衍生自多能干细胞的肝细胞谱系细胞的制作方法

专利名称：衍生自多能干细胞的肝细胞谱系细胞的制作方法
衍生自多能干细胞的肝细胞谱系细胞
本申请是2001.04. 提交的CN 01811938. 7，题为“衍生自多能干细胞的肝细胞谱系细胞”的分案申请。发明领域
本发明一般涉及胚胎细胞和肝细胞的细胞生物学的领域。更具体的，本发明涉及 人多能干细胞在特定培养条件下朝肝细胞谱系的细胞的定向分化。
相关申请的引用
本申请要求美国临时专利申请60/200，095，2000年4月27日提交；和美国实用新 型申请09/718，308，2000年11月20日提交的优先权。为了在美国的执行，在此完整地引 入优选权申请以供参考。
发明背景
肝脏疾病在全世界影响着数以百万计的人。暴发性肝脏衰竭是肝功能迅速和灾难 性停止的临床术语，通常导致在几小时内死亡。肝脏疾病的其它形式，例如慢性肝炎和肝硬 化，涉及肝功能的隐伏和进行性的衰竭，具有生理上健康和长期预后的可怕效果。在美国， 每年估计有300，000肝病例住院和30，000例死亡，而可供移植的捐献肝脏只有4，500个。
健康的肝脏具有显著的自我再生的能力一但是当该能力受损时，后果是可怕的。 现代医学的一个重要挑战是寻找一条补充再生的天然途径，从而恢复病人的肝功能的方 法。
进行了一些早期研究以鉴定小动物模型中的肝脏祖细胞。Ageili等(Histochem， J. 29 :205,1997), Brill 等(Dig. Dis. Sci. 44 :364,1999)和 Reld 等(美国专利 5，576，207)提出了早肝脏祖细胞在胚胎和新生大鼠肝脏中扩增的条件。Michalopouloe等 (Hepatology 29 =90,1999)报道了一种在生物学基质中培养大鼠肝细胞和非实质细胞的 系统。Block等(J. Cell Biol. 132 =1133,1996)发现了在合成培养基中，由生长因子组合 诱导的肝细胞原代培养物的增殖、克隆生长和特定分化的条件。一段时间来已知大鼠肝细 胞是从能分化成成熟肝细胞或胆表皮细胞的前体(有时称为“肝母细胞”或“卵形细胞”) 行生出来的(L. Ε. Rogler, Am. J. Pathol. 160 :591，1997 ；M. Alison, Current Opin. Cell Biol. 10 :710,1998 ；Lazaro 等，Cancer Res. 58 :514,1998 ；Germain 等，Cancer Res. 48 4908，1983)。
遗憾的是，未鉴定出重建治疗用的人肝细胞的现成来源。欧洲专利申请EP 953633A1提出了一种细胞培养方法和用于产生显然来自人肝脏组织的增殖和分化的人肝 脏细胞的培养基。在大多数人手中，在培养物中复制人肝细胞的能力是令人失望的。作为 补救，提出了通过用SV40病毒的大T抗原转染使肝细胞无限增殖(美国专利5，869，243)。
许多近来的发现产生希望干细胞成为各种细胞类型和组织的来源，用于替换那些 在疾病、感染或先天异常的过程中受损的细胞。各种类型的推定的干细胞随着其分裂而分 化，成熟为进行特定组织，例如心脏、肝脏或大脑的独特功能的细胞。
特别重要的进展是从胚胎组织分离出两类人多能干细胞。据信多能细胞能在体内3分化成大多数细胞类型(R. A. Pedersen, Scientif. Am. 280(4) :68，1999)。在小鼠中进行 了胚胎干细胞的早期工作(Robertson 综述:Math. Cell Biol. 75 :173,1997 ；和 Pederson， R印rod. Fertil. Dev. 6 :543,1994)。然而证明猴和人的多能细胞脆弱得多，而且对小鼠胚胎 细胞的相同培养条件没有反应。仅在最近发现能体外获得和培养的原代胚胎细胞。
Thomson 等(美国专利 5，843，780 ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 :7844,1995)首 先成功地从灵长类培养胚胎干细胞。它们然后衍生出来自人胚泡的人胚胎干细胞(hES) 细胞系(Science 282:114,1998)。Gerahart和同事从胎儿性腺组织衍生出人胚胎精细 胞(hEG) (Shamblott 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 :13726,1998 和国际专利申请 WO 98/43679)。hES和hEG细胞都具有长期寻求的人多能干细胞(hPQ特征；它们能在体外持 续增殖而不分化，维持正常的核型，维持能分化产生所有成熟细胞类型的能力。
多能干细胞在培养物或畸胎瘤中的自发分化产生具有不同表型混合的细胞群，代 表不同的细胞谱系的谱。在许多用途中，理想的是分化的细胞具有更均一的性质-在它们 表达表型和能产生子代的类型方面。
因此，需要从灵长类尤其是从人的多能胚胎细胞中产生更均一化的细胞群的技 术。
发明简述
本发明提供了一种有效产生从多能细胞分化肝母细胞谱系细胞的灵长类细胞的 系统。获得的这些细胞的培养物与未分化的细胞和传送到其它组织类型的细胞相比，相对 富含肝细胞的典型特征。
本发明的一个实施例是一种从分化的灵长类多能干细胞(pPQ获得的细胞群，其 形式是该群中显著比例的细胞具有肝细胞谱系的细胞的特征。在说明书后文中列出了所需 的特征。细胞可以显示任何或所有下列α工-抗胰蛋白酶或白蛋白的抗体可检测表达；不 存在α -胎蛋白的抗体可检测表达；以反向PCR扩增可检测的水平表达无唾液酸糖蛋白受 体；糖原储藏的证据；细胞色素Ρ450或葡萄糖-5-磷酸酶活性的证据；和肝细胞的形态特 征。优选的细胞群在该群中较大比例的细胞中具有多种这些肝细胞特征。应理解细胞可在 分化期间和随后的操纵中复制形成子代。这些子代在所有未明确排除的情况下也属于本发 明的范围内。
通过使来自人胚泡的培养物获得的胚胎干细胞(hEQ得到示范性细胞。通过在含 有干细胞分化剂，例如正丁酸或其它文献中描述的分化剂的生长环境中培养PPS细胞产生 分化的细胞。可直接将分化剂加到含或不含饲养细胞的未分化PPS细胞培养物中。另外，使 PPS细胞分化成混合的细胞群(例如通过形成胚状体或通过培养物过度生长)，在混合群中 加入分化剂。出现较少均一的群，其中有相当比例的细胞具有所需的表型。在一些情况下， 培养方法还包括肝细胞成熟因子，例如文献中举例的那些，它们包括二甲基亚砜(DMSO)， FGF、EGF和肝细胞生长因子，以及糖皮质激素样地塞米松。
本发明的另一个实施例是一种分化的细胞，具有肝细胞谱系的细胞的特征，它是 从本发明的分化的细胞群收集的或是从该群收集的细胞的子代。例子是一种分化的细胞， 它是通过提供一种在基本无饲养细胞的生长环境中的人多能干细胞(hPQ产生的；在含有 肝细胞分化剂的培养基中，在产生富含具有肝细胞特征的细胞的细胞群的条件下，培养该 hPS细胞；随后从富集的细胞群中收集分化的细胞。
