至少1％的所述细胞显示出BSEP的蛋白质和/或基因表达，ii)至少1％的所述细胞显示出MRP2的蛋白质和/或基因表达，iii)至少1％的所述细胞显示出OATP-2和/或OATP-8的蛋白质和/或基因表达，B.药物代谢酶iv)至少20％的所述细胞显示出GSTA1-1的蛋白质和/或基因表达，v)至少20％的所述细胞显示出CYP450s-1A2、-2A6、-2B6、-2C8、-2C9、-2C19-2D6、-2E1、-3A4和-3A7中至少2种的蛋白质和/或基因表达，vi)至少20％的所述细胞未显示出GSTP1-1的蛋白质和/或基因表达。2.根据权利要求1的细胞群体，其中所述细胞群体具有至少一个所述药物转运蛋白特征和至少一个所述药物代谢特征。3.根据权利要求1或2中任一项的细胞群体，其中所述细胞群体具有至少4个，例如至少5个所述特征。4.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中所述细胞群体具有全部6个所述特征。5.根据权利要求1或2的细胞群体，其中所述细胞群体中至少20%的所述细胞显示出至少一个下述特征oc-1-抗胰蛋白酶、细胞角蛋白18、HNF-3P、白蛋白或肝-脂肪酸结合蛋白，并且所述细胞群体具有下述特征A.药物转运蛋白iii)至少1%的所述细胞显示出功能活性的0ATP-2和/或0ATP-8，B.药物代谢酶iv)至少20%的所述细胞显示出GSTA1-1的功能活性，v)至少20%的所述细胞显示出通过分析所述药物代谢产物测量的功能活性的CyplA2、Cyp3A4和/或Cyp2C9。6.根据权利要求1或2的细胞群体，其中所述细胞群体中的至少75%的所述细胞显示出下述特征a-l-抗胰蛋白酶、细胞角蛋白18、HNF-3P、白蛋白或肝-脂肪酸结合蛋白，并且所述细胞群体具有下述特征A.药物转运蛋白iii)至少10%的所述细胞显示出功能活性的0ATP-2和/或0ATP-8，B.药物代谢酶iv)至少30%的所述细胞显示出GSTA1-1的功能活性，v)至少50%的所述细胞显示出通过分析所述药物代谢产物测量的功能活性的CyplA2、Cyp3A4和/或Cyp2C9。7.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中特征i)对于至少5%，例如至少10%、至少15%、至少20%、至少30%、至少40%或至少50%的所述细胞有效。8.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中特征ii)对于至少5%，例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%或至少800/。的所述细胞有效。9.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中特征iii)对于至少5%,例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%或至少80%的所述细胞有效，10.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中特征iv)对于至少30%，例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%或至少80%的所述细胞有效。11.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中特征V)对于至少30%，例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%或至少80%的所述细胞有效。12.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中特征vi)对于至少10%,例如至少20%、至少30%，例如至少40%、至少50%、至少60%、至少70%或至少80%的所述细胞有效。13.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中所述细胞群体中至少约30%，例如至少约40%、至少约50%、至少约60%、至少约70%、至少约80%、至少约90%或至少约95%的所述细胞表达至少一个下述特征ct-1-抗胰蛋白酶、细胞角蛋白18、HNF-3P、白蛋白或肝-脂肪酸结合蛋白。14.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中至少约5%的所述细胞共表达细胞角蛋白18和CYP1A2。15.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中至少约5%的所述细胞共表达细胞角蛋白18和CYPM6。16.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中至少约5%的所述细胞共表达细胞角蛋白18和CYP2B6。17.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中至少约5%的所述细胞共表达细胞角蛋白18和CYP2C8、CYP2C9和/或CYP2C19。18.