可促进皮肤修复与再生的美容护肤品及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种可促进皮肤修复与再生的美容护肤品及其制备方法和应用。该方法包括（1）配置培养液；（2）将对数期的干细胞以1x10^4/ml至1x10^6/ml的密度接种于培养液中37℃培养3-72小时；（3）采用共培养的方法，或者向细胞培养液中添加细胞因子的方法，将间充质干细胞激活使其分泌活性物质；（4）去除培养液中的细胞收获上清液，即得精华液；还包括（5）降解、制剂：将精华液进一步降解，得到适于皮肤吸收的精华液；再将该精华液加入到美容护肤品配方中制成各种不同剂型的美容护肤品。该美容护肤精华液中含细胞培养液中的营养成分，还含活性因子TIMP-1，1.0～5.0mg/L；MCP-1，100～500μg/L；EGF，5～50μg/L。本发明的美容护肤品易于被皮肤吸收，可促进皮肤修复与再生。
【专利说明】可促进皮肤修复与再生的美容护肤品及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物美容化妆品【技术领域】，具体涉及一种可促进皮肤修复与再生的美容护肤品及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002]目前市场上常见的美容护肤品有膏、霜、乳、液、凝胶等多种剂型，一般由具有美容功效的成分添加赋形剂(乳化剂、增稠剂等)制成。常用的美容功效成分有:有机小分子(如甘油、丁二醇、水杨酸)、有机大分子(如PEG等聚合物、交联物)、无机物(如二氧化钛)、生物制品(如重组表皮生长因子)等，以及植物提取物(如芦荟、薰衣草)、动物源成分(如蛇油)、矿物成分(如石蜡、滑石粉等)等。
[0003]干细胞是一种具有分化潜能的种子细胞，具有无限的自我更新复制能力，在一定条件下能分化成特定组织。干细胞在生长、增殖、分化过程中会向胞外分泌促进细胞生长及调节周围环境的细胞因子等活性物质。哺乳动物的干细胞在培养过程中，细胞会向胞外分泌大量的皮肤修复因子和伤口愈合因子等活性物质，进入培养后的细胞培养液中。以哺乳动物的间充质干细胞为例，其在体外培养过程中向培养液中释放的活性物质主要有IL-6、IL-8、单核细胞趋化蛋白I (MCP-1)、成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮细胞生长因子(EGF)、组织基质金属蛋白酶抑制因子Ι(--ΜΡ-Ι)等，具有调节免疫反应、激活细胞活动的作用。
[0004]间充质干细胞具有自我复制能力和多向分化潜能，并有造血支持和促进干细胞植入、免疫调节等能力；其多向分化潜能表现为，在体内或体外特定的诱导条件下，可分化为脂肪、骨、软骨、皮肤、肌 肉、神经、肝、心肌、内皮等多种组织的细胞，特别是具有分化为成纤维细胞(皮肤真皮层的主要构成细胞)和表皮细胞的能力。间充质干细胞来源于发育早期的中胚层和外胚层，最初在骨髓中发现，后来发现也可从胎盘、脐带、脂肪等多种组织中分离到。
[0005]经鉴定体外培养的间充质干细胞能够向培养液中分泌--ΜΡ-1、MCP-1和EGF三种细胞因子。
[0006]人组织基质金属蛋白酶抑制因子I (TIMP-1, Tissue Inhibitor ofMetallo-Proteinase I)是一个分子量为28.5kD的糖蛋白，全长约207个氨基酸，其中1-23为信号肽。--ΜΡ-1是--ΜΡ家族中的一员，是基质金属蛋白酶(MMP，MatrixMetallo-Proteinase)的天然抑制因子，而MMP参与细胞外基质的降解。--ΜΡ-1还具有促进多种类型的细胞增殖的作用，还可能有抗细胞凋亡的功能。--ΜΡ-1可为许多类型的细胞所表达，并存在于多种组织和体液中。TIMP分子中有大量的二硫键，因此可抵抗极端温度、pH和变性等恶劣环境。