本发明的另一个实施例是一种处理人多能干细胞(hPS)，以获得能在体外培养物 中维持的分化的细胞的方法，该方法是提供一种hPS细胞的培养物，在含有肝细胞分化剂 的培养基中的基质上，允许分化的细胞富集的条件下培养细胞。用于该方法的有益技术和 试剂在下文中公开。在本发明中还体现的是一种根据本发明的方法产生的分化的细胞，特 别是那些具有肝细胞谱系特征的细胞。本发明的另一个实施例是一种筛选或调节肝细胞毒性的化合物的方法，包括使本 发明的分化的细胞接触，并检测得到的细胞中任何表型或代谢变化。本发明的另一个实施 例是使一种液体解毒，例如血液的方法，包括在允许细胞去除或改变液体中的毒素的条件 下，本发明的分化的细胞与液体接触。在这方面，公开内容中所述的分化的细胞可用作肝脏 支持装置的一部分，或治疗性施用以在体内重建肝细胞功能。本发明的这些和其它实施例根据下面的描述将变得明白。附1是相差光学显微照片(4X、10X、20X)的半色调复制。右侧来自人多能胚胎 肝干细胞(hES)的胚状体在肝细胞分化剂正丁酸盐中培养2天。得到的细胞显示均一的形 态。左侧，在仅含培养基的血清(PBS)中培养的胚状体细胞。细胞的不均一小块显示许多 不同细胞类型的形态。图2是相差光学显微照片(上两栏10X、其它栏20X)的半色调复制。这些是与正 丁酸盐培养6天的分化的细胞。细胞明显具有成熟肝细胞的特征。在视野中的细胞具有双 核并且是多边形的，表达通过免疫染色或反向PCR检测到的成熟肝细胞的标记。图3是半色调复制，显示一些细胞特异性标记(右侧)的免疫组织化学染色的结 果，与同一视野中细胞核的位置(二苯酰亚胺染色，左侧)比较。图3A(40X)显示成年人肝 细胞的结果；图3B(20X)显示用正丁酸盐培养6天的分化的hES细胞结果。两个培养物都 显示高比例的对白蛋白、α 1-抗胰蛋白酶和⑶18 (三个肝细胞谱系特征性标记)染色阳性 的细胞，和α-胎蛋白(较不成熟细胞的标记)阴性。图4是用高碘酸Schiff染色细胞检测糖原存在的半色调复制(10Χ和40Χ)。与约 80%胎肝细胞(中部)和成纤维细胞系基本无(底部)相比，约60%的丁酸盐处理的细胞 (顶部)显示糖原储藏的证据。图5是相差光学显微照片(10Χ，40Χ)的半色调复制，显示在示范性分化和成熟过 程中不同时间的细胞。A列显示在含有5mM正丁酸钠的SR培养基中培养4天后的细胞。培 养物中80%以上的细胞直径大，含有大核和颗粒状胞质。5天后，细胞被转移到特制的肝细 胞培养基(HCM)中。B和C列显示在HCM中培养2天或4天后的状态。多核化多边形细胞 是常见的。用这些条件，衍生自ES的细胞类似新鲜分离的人成年肝细胞(D列)和胎儿肝 细胞(E列)。图6是柱状图，显示细胞色素P450酶IAl和lA2(CYPlAl/2)的活性。用5μΜ甲 基胆蒽(methylchloranthrene，MC)培养诱导酶，然后用乙氧试卤灵(ethoxyresorufin)测 定。在衍生自ES细胞的Hl细胞系和衍生自H9品系的的两个肝细胞谱系中检测CYP1A1/2 活性。活性的水平超过在两个新鲜分离的人成年肝细胞(HH)制备物中观察到的水平。未 分化的Hl和H9细胞和BJ胚胎成纤维细胞中的活性可忽略不计。发明详述
本发明提供了一种从灵长类来源的多能干细胞制备肝细胞谱系的分化细胞的系统。
已发现当多能干细胞在肝细胞分化剂存在下培养时，衍生出一群细胞，它们是具 有显著高比例的具有培养的肝细胞表型特征的细胞。可任选的，该效果可通过再在肝细胞 成熟因子存在下培养细胞而增强。由于多能干细胞可在培养物中增殖一年或更长(超过 300次群体倍增)，本公开中描述的发明提供了几乎无限的肝细胞样细胞来源，适合各种开 发和治疗的目的。
图2显示已通过与表型肝细胞分化剂正丁酸盐一起培养分化的细胞的相差光学 显微照片。细胞显示相同的肝细胞特征，包括多边形，显示白蛋白，α -抗胰蛋白酶(AAT) 和无唾液酸糖蛋白受体的特征性表型标记，而缺少α-胎蛋白。细胞已在含有丁酸盐的培 养基中维持了 1-3周。
鉴于组蛋白去乙酰酶抑制剂类的丁酸盐和曲古抑菌素A已用于分化各式各样的 细胞类型的事实，该发现是惊人的。由因及果，预测丁酸盐将驱动多能干细胞群分化成各种 不同的群体，例如不用饲养细胞或在视黄酸存在下培养胚胎干细胞得到的结果是合理的。 与该预测相反，获得了显著均一的肝细胞谱系的群体。
这代表了在人多能干细胞群体分化中的一个重要的新范例。就我们所了解，还没 有公开报道关于从任何类型的胚胎干细胞获得这种相同的肝细胞品谱系的群体。
Gladhaug等(Cancer Res. 48 :6580,1988)，Engelmann 等(In vitro Cell. Dev. Biol. 23 86,1987)，Staecker等(J. Physiol. 135 :367,1988 ；Arch.Biochem. Biophys. 261 291，1988 ；和 Biochem. Biophys. Res. commun. 147 :78,1987)研究了丁酸盐对原代肝细胞培 养物中的DNA合成和标记表达的作用。Salto等(Int. J. Cancer 48 :291,1991)和Yoon等 (Int. J. Artif. Organs 22 :769，1999)研究了丁酸盐对人肝细胞系的作用。Pack 等(Exp. Cell Res. 204 :198,1993)和 Germain 等(Cancer Res. 46 :368,1988)研究了丁酸盐对大鼠 卵形细胞(肝细胞前体)的作用。Niki等Ofepatology 29 =858,1999 ；和欧洲专利申请EP 9837742 Al)研究了曲古抑菌素A对原代培养物中大鼠肝脏星状细胞的作用。Blouin等 (Exp. CellRes. 21 =22,1995)研究了丁酸盐对胚胎大鼠肝脏上皮细胞(对肝细胞和胆上皮 的双向潜能性)的作用。Coleman等(J. Cell. Physiol. 161 =463,1994)研究了丁酸盐对培 养的大鼠肝脏上皮细胞前体的作用。L.E. Rogler(Am. J.Pathol. 150 =591,1997)报道了用 DMSO或丁酸钠处理小鼠肝母细胞系诱导迅速的肝细胞分化。Watkins等(J. Dairy Res. 66 559，1999)报道了丁酸还能诱导人肝脏肿瘤细胞的凋亡。所有这些研究涉及成熟肝细胞、转 化的肝脏细胞或定型的肝细胞前体细胞。