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中至少约5%的所述细胞共表达细胞角蛋白18和CYP2D6。19.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中至少约5%的所迷细胞共表达细胞角蛋白18和CYP2E1。20.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中至少约5%的所述细胞共表达细胞角蛋白18和CYP3A4和/或CYP3A7。21.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中至少约5%的所述细胞具有至少一个下述附加特征A.受体vii)至少5%的所述细胞显示出c-Met的蛋白质和/或基因表达，B.细胞间粘附分子viii)至少5%的所述细胞显示出ICAM-1的蛋白质和/或基因表达，C.药物代谢酶ix)至少1%的所述细胞显示出UGT的蛋白质和/或基因表达，D:转录因子x)至少90%的所述细胞未显示出0ct-4的蛋白质和/或基因表达。22.根据权利要求21的细胞群体，其中所述细胞群体具有特征vii)、viii)、ix)或x)中的至少2个，例如至少3个。23.根据权利要求21或22的细胞群体，其中所述细胞群体具有特征vii)、viii)、ix)或x)中的全部4个。24.根据权利要求21-23中任一项的细胞群体，其中特征vii)对于至少10%，例如至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%的所述细胞有效。25.根据权利要求21-24中任一项的细胞群体，其中特征viii)对于至少10%，例如至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%的所述细胞有效。26.根据权利要求21-25中任一项的细胞群体，其中特征ix)对于至少5%,例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%的所述细胞有效。27.根据权利要求21-26中任一项的细胞群体，其中特征x)对于至少10%,例如至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少95%的所述细胞有效。28.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中至少一种所述CYP450蛋白质的表达在添加诱导物后是可诱导的。29.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中所述GSTA1-1和/或GSTMl-l蛋白质的表达在添加诱导物后是可诱导的。30.根据权利要求21-29中任一项的细胞群体，其中所述UGT蛋白质的表达在添加诱导物后是可诱导的。31.根据权利要求28-30中任一项的细胞群体，其中所述诱导物选自单独或组合的地塞米松、奥美拉唑。32.根据权利要求28-31中任一项的细胞群体，其中所述诱导物包括利福平、地塞米松、脱氧苯巴比妥、乙醇、奥美拉唑和异烟肼。33.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中所述细胞群体显示出特征v)的至少一种所述CYP450蛋白质的酶促活性。34.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中所述细胞群体显示出GST酶促活性。35.根据权利要求33的细胞群体，其中所述GST酶促活性是所述细胞群体的裂解物中的至少0.4jamol/分钟/mg，例如至少0.03mmol/分钟/mg、至少O.05jimol/分钟/mg、至少1.0jimol/分4中/mg、至少0.07jamol/分钟/mg、至少0.09jnmol/分钟/mg、至少0.11ymol/分钟/mg、至少0.13jimol/分4中/mg或至少0.15jamol/分钟/mg蛋白质。36.根据权利要求21-35中任一项的细胞群体，其中所述细胞群体显示出UGT酶促活性。37.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中所述细胞群体在体外培养至少l个月，仍保持特征。38.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中所述细胞群体在体外培养至少1周，仍保持特征。39.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中所述细胞群体在体外培养至少72小时，仍保持特征。40.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中所述细胞群体进一步表达甲胎蛋白。41.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中所述细胞群体在饲养细胞例如人或小鼠饲养细胞的存在下获得。42.根据前述权利要求中任一项的细胞群体，其中所述细胞群体在不存在饲养细胞的情况下获得。43.根据权利要求42的细胞群体，其中所述细胞群体使用细胞外基质获得，其中所述基质具有限定或未限定组成。