[0007]单核细胞趋化蛋白I (MCP-1, Monocyte Chemotactic Protein I)又称单核细胞趋化和激活因子(Monoctye Chemotactic and Activating Factor, MCAF),人 MCP-1 前体长99个氨基酸，1-23为信号肽，成熟分子长76个氨基酸，非糖基化分子量8.7kD，糖基化后MCP-1分子量13kD，为碱性蛋白。目前已知MCP-1可由单核细胞、成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等多种细胞在细胞因子或某些病毒刺激下分泌。MCP-1对单核细胞具有趋化活性，激活单核细胞和巨噬细胞，活化的巨噬细胞可抑制肿瘤细胞的生长。MCP-1也是嗜碱性粒细胞的趋化剂和激活剂。
[0008]人表皮生长因子(Epidermal growth factor, EGF)由53个氨基酸组成，分子量
6.2kD，无糖基部位，非常稳定，耐热耐酸，广泛存在于体液和多种腺体中，主要由颌下腺、十二指肠合成，在人体的绝大多数体液中均已发现，在乳汁、尿液、精液中的含量特异性地增高，但在血清中的浓度较低。EGF可刺激多种细胞的增殖，主要是表皮细胞、内皮细胞。在角膜损伤、烧烫伤及手术等创面的修复和愈合上取得了很好的疗效，Montalcini和Cohen教授因为发现表皮生长因子并分析其结构和作用机理，获得1986年诺贝尔生理学及医学奖。
[0009]而细胞培养液由氨基酸、维生素、糖、微量元素、抗氧化剂等成分组成，各成分及其浓度和PH系根据细胞生长和增殖的需要按比例添加，具有细胞生长和增殖所需的全部营养成分，并且处于最优浓度。
[0010]将细胞培养液营养成分与培养于其中的离体活细胞在特定条件下分泌的活性物质结合起来，可制成易于被皮肤吸收的美容护肤品的功效成分，具有补充皮肤营养、修复皮肤损伤、激活皮肤细胞更新、减轻炎症反应的作用。如何将间充质干细胞充分激活，使其分泌更多有助于皮肤修复和增强活力的物质，制成可促进皮肤修复与再生的美容护肤品，是本领域面临的一大课题。
【发明内容】
[0011]本发明的目的在于提供一种能使间充质干细胞分泌更多皮肤修复活性物质，可促进皮肤修复与再生的美容护肤`品及其制备方法和应用，与现有技术相比更符合皮肤细胞生活和更新、再生对营养的需求。
[0012]本发明的技术方案如下:
[0013]一种可促进皮肤修复与再生的美容护肤品的制备方法，按以下步骤顺序进行:
[0014](I)培养液配置:
[0015]配置间充质干细胞无血清培养液，其成分中含有氨基酸、维生素、糖、微量元素、不饱和脂肪酸、抗氧化剂和细胞生长因子；具体如下:
[0016]间充质干细胞培养液:DMEM-LG+F12+BSA+bFGF+TGF-β +PDGF
[0017](2)细胞培养:
[0018]将对数期的间充质干细胞以lxl0~4/ml至lxl0~6/ml的密度接种于上一步配置的培养液中，37°C培养3-72小时；所述的间充质干细胞是哺乳动物的间充质干细胞，包括骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞；
[0019](3)细胞激活:
[0020]采用将另一种类型的细胞与培养液中原来的细胞共培养的方法，或者采用向细胞培养液中添加细胞因子的方法将间充质干细胞激活，使其分泌有助于皮肤修复和增强活力的物质；
[0021](4)去除细胞、收获上清液:[0022]去除培养液中的所有细胞，收获细胞培养后的上清液，即得富含细胞活性因子的皮肤修复精华液。
[0023]上述可促进皮肤修复与再生的美容护肤品的制备方法，还可增加如下步骤:
[0024](5)降解、制剂:
[0025]往上一步制得的皮肤修复精华液中添加能够分解蛋白的物质(优选胰蛋白酶)，将其中的大分子蛋白质降解为短肽，然后去除分子量超过3500道尔顿的物质，得到富含细胞活性因子且适于人体皮肤吸收的皮肤修复精华液；之后，再将该皮肤修复精华液，加入到各种美容护肤品的配方中，制成可涂抹于皮肤表面的各种不同剂型的美容护肤品。(即经添加其它组分，工艺变化后可制成水剂、乳剂、膏剂、霜剂、凝胶剂、冻干产品、粉剂等产品，可起到皮肤修复与再生的同样功效，同时可提高除菌有效期。)
