一种用于肝细胞良、恶性肿瘤辅助诊断的双染试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及免疫组织化学领域，更具体地说，涉及一种用于肝细胞良、恶性肿瘤辅助诊断的双染试剂盒及其应用和辅助鉴别诊断肝细胞良、恶性肿瘤的免疫组织化学双染检测方法。
【背景技术】
[0002]肝癌是一种严重危害人类生命和健康的恶性肿瘤，其患病率在我国呈逐年上升趋势，该病手术切除率低，5年生存率不到5%，现居我国癌症死因的第2位。原发性肝癌的发病原因及临床表现较为复杂，缺乏特异性，往往在临床确诊时已出现远处转移，进而延误治疗，术后生存率低。因此原发性肝癌的预防、诊断及治疗仍是目前医学领域研宄的重大课题。肝细胞癌(HCC)是最常见的原发性肝脏恶性肿瘤，占肝癌的70%-85%。完全依靠形态学鉴别HCC和其他肝肿块存在困难，不易区分。IHC在辅助诊断肝脏良恶性肿块中可以发挥重要的作用，但常用抗体CEA(Polyc1nal)，⑶10，AFP等缺乏特异性和敏感性，对诊断的帮助不大。
【发明内容】
[0003]本发明要解决的技术问题在于，针对现有技术的上述缺陷，提供一种由两种灵敏度和特异性俱佳的免疫组化标记物的组成的双染试剂盒，该双染试剂盒用于辅助鉴别诊断肝细胞良、恶性肿瘤和肿瘤分化程度的鉴别。
[0004]本发明解决其技术问题所采用的技术方案是:提供一种用于肝细胞良、恶性肿瘤辅助诊断的双染试剂盒，包括混合一抗，所述混合一抗为Arginase-1与Glypian_3的混合抗体。
[0005]本发明所述的双染试剂盒，其中，所述混合一抗中Arginase-1与Glypian_3在混合一抗中的滴度分别为90-110和90-110。
[0006]本发明所述的双染试剂盒，其中，该双染试剂盒还包括混合二抗，所述混合二抗为碱性磷酸酶标记羊抗兔二抗与辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗的混合抗体。
[0007]本发明所述的双染试剂盒，其中，该双染试剂盒还包括显色试剂AP-Red和DAB，以及TBS缓冲液。
[0008]本发明还提供一种如上述的双染试剂盒在辅助鉴别诊断肝细胞良、恶性肿瘤中的应用。
[0009]本发明还提供一种非诊断性鉴别肝细胞良、恶性肿瘤的检测方法，其中，使用如上述的双染试剂盒，其检测方法包括以下步骤:
[0010](I)脱蜡和水化:脱蜡前将组织切片放在烤片机上烘烤，然后依次置于二甲苯、无水乙醇、95%乙醇和蒸馏水中浸泡；
[0011](2)抗原修复:将步骤(I)中组织切片放在EDTA抗原修复液中煮沸修复，冷却，自来水冲洗，蒸馏水浸泡；
[0012](3)封闭:在步骤(2)中组织切片中滴加3%过氧化氢，室温孵育，用蒸馏水冲洗，TBS缓冲液清洗并浸泡；
[0013](4)双染:在步骤(3)中组织切片滴加混合一抗，经室温孵育后，TBS缓冲液清洗，滴加混合二抗，经室温孵育，TBS缓冲液清洗，加入显色剂DAB和AP-Red显色；
[0014](5)复染:将步骤⑷中组织切片放入苏木素溶液中复染，TBS缓冲液返蓝；
[0015](6)脱水:将步骤(5)中组织切片置于95%乙醇、无水乙醇依次浸泡；
[0016](7)透明:将步骤(6)中组织切片置于二甲苯中浸泡；
[0017](8)封片。
[0018]本发明所述的检测方法，其中，还包括对步骤(I)中组织切片的前处理步骤，该组织切片用10%中性福尔马林固定，组织切片厚度为2-5 μ m。
[0019]实施本发明的一种用于肝细胞良、恶性肿瘤辅助诊断的双染试剂盒及其应用，具有以下有益效果:
[0020]本发明提供的两种免疫组织化学标记物用于辅助鉴别诊断肝细胞良、恶性肿瘤和肿瘤的分化程度，并对两种标记物用不同的检测系统，利用各自标记物染色的目标细胞差异，通过染色标记显示出来，提高了在同一张片子的信息量和差异化染色，增加了阅片的可读性和精确度，对于良、恶性肝细胞肿瘤和肿瘤的分化程度的鉴别有重要意义。
【附图说明】
[0021]下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中:
[0022]图1为肝结节增生组织中Arginase-1和Glypican_3的表达情况；
[0023]图2为低分化肝癌组织中Arginase-1和Glypican-3的表达情况；
[0024]图3是为高分化肝癌组织中Arginase-1和Glypican-3的表达情况。
【具体实施方式】
[0025]下面，结合附图以及【具体实施方式】，对本发明做进一步描述:
[0026]本发明涉及的实验操作步骤均为本领域常规的步骤，所用物料可从市场上购得。