44.根据权利要求42或43中任一项的细胞群体，其中所述细胞群体使用塑料细胞培养瓶获得，所述塑料细胞培养瓶在内部上用单独或组合的一种或多种蛋白质进行包被。45.根据权利要求44的细胞群体，其中所述一种或多种蛋白质选自胶原、层粘连蛋白及其组合。46.根据权利要求44或45中任一项的细胞群体，其中所述细胞群体使用3D环境例如多孔滤器获得。47.根据权利要求41-46中任一项的细胞群体，其中所述细胞群体不含异物。48.衍生自hBS细胞的细胞群体，其中所述细胞群体中至少约10。/o的所述细胞表达HNF3p和AFP中的至少一种，且具有增殖能力，并且所述细胞群体具有下述5个特征中的至少2个A.受体i)至少1%的所述细胞显示出ot-6-整联蛋白的蛋白质和/或基因表达，ii)至少1%的所述细胞显示出c-Met的蛋白质和/或基因表达，B.细胞间粘附分子iii)至少1%的所述细胞显示出ICAM-1的蛋白质和/或表达，C.转录因子iv)至少10%的所述细胞显示出HNF-4ot的蛋白质和/或表达。49.根据权利要求48的细胞群体，其中所述细胞群体具有至少2个下述特征A.受体i)至少1%的所述细胞显示出cx-6-整联蛋白的蛋白质和/或基因表达，ii)至少1%的所述细胞显示出c-Met的蛋白质和/或基因表达，B.细胞间粘附分子iii)至少1%的所述细胞显示出ICAM-1的蛋白质和/或表达，C.转录因子iv)至少10%的所述细胞显示出HNF-4ot的蛋白质和/或表达。D.细胞角蛋白v)至少1%的所述细胞显示出CK19的蛋白质和/或表达，vi)至少1%的所述细胞显示出CK7的蛋白质和/或表达，E.上皮细胞粘附分子vii)至少1%的所述细胞显示出EpCAM的蛋白质和/或表达。50.根据权利要求48或49的细胞群体，其中所述细胞群体具有至少3个所述特征。51.根据权利要求48-50中任一项的细胞群体，其中所述细胞群体具有至少4个，例如至少5个、至少6个或全部7个所述特征。52.根据权利要求48-51中任一项的细胞群体，其中所述特征i)对于至少5%，例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%的所述细胞有效。53.根据权利要求48-52中任一项的细胞群体，其中所述特征ii)对于至少5%，例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%的所述细胞有效。54.根据权利要求48-53中任一项的细胞群体，其中所述特征iii)对于至少5。/。，例如至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%的所述细胞有效。55.根据权利要求48-54中任一项的细胞群体，其中所述特征iv)对于至少15%，例如至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%或至少90%的所述细胞有效。56.根据权利要求48-55中任一项的细胞群体，其中所述群体中至少约15%，例如至少约20%、至少约25%、至少约30%、至少约35%、至少约40%、至少约45%、至少约50%、至少约55%、至少约60%、至少约65%、至少约70%、至少约75%、至少约80%、至少约85%、至少约90%或至少约95。/。的所述细胞表达表达HNF3P和AFP中的至少一种，且具有增殖能力。57.根据权利要求48-56中任一项的细胞群体，其中所述群体具有至少一个下述特征F.药物转运蛋白viii)至少1%的所述细胞显示出BSEP的蛋白质和/或基因表达，ix)至少1%的所述细胞显示出MRP2的蛋白质和/或基因表达，58.如权利要求1-57中任一项中限定的细胞群体用于在药物开发过程中使用的用途。59.如权利要求1-57中任一项中限定的细胞群体在体外模型中用于研究药物转运蛋白的用途。60.如权利要求1-57中任一项中限定的细胞群体在体外模型中用于研究药物代谢酶的用途，61.如权利要求1-57中任一项中限定的细胞群体在体外模型中用于研究肝发生，例如早期肝发生的用途。62.如权利要求1-57中任一项中限定的细胞群体在体外模型中用于研究人肝再生性病症的用途。63.如权利要求1-57中任一项中限定的细胞群体用于体外肝毒性测试的用途。64.如权利要求1-57中任一项中限定的细胞群体在药物中的用途。65.如权利要求1-57中任一项中限定的细胞群体在制备用于预防和/或治疗由组织变性引起的病理状态和/或疾病的药物产品中的用途，所述组织变性例如肝脏组织的变性。66.如权利要求1-57中任一项中限定的细胞群体在制备用于治疗肝脏病症的药物产品中的用途。67.如权利要求1-57中任一项中限定的细胞群体在制备用于预防和/或治疗选自下述的肝脏病症的药物产品中的用途自身免疫病症，包括原发性胆汁性肝硬变；代谢性疾病包括血脂异常；2型糖尿病；肥胖；由例如酒精滥用引起的肝脏病症；由病毒引起的疾病，例如乙型肝炎、丙型肝炎和曱型肝炎；由对于例如药学药物的急性毒性反应引起的肝脏坏死；和在患有例如肝细胞癌的患者中的肿瘤摘除。68.如权利要求1-57中任一项中限定的细胞群体在制备用于预防和/或治疗代谢病理状态和/或疾病的药物产品中的用途。69.来自如权利要求48-57中任一项中限定的细胞群体的一种或多种细胞用于获得代谢改善的肝细胞样细胞的用途。