已显示丁酸盐对各种其它细胞类型在培养物和体内都具有分化和调节作用。 Kosugi 等(Leukemia 13 :1316,1999)禾口 Tamagawa(Biosci. Biotechnol. Biochem. 52 1483,1998)报道组蛋白去乙酰酶抑制剂是急性髓样白血病细胞中分化的强诱导剂。 Davis 等(Biochem J. 346，第 二部分:455,2000)和 Rivero 等(Biochem. Biophys. Res. Commun. 248 :664,1998)讨论了 丁酸盐在成红细胞分化中的作用。Perrine等(Am. J. Pediatr. Hematol. Oncol. 15 :67，1994)和 Perrine 等(N. Engl. J. Med. 328 :81，1993)提 出了丁酸盐衍生物作为在β-珠蛋白障碍中刺激胎珠蛋白产生的药物。Tal等(Hematol. Oncol. 14 =181,1996)分析了嗜曙红粒细胞的丁酸盐分化的作用。
美国专利5，763，255报道了诱导上皮细胞分化的方法，其中在干燥的天然纤维 胶原细胞培养物基质上的未分化的细胞中加入5mM 丁酸。Yamads等(Biosci. Biotech. Biochem. 55 =1261,1992)研究了丁酸盐对三种成纤维细胞和两种上皮细胞系的作用。Jeng 等(J. Periodontal. 70 =1435,1999)研究了丁酸盐和丙酸盐对培养的齿龈成纤维细胞的作 用。Devereux等(Cancer Res. 59 =6087,1999)报道了用曲古抑菌素A处理人成纤维细胞 系诱导细胞表达端粒酶反转录酶。Yabushita等(Oncol. Res. 5 173，1993)研究了丁酸盐、 DMSO 和二丁酰基 cAMP 对卵巢腺癌细胞的作用。Graham 等(J. Cellular Physiol. 136 :63， 1988)报道了丁酸钠诱导乳腺癌细胞系的分化。Kamitani (Arch. Biochem. Biophys. 368 45，1999),Slavoshian 等(Gut 46 507,2000)和 Reynolds 等(Cancer Lett. 11 :53，1998) 研究了丁酸钠和曲古抑菌素A对人肠上皮细胞和结肠癌细胞的增殖和分化的作用。McBain 等(Biochem. Pharmacol. 53 =1367,1997)报道了腺癌细胞系中的凋亡可以通过丁酸盐和其 它组蛋白去乙酰酶抑制剂诱导。Rocchi 等(Anticancer Res. 18 :1099，1998)和 Mateul 等(Brain Res. 843 :112， 1999)报道了丁酸盐类似物在人成神经细胞瘤细胞中对增殖、分化和诱导儿茶酚胺合成的 作用。Gillenwater等(Head Neck 2 :247，2000)研究了丁酸钠对鳞状癌细胞系的作用。 Buommino等(J. mol. Endocrinol.)研究了丁酸盐对精囊上皮细胞的作用。Sun等(Lipids 32 :273，1997)研究了神经胶质瘤细胞的丁酸盐诱导的分化。Wang等(Exp. Cell. Res. 198 27，1992)研究了正丁酸盐对正常人角质形成细胞分化的作用。Porez等(J. Surg. Res. 78 1,1998)报道了丁酸盐上调Kupffer细胞的PGE2生产和调节免疫功能.Schultz等(J. Exp. Zool. (Mol. Dev. Evol.) 286 =276,1999)发现用组蛋白去乙酰酶抑制剂处理2-细胞胚胎 重新调整了一些基因的表达.Chen等(Proc. Natl. Acad. Sci. 94 :5796，1997和PCT申请 W097/47307)报道了用组蛋白去乙酰酶抑制剂重新激活病毒转导的基因。Simon等(Regul. Pept. 70 =143,1997)研究了丁酸盐对诱导胰岛细胞分化的作用，导致胰岛素生产的增加。由于丁酸盐和相关的化合物促进大量的不同细胞类型的分化，人们会预料到处 理衍生自多能胚胎细胞的混合细胞群将导致该群中的每一个细胞沿着已确定的路线分 化_仅得到更成熟的混合细胞群。不能预计到丁酸盐处理将得到相同的细胞群_或这些细 胞将变成何种组织类型。本发明涉及该惊人的发现，即用丁酸盐(或另一种肝细胞分化因子，下文详述)培 养胚胎多能细胞，产生具有显著高比例的肝细胞表型特征的细胞的细胞群。用分化因子培养多能细胞的常见结果是80%以上的细胞在开始的24小时内从培 养物中丢失。培养几天后出现的是主要具有肝细胞谱系特征的细胞群，例如多边形双核表 型，α 1-抗胰蛋白酶和白蛋白，和代谢上重要的酶活性的表达，例如细胞色素Ρ450酶IAl和 1Α2。不受本发明实施的限制，假定丁酸盐和其它分化因子帮助诱导细胞变为肝细胞谱系， 或优选促进肝细胞谱系的细胞存活，或具有这两种作用的组合。下面进一步描述该培养系统如何用于从灵长类来源的多能胚胎干细胞产生肝细 胞谱系细胞。描述了肝细胞分化剂(举例说明但不限于正丁酸盐)和促进肝细胞谱系细胞 在培养物中产生的其它培养系统的特征。由于多能胚胎干细胞可基本上无限生长，该系统提供了肝细胞样细胞在研究、药 物开发和肝脏疾病的治疗中的无限的来源。
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定义
可使用术语“肝细胞谱系”细胞、“肝胚样细胞”和“肝胚胎样细胞”，指本发明的分 化的细胞，它们是用所述方法分化多能细胞获得的。分化的细胞至少具有一种已知肝细胞 前体细胞、肝母细胞和肝细胞的各种有区别的表型特征，如在本公开下文中的那样。通过使 用这些术语，对于细胞表型、细胞标记、细胞功能或增殖能力不暗示特定的限制，除非有明 确的需要。
“肝细胞前体细胞”或“肝细胞干细胞”是一种细胞，它能够在合适的环境条件下增 殖并进一步分化肝母细胞。这些细胞偶尔具有能产生其它类型的子代，例如卵形细胞，胆管 上皮细胞或其它肝细胞前体细胞的能力。
“肝细胞分化剂”和“肝细胞成熟因子”是在本公开内容中使用的两个具有不同意 义的术语，代表可用于制备和维持本发明的分化细胞的化合物的集合。下面的章节中进一 步描述和举例说明了这些试剂。术语不意味着暗示特定的模式或作用的时间，也不涉及这 些限制。“肝细胞增殖因子”是一种促进肝细胞和/或肝细胞前体细胞增殖的生物或合成的 化合物(肽、寡糖等)。
原型“灵长类多能干细胞”(pPS细胞)是在受精后的任何时间衍生自前胚胎组 织的多能细胞，并且具有在正确条件下产生多种不同细胞类型的子代的能力。如本公开的 目的所限定的，根据标准的本领域已接受的试验，例如在合适的宿主中形成畸胎瘤的能力， PPS细胞能产生作为全部三种胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的衍生物的子代。