[0027]Arginase-1 (精氨酸酶I)是一种双核猛金属蛋白酶，可催化精氨酸到鸟氨酸和尿素的水解。在本发明的研宄过程中发现=Arginase-1作为一个尿素循环的关键酶，在正常肝脏组织的肝细胞中的表达具有很高的特异性，胆管上皮细胞、肝窦内皮细胞、枯否细胞及血管内皮细胞均不表达。在分化不同的肝细胞肝癌表达有显著差异，在高、中分化的肝细胞肝癌的表达率高达92%以上，而在低分化肝细胞肝癌几乎不表达。
[0028]Glypican-3 (磷脂酰肌醇蛋白聚糖3)是一种硫酸肝素糖蛋白和癌胚抗原，编码该蛋白的基因位于Xq26。过度生长综合症与该基因缺失的基因是有关。Glypican-3表达于胚胎性肝、肾、肺组织及胎盘组织滋养叶细胞层中，在肿瘤性组织中在肝癌、卵黄囊瘤、绒毛膜癌、黑色素瘤中可见Glypican-3表达，在其他组织中不表达。本发明的研宄中发现与Arginase-1在不同程度分化的肝癌表达相反，Glypican-3在肝肿瘤组织中高分化和良性组织不表达，而在中低分化的肝细胞肝癌表达，有较高的特异性。
[0029]免疫组化利用抗原和抗体特异性结合的原理，通过化学反应使显色剂显色来检测组织标本中抗原的存在，并可以进行定位分析。目前免疫组化已经广泛应用于临床病理诊断，是一种直观、可靠的检测手段。本发明中利用免疫组织化学双染检测在同一组织中的两个抗原表达情况和相互的关系，可以在同一组织片子中可以观察到两种不同的抗原Arginase-1和Glypican-3表达情况，对于肝细胞肿瘤的良、恶性和分化高低的判别有显著帮助。
[0030]本发明的一种用于肝细胞良、恶性肿瘤辅助诊断的双染试剂盒，包括以下组分:混合一抗为Arginase-1与Glypian_3的混合抗体，混合二抗为碱性磷酸酶标记羊抗兔二抗与辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗的混合抗体，显色试剂为AP-Red与DAB，TBS缓冲液。
[0031]其中，所述混合一抗中Arginase-1与Glypian_3在混合一抗中的滴度分别为90-110和90-110。其中，Arginase-1在混合一抗中的滴度的滴度为90，即表示Arginase-1按1:90的稀释度稀释。
[0032]其中，碱性磷酸酶标记羊抗兔二抗为碱性磷酸酶标记羊抗兔IgG，辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗鼠IgG。
[0033]所述混合二抗中碱性磷酸酶标记羊抗兔二抗与辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗按体积比1:1混合而成。
[0034]本发明还提供一种如上述的双染试剂盒在辅助鉴别诊断肝细胞良、恶性肿瘤中的应用。
[0035]本发明还提供一种非诊断性鉴别肝细胞良、恶性肿瘤的检测方法，其中，使用如上述的双染试剂盒，其检测方法包括以下步骤:
[0036](O)将组织切片用10%中性福尔马林固定，组织切片厚度为2-5 μ m。
[0037](I)脱蜡和水化:脱蜡前将步骤(O)中的组织切片放在60°C烤片机上烘烤2小时，然后依次置于二甲苯中浸泡10分钟两次，无水乙醇中浸泡5分钟两次，95%乙醇中浸泡5分钟一次，蒸馏水中浸泡I分钟一次。其中，将组织切片放在烤片机上烘烤，可使切片粘附更牢固不易脱片，也有利于脱蜡。
[0038](2)抗原修复:将步骤(I)中组织切片放在EDTA抗原修复液(EDTA抗原修复液的PH值在8.8-9.2，具体地在pH9.0中煮沸修复，冷却，自来水冲洗，蒸馏水浸泡；
[0039](3)封闭:在步骤⑵中组织切片中滴加3%过氧化氢，室温孵育10分钟，用蒸馏水冲洗，TBS缓冲液清洗并浸泡；
[0040](4)双染:在步骤(3)中组织切片滴加第一抗体，即Arginase-1和Glypican-3混合一抗，经室温孵育60分钟后，用TBS缓冲液清洗，滴加第二抗体，即碱性磷酸酶标记羊抗兔二抗与辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗的混合二抗，经室温孵育60分钟，用TBS缓冲液清洗，加入显色剂DAB和AP-Red显色；
[0041](5)复染:将步骤⑷中组织切片放入苏木素溶液中复染，TBS缓冲液返蓝；
[0042](6)脱水:将步骤(5)中组织切片置于95%乙醇浸泡5分钟，无水乙醇浸泡5分钟两次；
[0043](7)透明:将步骤(6)中组织切片置于二甲苯中浸泡5分钟三次；
[0044](8)封片即可用置于显微镜下观察并拍照。
[0045]实施例1
[0046]研宄对象为福尔马林固定-石蜡包埋的肝