70.来自如权利要求48-57中任一项中限定的细胞群体的一种或多种细胞用于研究朝向肝细胞样细胞的成熟的用途。71.用于就肝细胞毒性筛选化合物的方法，其包括使来自如权利要求1-57中任一项中限定的细胞群体的细胞暴露于所述化合物，且测定所述化合物对于所述细胞是否是毒性的。72.用于就其调节肝细胞功能的能力筛选化合物的方法，其包括使来自如权利要求1-57中任一项中限定的细胞群体的细胞暴露于所述化合物，测定所述细胞中起因于与所述化合物接触的任何表型或代谢变化，且使所述变化与调节肝细胞功能的能力相关联。73.方法，其包括下述步骤i)在无血清培养基中的支持基质上，使hBS细胞或衍生自hBS细胞的祖先在体外分化至少5天，ii)约每5天-约每25天替换所述培养基，iii)通过机械分离来分离细胞，iv)通过用酶处理任选地分离步骤iii)中获得的所述细胞，v)基于表面抗原表达任选地分选所述细胞，以便获得如权利要求1-57中任一项中限定的细胞群体。74.根据权利要求73的方法，其中所述衍生自hBS细胞的祖先表达HNF30和AFP中的至少一种，且具有增殖能力。75.根据权利要求73或74中任一项的方法，其中所述无血清培10养基是包含bFGF的VitroHES。76.根据权利要求73-75中任一项的方法，其中所述bFGF的浓度是约4ng/m卜约200ng/ml，例如约4ng/迈l-约150ng/ml、约4ng/ml-约100ng/ml、约4ng/ml-约50ng/ml或约4ng/ml-约10ng/ml。77.根据权利要求75的方法，其中所述bFGF的浓度是至少4ng/ml。78.根据权利要求73-77中任一项的方法，其中步骤i)中的所述体外分化执行至少10天，例如至少20天、至少30天或至少40天。79.根据权利要求73-78中任一项的方法，其中所述支持基质包含饲养细胞，例如人或小鼠伺养细胞。80.根据权利要求73-78中任一项的方法，其中所述支持基质包含具有限定或未限定组成的细胞外基质。81.根据权利要求80中任一项的方法，其中所述支持基质包含包被在用于细胞培养的塑料细胞培养瓶的内部上的包被，所述包被包含单独或组合的一种或多种蛋白质。82.根据权利要求73-81中任一项的方法，其中所述支持基质包含3D环境例如多孔滤器。83.根据权利要求82的方法，其中所述多孔滤器具有直径约4jam的孑W圣。84.根据权利要求82-83中任一项的方法，其中所述多孔滤器已用单独或组合的一种或多种蛋白质进行包被。85.根据权利要求81-84中任一项的方法，其中所述一种或多种蛋白质选自胶原、层粘连蛋白及其组合。86.根据权利要求73-85中任一项的方法，其中约每10天-约20天执行步骤ii)。87.根据权利要求73-86中任一项的方法，其中约每14天-15天执行步骤ii)。88.试剂盒，其包括i)如权利要求1-57中任一项中限定的细胞群体，ii)一种或多种成熟因子和/或成熟培养基，和iii)任选地，使用说明书。89.根据权利要求88的试剂盒，其中所述成熟培养基选自VUroHESTM、补充有bFGF的VitroHESTM、自体同源预适应的VitroHES和肝细胞特异性培养基。90.根据权利要求88或89中任一项的试剂盒，其中所述一种或多种成熟因子选自bFGF、表皮生长因子、肝细胞生长因子和制瘤素M。91.根据权利要求89的试剂盒，其进一步包含用于监控成熟的工具。92.根据权利要求91的试剂盒，其中用于监控成熟的所述工具包括i)针对编码选自下述的表达标记物的基因中的至少3种，例如至少4种或至少5种的PCR引物HNF3P、AFP、白蛋白、BSEP、MRP2、0ATP-2、0ATP-8、GSTA1-1、CYP450-1A2、CYP450-2A6、CYP450-2B6、CYP450-2C8、CYP450-2C9、CYP450-2C19CYP450-2D6、CYP450-2E1、CYP450-3A4、CYP450-3A7、GSTMl-l和UGT，和ii)用户手册。93.根据权利要求90或91中任一项的试剂盒，其中用于监控成熟的所述工具包括i)针对选自下述的表达标记物抗原中的至少3种，例如至少4种或至少5种的抗体HNF3P、AFP、白蛋白、BSEP、MRP2、0ATP-2、0ATP-8、GSTAl-l、CYP450-1A2、CYP450-2A6、CYP450-2B6、CYP450-2C8、CYP450-2C9、CYP450-2C19CYP450-2D6、CYP450-2E1、CYP450-3A4、CYP450-3A7、GSTMl-l和UGT,和ii)用户手册。全文摘要本发明涉及衍生自HBS细胞的新型肝细胞样细胞群体以及此类肝细胞样细胞在例如药物治疗、药物筛选和毒性测试中的潜在用途。此外，本发明涉及可以具有合适的特征的成肝细胞样细胞，从而使得它们可以用于与肝细胞样细胞相同的应用，且进一步可以用于肝发生例如早期肝发生或肝再生病症的体外研究。根据本发明的肝细胞样细胞和成肝细胞样细胞在基因或蛋白质表达水平上表达药物转运蛋白和/或药物代谢特征。文档编号C12N5/071GK101495621SQ200780027869公开日2009年7月29日申请日期2007年6月4日优先权日2006年6月4日发明者B·屈佩尔斯-芒瑟,J·埃德斯巴戈,N·海因斯申请人:塞拉提斯股份公司