pPS细胞的非限制性例子是人胚胎干细胞(hES)细胞，如Thomson等，Sciencd82 1145，1998 ；其它灵长类的胚胎干细胞，例如 Thomson 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 7844，1995所述的Rhesus干细胞；和人胚胎生殖细胞(hEG细胞)，Shamblott等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 :13726,1998所述。该术语也描述了其它类型的非恶性多能细胞。 特别是，包括完全多能(能产生全部三种胚层的衍生物的子代)的任何灵长类的细胞，不论 它们是否衍生自胚胎组织、胎儿组织或其它来源。
当显示能将其与胚胎或成年人来源的分化细胞清楚地区别开的形态时，pPS细胞 培养物是“基本未分化的”。PPS细胞通常具有高的核/胞质比，显著的核，和很难辨别的细 胞接头形成紧密的集落，容易被本领域技术人员识别。未分化细胞的集落可以被周围的分 化的细胞包围。另外，在适当的条件下培养时，基本未分化的集落将继续存在，且未分化的 细胞在培养细胞传代后占增殖细胞的很大比例。含有任何比例的具有这些条件的未分化 PPS的细胞群可用于本发明。被描述成基本未分化的细胞培养物通常含至少约20%、40%、 60%、80%未分化的pPS，按照提高的优选的次序。
“饲养细胞(feeder cell) ”或“饲养细胞(feeders) ”是术语，用于描述与第二类 型的细胞共同培养的一种类型的细胞，以提供第二种类型的细胞可维持，且可能增殖的环 境。饲养细胞可任选自与其支持的细胞不同的物种。例如，可用小鼠胚胎成纤维细胞(来 自原代培养物或端粒化品系)或人成纤维细胞样或间充质细胞(例如可分化并选自hES细 胞的)支持的一些PPS细胞。通常(但不一定)，通过辐射或用抗有丝分裂剂，例如丝裂霉 素C处理灭活饲养细胞，以防止其生长超过它们支持的细胞。
如果细胞在新的培养环境中已传代且未加入新鲜的饲养细胞，pPS细胞群被称为 是“基本无”饲养细胞。认识到如果先前用含有饲养细胞的培养物作为PPS来源用于传代，将有一些饲养细胞在传代中存活下来。例如，hES细胞通常在9. 6cm2孔中，在接近汇合的约 375，000个初次辐照过的胚胎成纤维细胞上培养。在下一次传代时，或许150，000个饲养细 胞仍然存活，分裂并与hES—起传代，后者增殖到约1-1.5X106的数量。在1 6分裂后， hES细胞通常继续增殖，但成纤维细胞不生长，仅一小部分在培养约6天结束时存活。该培 养物“基本无”饲养细胞，组合物含有少于约5%饲养细胞，更优选少于1%、0. 2%饲养细胞 的组合物。“生长环境”是一种感兴趣的细胞将体外增殖的环境。环境特征包括细胞培养的培 养基、温度、O2和CO2的分压和如果存在支持结构(例如固体表面上的底物)。“营养培养基”是用于培养细胞的含有促进增殖的营养物的培养基。营养培养基可 含有任何下列合适的组合等渗盐水、缓冲液、氨基酸、抗生素、血清或血清替换物、和外源 加入的因子。“条件培养基”是通过在培养基中培养第一群细胞，然后收集培养基制备的。条件 培养基(和细胞分泌到培养基中的任何东西)然后可以用于支持第二群细胞的生长。用于该公开的术语“抗体”指多克隆和单克隆抗体。术语的范围有意不仅包含完 整的免疫球蛋白分子，还包括免疫球蛋白分子的片段和衍生物(例如单链Fv构建物、二价 抗体和融合构建物)，如本领域已知的技术制备的，并维持所需的抗体结合特异性。“限制性发育谱系细胞”是衍生自胚胎组织的细胞，通常是通过pPS细胞的分化衍 生的细胞。这些细胞能增殖和分化成几种不同的细胞类型，但是其子代的表型范围有限。例 子包括造血细胞，它是血细胞型的多能细胞；神经前体，它可产生神经胶质细胞前体，发 展成少突胶质细胞；神经元限制细胞，它发展成各种类型的神经元；和肝细胞前体，它对于 肝细胞和有时其它类型的肝脏细胞，例如胆管上皮是多能的。一般技术为了进一步详细描述本发明实践中使用的一般技术，实施人可引用细胞生物学、 组织培养和胚胎学中的标准教科书和综述。包括《Teratocarcinoma & EmbryonicStem Cell :A Practical Approach》(E.J.Robertson 编，IRL Press Ltd, 1987)；《Guide to Techniques in Mouse Development)) (P. M. Wasserman 等 ^m, AcademicPress 1993)； ((Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro)) (Μ. V. Wiles,Meth. Enzymol. 225 :900， 1993) ； ((Properties and uses of Embryonic Sten Cells :Prospects for Application to Huamn Biology and Gene Therapy》(P. D. Rathjen 等，1993)。与肝细胞谱系的细胞有 关的一般信息可在《Live Stem Cells》中找到(S. Seil & Ζ. Ilic,R. G. Landes Co.，1997)， Stem Cell Biology(L. Μ. Reid, Curr. Opinion Cell Biol. 2 :121，1990)，和 Liver Stem Cells (J. W. Grisham, pp232-282 T (Stem Cells)，Academic Press，1997)。在药物研究中 使用肝细胞样细胞《In Vitro Methods in Pharmaceutical Research》(Academic Press, 1987)中有所描述。分子遗传学和基因工程中的方法一般在《分子生物学实验室手册》(《Molecular Cloning :A Laboratory Mannual))),第 二片反(Sambrook 1989) ； ((Oligonucleotide Synthesis》(Μ· J. Gait H, 1984)；《Animal Cell Culture》(R. I. Freshney H, 1987)；《the series Methods in Enzymology》(Academic Press, Inc.,)；《Gens Transfer Vectors for Mammalian Cells》(J. M. Miller & Μ· P. Calos 编，1987)；《Current Protocols inMolecular Biology》and《Short protocolsin Molecular Biology》，第三版(F. Μ. Ausubel 等编，1987 & 1995)；禾口《RecombinantDNA Methodology II》(R. Wu 编，Academic Press, 1995)中有所描述。本公开中引用的试剂、克隆载体和基因操纵的试剂盒购自供货商例如 BioRad、Stratagene、Invitrogen、ClonTech 禾口 Sigma Chemical Co.等。