[0026]上述方法步骤(4)中所述的去除培养液中的细胞的方法是离心和/或过滤。
[0027]上述方法步骤(3)中所述的具体的细胞激活方法如下:
[0028]间充质干细胞激活方法I (共培养法):
[0029]A.配置神经干细胞培养液:StemPro神经干细胞无血清培养液(StemPro NSCSFM,购自 Lifetechnologies 公司，货号 A10509-01 )+GlutaMax 补充剂(购自 Lifetechnologies公司，货号35050-061)
[0030]B.将神经干细胞以lxl0~4/ml至5xl0~5/ml的密度接种于上一步配置的培养液中，培养24-72小时，至对数期；
[0031]C.收获神经干细胞(如采用离心法)，以2:1~1:2的数量比添加到步骤(2)中的间充质干细胞培养物中，共培养12-24小时。
[0032]间充质干细胞激活方法2 (添加含有神经干细胞分泌物的培养浓缩液法):
[0033]A.配置神经干细胞培养液:StemPro神经干细胞无血清培养液(StemPro NSCSFM,购自 Lifetechnologies 公司，货号 A10509-01 )+GlutaMax 补充剂(购自 Lifetechnologies公司，货号35050-061)
[0034]B.将神经干细胞以lxl0~5/ml至5xl0~5/ml的密度接种于上一步配置的培养液中，培养24-48小时；
[0035]C.去除神经干细胞(采用离心或过滤的方法)，将剩余的培养液(其中含有神经干细胞分泌物)浓缩至原先体积的1/5~1/20 (这个浓缩比例是与后面的添加比例挂钩的；如果浓缩到1/5，下一步的体积添加比例就是2-20% ;如果浓缩到1/20，下一步的体积添加比例就是0.5-5% ;如果浓缩到1/10，下一步的体积添加比例就是1-10%)；
[0036]D.将浓缩液以0.5-20%的体积比添加到步骤(2)中的间充质干细胞培养液中，继续培养6-24小时。
[0037]上述神经干细胞培养液组分中:
[0038]StemPro神经干细胞无血清培养液(StemProNSCSFM)是本领域熟知的培养基试剂盒,可以购自 Lifetechnologies 公司，货号 A10509-01，试剂盒由 KNOCKOUT DMEM/F12 (货号 12660-012)、重组人 bFGF (货号 PHG0024)、重组人 EGF (货号 PHG0314)、StemPro NeuralSupplement (货号 A10508-01)组成。
[0039]KN0CK0UTDMEM/F12是Lifetechnologies公司提供的一种不含L-谷氨酰胺或HEPES缓冲液的低渗透压培养基，货号12660-012，经过优化，用于人胚胎干细胞和诱导的多能干细胞的生长。
[0040]bFGF (碱性成纤维细胞生长因子)是本领域已知的一种细胞因子，其对成纤维细胞、血管内皮细胞、神经元和神经胶质细胞等多种细胞具有很强的促细胞分裂增殖活性。
[0041]EGF (表皮生长因子)是本领域已知的一种细胞因子，其可刺激上皮细胞和多种细胞增殖。
[0042]StemPro Neural Supplement 是Lifetechnologies 公司提供的一种无血清营养补充剂，货号A10508-01，可用于人源和鼠源神经干细胞、神经祖细胞的生长和扩增。
[0043]GlutaMax补充剂可以购自Lifetechnologies公司，货号35050-061,配方是200mML-乙酰-L-谷氨酰胺二肽(溶解于0.85%氯化钠溶液)。
[0044]一种可促进皮肤修复与再生的美容护肤品，它是通过上述方法中的步骤(1)到步骤(4)使用哺乳动物的间充质干细胞制备而成的皮肤修复精华液；其中含有体外培养的间充质干细胞分泌到胞外的活性物质成分，还含有细胞培养液配置步骤中添加的营养成分(氨基酸、维生素、糖、微量元素、不饱和脂肪酸、抗氧化剂和细胞生长因子)；经进一步鉴定，这些成分包括细胞分泌到胞外的组织基质金属蛋白酶抑制因子I (TIMP-1)、单核细胞趋化蛋白I (MCP-1)和表皮细胞生 长因子(EGF)，并且其浓度分别为:
[0045]组织基质金属蛋白酶抑制因子I (--ΜΡ-1)，1.0~5.0mg/L ；
[0046]单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1)，100~500 μ g/L ；
[0047]表皮细胞生长因子(EGF)，5~50 μ g/L ;
[0048]该美容护肤品(即皮肤修复精华液)可用于修复美化表皮破损的皮肤。
[0049]另一种可促进皮肤修复与再生的美容护肤品，它是通过上述方法中的步骤(1)到步骤(5)制备而成，即:它是将上述皮肤修复精华液进一步用胰蛋白酶或其它能够分解蛋白的物质(如:木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等)分解，再将其加入到各种美容护肤品的配方中，制成的可涂抹于皮肤表面的各种不同剂型的美容护肤品，包括水剂、乳剂、膏剂、霜剂、凝胶剂、冻干产品、粉剂；其中的精华液中含有上述浓度的组织基质金属蛋白酶抑制因子1、单核细胞趋化蛋白I和表皮细胞生长因子经胰蛋白酶或其它能够分解蛋白的物质分解后产生的短肽；
[0050]该美容护肤品可用于修复美化表皮无破损的皮肤。
[0051]本发明的有益效果:
[0052]本发明将细胞培养液营养成分与培养于其中的干细胞在特定条件下分泌的活性物质结合起来，利用干细胞生长过程中产生的细胞因子(--ΜΡ-1、MCP-1和EGF等)，把干细胞培养液离心去除细胞后的上清液作为皮肤修复美容护肤产品；同时，在干细胞培养过程中，采用特殊的细胞激活方法，使间充质干细胞分泌更多皮肤修复活性物质，从而制得可促进皮肤修复与再生的美容护肤品。有科学研究表明TIMP-1、MCP-1具有促进皮肤创伤愈合作用，可治疗皮肤创伤和糖尿病足；bFGF、EGF有皮肤组织修复和促进皮肤细胞增殖的作用，可用于烧烫伤皮肤治疗。从哺乳动物干细胞培养液中收集获得具有细胞生命本性的细胞因子，则成为最适合人体皮肤细胞，乃至其它器官生长的营养源。
[0053]本发明提供了一种从干细胞培养液中制备获得安全、有效的皮肤修复美容护肤品的方法及其产品，成为人体皮肤修复的新途径。本发明的方法简单易行，使用设备简单，可以利用干细胞培养液，通过进一步改进，获得一种安全低成本的高科技生物美容护肤产品，其优势显著。本发明的美容护肤品具有促进皮肤伤口愈合、修复皮肤受损表面和促进皮肤再生的功效。该美容护肤品与人体有良好的相容性，易于被人体吸收，对皮肤细胞生长有良好的促进作用，能促进皮肤创面愈合，加快细胞新陈代谢，增强皮肤细胞活力。
【具体实施方式】
[0054]下面结合实施例对本发明作进一步详细的说明:
[0055]实施例1:
[0056](一)、本发明的一种美容护肤啫喱制备方法:
[0057](I)培养液配置步骤:
[0058]按以下配方配置间充质干细胞无血清培养液(所用试剂均购自Lifetechnologies
公司):
【权利要求】
1.一种可促进皮肤修复与再生的美容护肤品的制备方法，其特征在于，按以下步骤顺序进行:(1)培养液配置:配置间充质干细胞无血清培养液，其成分中含有氨基酸、维生素、糖、微量元素、不饱和脂肪酸、抗氧化剂和细胞生长因子；(2)细胞培养: 将对数期的间充质干细胞以lxl0~4/ml至lxl0~6/ml的密度接种于上一步配置的培养液中，37°C培养3-72小时；所述的间充质干细胞是哺乳动物的间充质干细胞，包括骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞；(3)细胞激活:采用细胞激活方法将间充质干细胞激活，使其分泌有助于皮肤修复和增强活力的物质；所述的细胞激活方法是:将另一种类型的细胞与培养液中原来的细胞共培养的方法，即共培养法；或者是，采用向细胞培养液中添加细胞因子的方法；(4)去除细胞、收获上清液:去除培养液中的所有细胞，收获细胞培养后的上清液，即得富含细胞活性因子的皮肤修复精华液。