用于产生，纯化和修饰抗体的一般技术，和包括免疫组织化学的免疫测定的设计 禾口执fiS i卖者可参见 Handbook of Experimental Immunology (D. Μ. Weir & C. C. Blackwell 编)；Current Protocols in Immunology(J. E. Coligan 等编，1991)；禾口 Methods of Immunological Analysis (R. Masseyeff, W. H. albert 禾口 N.A.Staines 编，Weinheim :VCH Verlags GmbH,1993)。
培养基和饲养细胞
分离和繁殖pPS细胞的培养基具有几种不同配方，只要获得的细胞具有所需 的特征，可以进一步繁殖。合适的来源如下Dulbecco的改良fegles培养基(DMEM)， Gibco#l 1965-092 ；剔除 Dulbecco 的改良 Eagles 培养基(K0 DMEM)，Gibco#10829-018 ； 200mM L-谷氨酰胺，Gibco#15039-027 ；非必需氨基酸溶液，Gibcolll40-050 ； β -巯基 乙醇，Sigma#M7522 ；人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，Gibco#13256_(^9。示范 性含血清的ES培养基是用60% DMEM(通常是KO DMEM)、20%未热灭活的限定性胎牛血 清(FBS)、1%非必需氨基酸、ImM L-谷氨酰胺和0. ΙπιΜβ -巯基乙醇制备的。无血清的 ES培养基是用60% KO 01^11、20%血清替代物、0.11111非必需氨基酸、11111 L-谷氨酰胺和 0. ImM 巯基乙醇制备的。不是所有的血清替代物都可以用；一种有效的血清替代物是 Gibco#10828-028o对于增殖多能干细胞中无血清培养基的信息出版在国际专利出版物 W097/47734(Pedersen, U. Cal ifornia)和 WO 98/30679 (Price 等，LifVTechnologies)。 过滤培养基，储藏在4°C不超过2周。在使用前，加入最终浓度为^g/ml的人breF(Bodnar 等，Geron Corporation,国际出版物 W099/20741)。
pPS细胞通常在一层以各种方式，例如产生促进pPS存活或增殖，或抑制分化的可 溶性因子支持PPS细胞的饲养细胞上培养。饲养细胞通常是成纤维细胞类型的细胞，通常 衍生自胚胎或胎儿组织。饲养成纤维细胞的常用来源是小鼠胚胎。饲养细胞铺板至接近汇 合，辐射防止增殖，用于支持PPS细胞培养。
在饲养细胞上培养pPS细胞的一个例子中，从远系繁殖的CFl小鼠(获自SASC0) 或其它合适品系获得小鼠胚胎成纤维细胞(mEF)。用70%乙醇擦拭妊娠13天的小鼠腹部， 将蜕膜移到磷酸缓冲盐水(PBQ中。收集胚胎；除去胎盘、膜和软组织；用PBS洗涤尸体两 次。然后将其转移到新鲜的含2ml胰蛋白酶/EDTA的10厘米培养皿中，精细切碎。37°C培 育5分钟后，用含有10% FBS的5ml DMEM灭活胰蛋白酶，将混合物转移到15ml锥形管中， 并分离。使碎片沉淀2分钟，上清液占终体积10ml，铺在10厘米组织培养板或T75烧瓶中。 烧瓶静置培养M小时，然后替换培养基。当烧瓶汇合(约2-3天)，细胞1 2分到新烧瓶 中。
饲养细胞在含有90% DMEM(Gibco#l 1965-092)、10% FBS (Hyclone#30071-03)和 2mM谷氨酰胺的mEF培养基中繁殖。mEF在T150烧瓶(COrning#430825)中繁殖，用胰蛋白 酶每隔1天将细胞一分为二，保持细胞亚汇合，当需要时任选冷冻。为了制备饲养细胞层， 用一定剂量辐照细胞来抑制增殖，但允许合成重要的支持hES细胞的因子(约4000拉德Y-辐射)。通过用37°C培育过夜的Iml 0.5%明胶/孔铺6孔培养板(例如FalCOn#304)， 每孔铺375，000个辐射过的mEF。铺板后5小时-1周使用饲养细胞层。用新鲜hES培养基 在接种PPS细胞前替换培养基。灵长类多能干细胞(pPS)的制备可从灵长类物种成员的成纤维细胞分离胚胎干细胞(Thomson等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844,1995)。可使用 Thomson 等(美国专利 5，843，780 ;Science282 1145，1998 ；Curr. Top. Dev. Biol. 38 :133ff. 1998)描述的技术从人成纤维细胞制备人胚胎 干细胞(hES)。未分化的pPS细胞具有特征性形态特点，具有高的核/质比，显著的核仁，和很难 辨别的细胞接头形成紧密的集落。需要获得具有“正常核型”的细胞，意味着细胞是整倍体， 其中所有人染色体是存在的，没有明显的改变。该特征在任何随后衍生和增殖的分化细胞 中也是理想的。可用免疫组织化学或流式细胞术计数，使用SSEA1、SSEA-3和SSEA-4国立儿 童健康和人类发育研究所发育研究杂交瘤库(Development Studies HybridomaBank, National Institute of Child Health and Human Development,BethesdaMD)禾口TRA-1-60 禾口 TRA-1-81 (Andrews 等，in E. J. Robertson 编，Teratocarcinomasand Embryonic Stem Cells. IRL Press，207-246，1987)的抗体鉴定特征性胚胎抗原。SSEA-I标记通常在hES 细胞中很少或不存在，但存在于hEG细胞中。细胞体外分化通常导致SSEA-3、SSEA-4、 TRA-1-60和TRA-1-81的丧失，及SSEA-I的表达提高。pPS细胞的特征还有碱性磷酸酶活 性的存在，它可以通过用Vector Red作为底物(Vector Laboratories,Burlingame CA)显 色固定的细胞未检测，并用罗丹明滤膜系统检测产物的红色荧光。可通过在8-12周龄的雄性SCID小鼠的后腿肌肉中注射约0. 5-10X108个细胞， 确定胚胎干细胞的多能性。得到的肿瘤可在8-16周发展时固定在4%聚甲醛中，石蜡包埋 后组织学检测。显示所有三个胚层的组织，例如软骨、平滑肌或横纹肌(中胚层)；具有毛 囊的复层鳞状上皮、具有心室、中间物或套层的神经管(外胚层)；和纤毛柱状上皮和通过 吸收性肠细胞排列的绒毛或分泌粘液的杯状细胞(内胚层)的畸胎瘤产生。pPS细胞的增殖胚胎干细胞可在营养培养基的饲养细胞层上培养。常规每1-2周通过简单胰蛋白 酶消化，接触Dulbecco，s PBS (不含钙或镁，含有2mM EDTA)，接触分散酶或IV型胶原酶 (lmg/ml ；Gibco)或用微量移液管选择单集落分开ES细胞。约50-100个细胞的簇大小是 最佳的。另外，在与蛋白酶培育后，刮下培养物，分解离成小簇，并以1 3-1 30的分散 比重新接种到新鲜饲养细胞上。胚胎干细胞在饲养细胞上培养，每天更换生长培养基，直到出现形态与EG细胞一 致的细胞，通常是7-30天，1-4次传代。细胞在几个月的培养中维持其多能性。国际专利申请WO 99/20741描述了在不存在饲养细胞的条件下，在含有营养培养 基的胞外基质上培养多能干细胞的方法和材料。合适的是来自许多来源的裂解的成纤维细 胞或分离的基质成分制备的成纤维细胞基质。营养培养基可含有丙酮酸钠、核苷酸和一种 或多种内源加入的生长因子，例如bFGF，还可以通过与成纤维细胞一起培养调理。在不存在饲养细胞的情况下，适合pPS增殖的基质包括胞外基质成分，例如
11Matrigel (Becton Dickenson)或层粘连蛋白。Matrigel 是在室温胶凝形成重建的基 底膜的Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤细胞的细胞外基质的可溶性制剂。为了避免存在于膜 中的生长因子(例如TGF-1、TGF和PDGF)的影响，可使用减少生长因子的Matrigel 。可通 过制备所有成分的人工混合物，省去依次测定效果的成分来鉴定基质的关键成分。胞外基 质成分的其它混合物也是合适的。例子包括胶原、纤连蛋白、蛋白聚糖、ontactin、硫酸乙酰 肝素等的各种组合。
然后将多能细胞以合适的分布涂布在底物上，在促进细胞生存、繁殖和维持所需 特征的培养基上有在。所有这些特征是由于仔细留意接种分布获得的。分布的一个特征是 铺板密度。发现至少约15，000个细胞cm—2的铺板密度促进生存和限制分化。通常使用约 90，000-170, OOOcnT2之间的铺板密度。
另一种特征是细胞的分散。小鼠干细胞的繁殖涉及细胞分散在单细胞悬液中 (Robinson,Meth. Mol. Biol. 75 :173,1997，177页)。相反，在不存在饲养细胞的情况下pPS 细胞的传代获得了制备小簇的PPS细胞的益处。通常，在细胞变得完全分散前停止酶消化 (即用胶原酶IV约5分钟)。然后用移液管温和地刮平板，用移液管研碎细胞，直到它们作 为粘着细胞的簇悬浮，大小约10-2000个细胞。然后直接将簇铺到底物上，而不进一步分 散。
还发现在无新鲜的饲养细胞的情况下，pPS细胞可以受益于在营养培养基中培养。 培养基通常含有提高细胞存活的常见成分，包括等渗缓冲液，必需矿物质和血清或某种血 清替代品。还有利的是经过调理的培养基，供给一些饲养细胞提供的元素。可通过在无血 清培养基，例如在加了 20%血清替代品和4ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的血清 替代培养基(如KO DMEM)中以5 X IO5细胞/9. 6cm2孔的密度培养辐照过的原代小鼠胚胎 成纤维细胞(或其它合适的细胞制备物)制备条件培养基。在37°C 1天后收集培养物上清 液，通常补充有益于PPS细胞生长的其它生长因子。对于hES，通常使用bFGF等生长因子。 对于hEG，培养基可补充bFGF等生长因子，gpl30的诱导物，例如LIF或(制瘤素-M)和可 能提高cAMP水平的因子，例如各种类型的pPS细胞可受益于培养基中的其它因子。
用这些技术中的几种技术增殖的细胞通常在许多个月的多次传代中维持基本不 分化。认识到在某些传代期间，集落边缘周围的一些细胞可能分化(特别是当作为单细胞 重新铺板时，或当使其形成大簇时)。然而，培养物通常在培养期内重建具有特征性形态的 较大比例的未分化细胞。可任选的，增殖的细胞将具有不超过约20-40小时的倍增时间。
分化pPS细胞的材料和方法
可在肝细胞分化剂存在下培养pPS细胞制备本发明的分化细胞。可任选的，还可 在肝细胞成熟因子存在下(与分化剂培养的同时或依次)培养细胞。得到的细胞具有肝细 胞谱系的表型特征，如下节所述。
在本发明的一些实施例中，通过首先形成胚状体引发pPS的分化。0’ Shea,Anat. Rec. (New Anat. 257 :323,1999)报道了培养胚状体中的一般原理。pPS细胞以允许聚集物 形成的方式培养，其中可获得许多选择例如通过供体PPS细胞培养物的过度生长，或通过 在具有低粘附性质的基质，例如甲基纤维素的培养容器中培养PPS细胞。胚状体易被本领 域技术人员识别，并易收集并转移到新的培养环境中。胚状体通常具有内胚层外部和中胚 层和外胚层内部。
如下节实施例中所说明的，胚状体还可以在悬浮培养中制备。简单胶原酶消化，解 离成簇，铺在非粘附的细胞培养板上收集PPS细胞。每隔数天喂养聚集物，然后在合适的 时间段，通常是4-8天后收集。然后将聚集物铺在适合肝细胞谱系的细胞的底物上。例子 是较早更充分描述的Matrigel (Becton Dickenson)、层粘连蛋白、各种类型的胶原和明 胶。可使用其它人工基质成分和组合。还可通过首先培养产生基质的细胞系(例如成纤维 细胞，内皮细胞或间充质干细胞)，然后裂解和洗去细胞碎片，使得基质维持与容器表面连 接来生产基质。通常不需要从胚状体上分散细胞；胚状体可直接铺在基质上。然后在含有 肝细胞分化剂的培养基中培养细胞。
在本发明的其它实施例中，pPS细胞与分化剂混合，不形成相当数量的胚状体-即 在标准PPS细胞培养物中，在达到汇合时间或达到汇合时间之前，但不是开始过度生长之 前加入试剂。这在本文中称为直接分化法。通常有利的是(但不是所需的)PPS细胞在无 饲养细胞培养物中。可收集PPS细胞并铺在新的底物上，加入含有分化剂的培养基。另外， 如果PPS细胞已经被维持在适合培养分化的细胞的基质上，那么分化剂可直接加到PPS培 养物中，不用重新铺板。每天观察培养物，以确定是否达到汇合。已发现正当细胞达到汇合 时加入分化剂，肝细胞谱系细胞的产率可以高3倍，而不是在约60-80%汇合时。
通过提供体内肝细胞的环境典型的底物来进一步促进分化肝母细胞谱系。例如， 某些胞外基质成分提供了合适的表面，例如Matrigel (Becton Dickenson)、层粘连蛋白 或从裂解细胞获得的基质。另一种对于这些细胞分化合适的底物是明胶。在含有适合维持 细胞的缓冲液、离子强度和营养物的营养培养基中培养细胞(见W099/20741)。对特定细胞 优化培养基是在熟练技术人员的范围内，并且在本公开中有例证。