2.如权利要求1所述的美容护肤品的制备方法，其特征在于，该方法还包括步骤(5)降解、制剂:往上一步制得的皮肤修复精华液中添加能够分解蛋白的物质，将其中的大分子蛋白质降解为短肽，然后去除分子量超过3500道尔顿的物质，得到富含细胞活性因子且适于人体皮肤吸收的皮肤修复精华液；之后，将该皮肤修复精华液，加入到各种美容护肤品的配方中，制成可涂抹于皮肤表面的各种不同剂型的美容护肤品，包括水剂、乳剂、膏剂、霜剂、凝胶剂、冻干产品、粉剂。
3.如权利要求1或2所述的美容护肤品的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的间充质干细胞无血清培养液为:DMEM-LG+F12+BSA+bFGF+TGF-0 +PDGF。
4.如权利要求1或2所述的美容护肤品的制备方法，其特征在于，步骤(4)中所述的去除培养液中的所有细胞的方法是:离心和/或过滤。
5.如权利要求2所述的美容护肤品的制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述的能够分解蛋白的物质是胰蛋白酶。
6.如权利要求1或2所述的美容护肤品的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述的共培养法，是将神经干细胞与培养液中原来的间充质干细胞共培养的方法，具体按如下步骤进行:A.配置神经干细胞培养液=StemPro神经干细胞无血清培养液+GlutaMax补充剂；B.将神经干细胞以lxl0~4/ml至5xl0~5/ml的密度接种于上一步配置的培养液中，培养24-72小时，至对数期；C.收获神经干细胞，以2:1~1:2的数量比添加到步骤(2)中的间充质干细胞培养物中，共培养12-24小时；步骤(3 )中所述的向细胞培养液中添加细胞因子的方法，是向间充质干细胞培养液中添加含有神经干细胞分泌物的培养浓缩液法，具体按如下步骤进行:A.配置神经干细胞培养液=StemPro神经干细胞无血清培养液+GlutaMax补充剂；B.将神经干细胞以lxl0~5/ml至5X10~5/ml的密度接种于上一步配置的神经干细胞培养液中，培养24-48小时；C.采用离心或过滤的方法去除神经干细胞，将剩余的其中含有神经干细胞分泌物的培养液，浓缩至原先体积的1/5~1/20 ；D.将浓缩液以0.5-20%的体积比添加到步骤(2)中的间充质干细胞培养液中，继续培养6-24小时。
7.一种按权利要求1所述的方法制备得到的可促进皮肤修复与再生的美容护肤品，其特征在于，它是使用哺乳动物的间充质干细胞按所述方法制备而成的皮肤修复精华液；其中含有体外培养的间充质干细胞分泌到胞外的活性物质成分，还含有细胞培养液配置步骤中添加的营养成分氨基酸、维生素、糖、微量元素、不饱和脂肪酸、抗氧化剂和细胞生长因子；其中，含有的间充质干细胞分泌到胞外的组织基质金属蛋白酶抑制因子1、单核细胞趋化蛋白I和表皮细胞生长因子的浓度分别为:组织基质金属蛋白酶抑制因子I, 1.0~5.0mg/L ；单核细胞趋化蛋白1，100~500 μ g/L ；表皮细胞生长因子，5~50 μ g/L。
8.按权利要求7所述的可促进皮肤修复与再生的美容护肤品，其特征在于，它是将所述皮肤修复精华液进一步用能够分解蛋白的物质分解，再将其加入到各种美容护肤品的配方中，制成的可涂抹于皮肤表面的各种不同剂型的美容护肤品，包括水剂、乳剂、膏剂、霜剂、凝胶剂、冻干产品、粉剂。
9.如权利要求7所述的可促进皮肤修复与再生的美容护肤品在修复美化表皮破损的皮肤中的应用。
10.如权利要求8所述的可促进皮肤修复与再生的美容护肤品在修复美化表皮无破损的皮肤中的应用。
【文档编号】A61K8/64GK103550117SQ201310493266
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年10月18日 优先权日:2013年10月18日
【发明者】金宜强, 刘军, 杨立敏 申请人:上海润生生物技术有限公司