细胞在含有合适的底物和肝细胞分化剂的环境中维持足够的时间，使允许从其它 细胞富集分化的细胞-如凭经验确定的那样。例如，用分化剂(如正丁酸盐)培养的第一 天使得约90%培养的胚状体衍生细胞从基质释放入培养基中。在M小时后更换培养基时， 除去这些细胞，在含有正丁酸盐的新鲜培养基中培养存活的细胞。
在充分培养一段时间后，剩余的细胞大量富集了具有肝细胞和/或肝细胞祖细胞 特征的细胞。对于肝细胞分化剂正丁酸盐来说，培养期通常约4-8天，通常约6天。读者注 意到在本发明的一些分化剂存在下延长培养，对最大限度的获得肝细胞谱系细胞可能是次 优的。其它分化剂，例如正丁酸盐在长期培养中会耐受。在这些情况下，将试剂保持在培养 基中有利于维持分化的细胞的表型。不意味着被理论所限，本发明假设肝细胞分化剂，例如 正丁酸盐具有两种作用第一，促进PPS细胞沿肝细胞谱系分化，第二，随着继续培养优先 选择该谱系的细胞存活。
合适的分化剂
正丁酸盐是典型的肝细胞分化剂，在下面的实施例中说明。本领域技术人员将不 难认识到，易鉴定具有相似作用的许多正丁酸盐的同系物，并在本发明的实践中用作替代PΡΠ O
一类同系物包括其它烃类，它们与正丁酸盐具有相似的结构和理化性质。这些同 系物中的一些是酸性烃类，由3-10个碳原子组成，是分枝、直链或环状形式，或是共轭碱， 选自羧酸盐、磺酸盐、磷酸盐和其它质子供体。合适的例子包括但不限于正丁酸、异丁酸、 2-丁烯酸、3-丁烯酸、丙酸、丙烯酸、戊酸、戊烯酸、其它饱和或不饱和的短链脂肪酸、氨基13丁酸、苯基丁酸、苯基丙酸、苯基乙酸、苯氧基乙酸、肉桂酸和二甲丁酸盐。还感兴趣的是与 这些化合物等比容的烃类磺酸酯或磷酸酯，特别是丙烷磺酸和丙烷磷酸，它们与正丁酸盐 等比容。在这些化合物的命名中，应理解包括所有立体异构体，除非特别说明。具有酸基团 的化合物可以酸形式提供，或作为共轭碱，具有任何可接受的对相反荷离子。由于使用正丁 酸钠将提高所用的环境的离子强度，如需要可通过加入盐改变离子强度来增强其它试剂的 作用。另一类同系物是丁酸盐和丁酸盐同系物的衍生物，包括与其它分子，例如氨基 酸、单糖和其它可接受的共轭配对的共轭物。已开发了许多这样的衍生物，作为在体内或 原位通过合适的转化酶(例如蛋白酶或糖苷酶)存在转化成活性形式的丁酸盐前药。为 了说明起见，该类的成员包括精氨酸丁酸盐、赖氨酸丁酸盐、其它丁酸盐酰胺、葡萄糖戊丁 酸盐、三丁精、二丙酮葡萄糖丁酸盐、其它丁酸盐糖类、氨基丁酸、异丁酰胺、特戊氧甲基丁 酸盐、1-(2-羟乙基)4-) 1-氧丁基)-哌嗪丁酸盐、其它丁酸盐的哌嗪衍生物和吡乙酰胺 (2-氧-1-吡咯烷乙酰胺，Notropyl )，γ -氨基丁酸眼的环衍生物。另一类同系物是组蛋白去乙酰酶的抑制剂。非限制性例子包括曲古抑菌素Α、 5_ 氮胞苷、trapoxin A、oxamflatin、FR901228、顺氯氨钼和 MS-27-275。读者还可参见 U. S. 5，922，837中的抗原生动物的环状四肽；U. S. 5，925，659中的抗菌剂；WO 99/23885中 的共阻遏物抑制剂；和WO 99/11659中的环状肽衍生物。用组蛋白去乙酰酶抑制剂鉴定化 合物的方法可通过去阻遏激素受体化合物(W0 98/48825)鉴定。正丁酸盐的肝细胞分化作用可能至少部分是取决于抑制组蛋白去乙酰酶的能力。 组蛋白去乙酰酶活性的检测可用作预先筛选，来选择其它分化剂的候选物。有许多这样 的检测方法。例如，仏5.5，922，637(第3栏以下)描述了用含氚的N-去甲氧基阿匹西定 (apicidin)和寄生虫或鸡肝SlOO溶液作为去乙酰酶活性的来源的试验。将候选化合物加 到反应混合物中，用滤膜法测定氚释放。Nare等(Anal. Biochem. 267 =390,1999)开发了一 种闪烁邻近试验，使用来自组蛋白H4的肽，用氚乙酰化赖氨酸ε _氨基，它与SPA珠结合， 后者的闪烁与邻近的氚量成正比。组蛋白去乙酰酶活性(从HeLa细胞核的抽提物获得)释 放标记的乙酰基，并减少闪烁，而去乙酰酶抑制剂的存在维持闪烁。Hoffman等(Nucl. Acids Res. 27:2057,1999)描述了组蛋白去乙酰酶活性的非同位素测定。开发了荧光底物，它们 是Ω-乙酰化的赖氨酸的氨基香豆素衍生物。这使得底物的定量在纳摩尔浓度范围内，能 够进行组蛋白去乙酰酶抑制剂的高通量筛选。对合适的分化剂的最可靠测试是其将pPS细胞培养物转化成富含肝细胞谱系的 细胞培养物的能力，如本公开所述。在PPS细胞或胚状体的培养物中，以类似于已知对正丁 酸盐有效的方式，加入可任选的根据上述条件的一个或多个预筛选的候选化合物。任何可 至少促进PPS细胞沿肝细胞谱系途径分化，或优选允许成肝细胞型细胞生长，或优选除去 其它谱系的细胞的化合物将有利于衍生本发明的一些分化的细胞群。根据这些指导，作为肝细胞分化剂的特定化合物或化合物的组合包括在化合物存 在下培养一群基本未分化的PPS细胞，或一群混合的分化的PPS细胞(例如那些从胚状体 或PPS培养物过度生长获得的)，然后确定对细胞形态、标记表达、酶活性、增殖能力或其它 与肝细胞谱系的细胞有关的感兴趣的特征的作用。为了最佳结果，评估了几种浓度的测试化合物。合适的基础浓度可以是等渗容摩或与有效丁酸盐浓度等渗的或具有另一种组蛋白 去乙酰酶相等的抑制能力。然后可测试的试验化合物超过约1/1(^到10倍基础浓度的范 围，或更大，从确定它是否具有所需的肝细胞分化能力。
如果能从pPS细胞培养物或胚状体细胞产生一群细胞，其中至少40%细胞具有肝 母细胞或肝细胞的至少三个特征，将该化合物视为有效的分化剂。产生具有大量的肝细胞 特征的更均一的群的试剂在一些情况下是有利的。认识到产生较复杂或不太均一或不太成 熟的肝细胞群的试剂也可能是有利的，如果细胞维持另一种理想的特征(例如难于操作， 或增殖能力)。如下文所述，这些细胞群可以通过分拣或吸附技术进一步富集所需的细胞类 型。
成熟因子的选用
如需要可使用一种起肝细胞成熟因子作用的分离化合物或化合物的混合物，补充 用肝细胞分化剂富集分化的细胞。这些试剂可增强分化剂促进的表型改变，或可以推动分 化途径进一步朝更成熟细胞发展，或可以帮助筛选肝细胞谱系的细胞(例如，通过优先支 持其生存)，或可以促进更迅速增殖具有所需表型的细胞。
一类肝细胞成熟因子是可溶性生长因子(肽激素、细胞因子、配体-受体复合物 等)，它们能促进肝细胞谱系的细胞的生长。这些因子包括但不限于表皮生长因子(EGF)、 胰岛素、TGF-α、TGF-β、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝素、肝细胞生长因子(HGF)、在地塞 米松存在下的制瘤素M、IL-U IL-6、IGF-I, IGF-II, HBGF-I和胰高血糖素。
另一类肝细胞成熟因子是皮质类固醇，特别是糖皮质素。这些化合物是类固醇或 类固醇模拟物，并影响中间代谢，特别是促进肝脏糖原储藏，和抑制炎症。包括天然存在的 激素，例如可地松，和合成的糖皮质醇，例如地塞米松(美国专利号3，007，92 及其衍生 物，强的松、甲基强的松、氢化可地松和去炎松(美国专利号2，789，118)及其衍生物。
另一类肝细胞成熟因子是有机溶剂，例如DMS0。具有类似性质的取代物包括但不 限于二甲基乙酰胺(DMA)、六亚甲基二乙酰胺和其它多亚甲基二乙酰胺。该类中的溶剂在增 强细胞膜通透性的性质上是部分相关的。还感兴趣的是烟酰胺等溶质。测试候选化合物是 否起到本发明的肝细胞成熟因子的作用是凭经验进行的用上述肝细胞分化剂，联合模式 肝细胞分化剂，例如生长因子或DMSO(阳性对照)将pPS培养物分化肝母细胞谱系的细胞。 平行对PPS进行类似方案，使用相同的分化剂和候选成熟因子。然后比较得到的细胞的表 型，测定候选试剂是否具有阳性对照的类似效果。
在本发明的具体实施例中，同时或依次使用肝细胞分化剂和肝细胞成熟因子。在 一个例子中，将新鲜铺板的胚状体或无饲养细胞的pPS培养物铺在含有正丁酸盐和DMSO的 培养基中，培养4、6或8天，或直到培养基出现特征性特征，每隔一段时间(即每M小时) 用含有正丁酸盐和DMSO的新鲜培养基替换培养基。在另一个例子中，EB或pPS培养物首 先和正丁酸盐和DMSO培养4、6或8天，然后用含有生长因子的混合物的对肝细胞有利的培 养基(可能与正丁酸盐联合)交换培养基，长期培养或测定。
根据这些指导，起到肝细胞成熟因子作用的特定化合物或化合物的组合的能力包 括在化合物存在下培养先前用肝细胞分化剂处理过的一群细胞，或将化合物包括在用肝 细胞分化因子处理的细胞培养物中。然后测定化合物对细胞形态、标记表达、酶活性、增殖 能力或其它感兴趣的特征的作用，比较不含候选化合物的平行培养物。对于最佳结果，评估了化合物的几个浓度。有机溶剂的合适基础浓度可以是与有效DMSO浓度等渗摩尔或等渗。 生长因子、细胞因子和其它激素的合适基础浓度可以是与其它系统中具有类似生长诱导或 激素活性的浓度。然后可测试的试验化合物超过约1/1(^到10倍基础浓度的范围，或更 大，从确定它是否对肝细胞指导的PPS细胞的成熟具有所需的作用。
一旦获得所需表型的细胞，可以收集细胞用于任何所需的用途。在本发明的某些 分化细胞群中，细胞足够表型均一，它们可以简单的通过将细胞从基质释放收集(例如使 用胶原酶或物理操作)，和任选的洗涤细胞除去碎片。如需要，收集的细胞可进一步通过阳 性筛选所需特征，或阴性筛选不需要的特征来处理。例如，可阳性或阴性筛选表达表面标记 或受体的细胞，通过细胞群与抗体或偶联配体一起孵育，然后分离出结合的细胞-例如使 用标记的分拣技术，或吸附到固体表面上。还可以通过将细胞群与针对不需要标记的细胞 裂解性抗体在补体存在下一起，孵育来进行阴性筛选。
如需要，收集的细胞可转移到其它培养环境中，例如对于其它类型的肝细胞制 备物的增殖所述的那些。见例如美国专利号5，030，105和5，576，207 ；EP专利申请EP 953，633 ；Angeill 等，Histochem J. 29 :205，1997 ；Gomez-Lechon 等，p. 130，下文，《药物研 究的体内方法》，Academic Press, 1997)。
分化的细胞的特征
根据许多表型条件可以表征细胞。条件包括但不限于检测或定量表达的细胞标 记，和酶活性，以及形态特征和胞内信号的表征。
本发明描述的一些分化的PPS细胞具有肝细胞的特征性形态特征。这些特征易 被本领域技术人员在评估这些情况中识别，包括任何或下列全部多边形细胞形状，双核表 型，存在粗面内质网用于合成分泌的蛋白质，存在高尔基-内质网溶酶体复合物用于胞内 蛋白质分拣，存在过氧化物酶体和糖原颗粒，相对丰富的线粒体，和形成紧密胞内连接的能 力，导致形成胆小管空间。存在于单细胞中的许多这些特征与作为肝细胞谱系的成员的细 胞一致。可通过对分化的PPS细胞，成年或胎儿肝细胞和一种或多种阴性对照细胞，例如成 纤维细胞，或RPE(视网膜色素上皮)细胞的显微照片编码进行无偏的测定细胞是否具有肝 细胞的特征性形态特征-然后以不知情方式评估显微照片，并解开编码来确定分化的PPS 细胞是否可被准确鉴别。
本发明的细胞还可以根据它们是否表达肝细胞谱系特征性表型标记来表征。用于 辨别肝脏祖细胞、肝细胞和胆表皮的细胞标记如表1所示(根据kil & Zoran，LiVer Stem Cells, R. G. Lardes Co. , TX, 1997, p35 ；禾口 Grisham 等，"Stem Cells，，，Academic Press, 1997，p242 改编)。
表1:肝细胞标记
1权利要求
1.一种将来自已建立的人胚胎干细胞的细胞用组蛋白去乙酰酶抑制剂分化成肝细胞 品系细胞，所述肝细胞品系细胞含有来自已建立的人胚胎干细胞系的细胞的方法。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组蛋白去乙酰酶抑制剂是正丁酸盐。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述组蛋白去乙酰酶抑制剂是正丁酸盐同 系物。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括将来自已建立的人胚胎干细胞系的 细胞与二甲基亚砜一起培养。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括将来自已建立的人胚胎干细胞系的 细胞与人表皮细胞生长因子一起培养。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括将来自已建立的人胚胎干细胞系的 细胞与TGF-α —起培养。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括将来自已建立的人胚胎干细胞系的 细胞与肝细胞生长因子一起培养。
全文摘要
已发现在肝细胞分化剂存在下培养多能干细胞时，衍生出一群细胞，其中有显著高比例的具有干细胞表型特征的细胞。在一个例子中，使人胚胎干细胞形成胚状体，然后与分化剂正丁酸盐混合，可任选地补充成熟因子。在另一个例子中，在无饲养细胞培养物中的人胚胎干细胞中加入正丁酸盐。在两种方法中都获得了显著均一的细胞群，它主要是由具有肝细胞形态特征的细胞组成的，表达肝细胞特征性表面标记，还具有对肝功能重要的酶和生物合成作用。由于肝细胞易在培养物中增殖，因此该系统为各种用途，例如药物筛选和临床治疗中补充肝功能提供了肝细胞谱系细胞的丰富来源。
文档编号C12N15/09GK102031241SQ201010528128
公开日2011年4月27日 申请日期2001年4月26日 优先权日2000年4月27日
发明者拉克舒美·蓝哈拉, 莫莉莎·K·卡本特 申请人:杰龙公司