专利名称：用于皮肤再生的方法和组合物的制作方法
用于皮肤再生的方法和组合物相关申请的交叉引用本专利申请要求2009年10月7日提交的名称为“Methods and composition forcell, tissue, and organ regeneration and repair (用于细胞、组织和器官再生与修复的方法和组合物)”的美国临时专利申请系列第61/278，576号和2010年9月7日提交的名称为“Methods and composition for skin regeneration (用于皮肤再生的方法和组合物)”的美国临时专利申请系列第61/380，671号的权益，通过引用将上述申请全文并入本文。本发明的技术领域
本发明涉及通过人或其他动物的局部应用区域内的分化和生长诱导组织和细胞再生的组合物和方法。具体而言，本发明涉及包含诸如胰岛素样生长因子-I (IGF-I)的生物学或药理学活性剂的组合物。更具体而言，本发明涉及用于皮肤修复和再生的包含IGF-I和诸如透明质素(hyaluronan)的基质形成成分的缓释纳米颗粒制剂。
背景技术：
根据最近的报道，即由Life Science Intelligence (LSI)所发布的组织工程与再生医学的全球市场和新兴技术(Worldwide Markets and Emerging Technologiesfor Tissue Engineering and Regenerative Medicine),组织工程与再生医学产品的最大未开发全球市场潜力到2013年会超过1180亿美元。(www.medicalnewstoday.com/articles/141341, php; 2010 年 8 月 16 日访问)。皮肤具有无须辅助修复其自身的固有能力。因此，在简单外伤的情况下，皮肤可以通过其自身修复功能再生。然而，在难愈性创伤的情况下，例如严重烧伤和由于辐射照射的复合创伤，皮肤难以完全再生。高级创伤护理产品的全球市场在2007年价值为46亿美元，并预期到2012年达到125亿美兀(Wound Care Markets (创伤护理市场)，4th Edition (第4 版)，Vol. I: Skin Ulcers. Kalorama Information. 2009)。皮肤老化是影响皮肤和皮下组织的各个层的复杂生物过程，但其主要影响见于真皮。同时发生两种生物学上独立的老化过程。第一种是内因性老化，其影响皮肤以及最可能内部器官。第二种是外因性老化或光老化，其是暴露于自然环境，主要是紫外线辐射的结果。因此，患者关心的主要区域一面部和颈部皮肤的最明显的变化是由于内因性和外因性老化过程的组合。真皮填充物的全球市场预计以两位数或接近两位数的速度持续增长，到2010年接近9. 5亿美兀。(Dermal Filler Market:More than Skin Deep (真皮填充物市场不只是表面) Mary Thompson, Scott Huntley, Medtech Insight 3/1/2008)。抗逆转录病毒疗法和人类免疫缺陷病毒(HIV)本身都引起特征为身体组成改变的HIV相关脂肪代谢障碍。身体组成改变包括两种独立的状况(a)过量的脂肪积累，其中深层腹部脂肪(内脏脂肪组织或VAT)围绕着内部器官——脂肥大；和(b)脂肪减少，其中皮下脂肪减少通常发生在脸部、四肢和臀部——脂肪萎缩。到2012年，在北美和欧洲约380,000名接受抗逆转录病毒治疗的患者会患有HIV相关脂肪代谢障碍，这样的话，这种疾病状况的潜在的总市场规模将是8. 11亿美元至13 亿美兀。(www. theratech. com/en/products-therapeutic-peptides/lipodystrophy.php; 2010年8月16日访问)这些疾病状况即皮肤老化、复合创伤和烧伤以及脂肪代谢障碍——是由皮下组织破坏导致的，皮下组织主要由脂肪细胞(adipocyte)(脂肪细胞(fat cell))和毛囊两种干细胞来源构成。创伤愈合的过程包括以下步骤(I)通过炎性细胞，随后是结缔组织细胞和表皮细胞识别受损区域；(2)创伤区域收缩；和(3)肉芽发生和上皮再形成。参与该过程的每个阶段的细胞、各种因子、细胞因子和分泌物已经被大量鉴定。皮肤的细胞再生由位于特化的微环境中的不同的成人干细胞/祖细胞亚群，滤泡间表皮(IFE)中的小环境、皮脂腺和毛囊隆起区域维持(Mimeault, M. and Batra, S.K. (2010), Recent advances on skin-resident stem/progenitor cell functions inskin regeneration, aging and cancers and novel anti-aging and cancer therapies. Journal of Cellular and Molecular Medicine, 14:116 - 134)。已经在上皮层的基底层中的基底膜附近鉴定出小簇的具有干细胞样特性并表达细胞角蛋白的未分化单能性角质细胞干细胞(KSC)。KSC在参与自我平衡条件下和皮肤损伤后表皮成熟角质细胞的连续补充中提供重要作用。在皮肤组织再生期间，包括胰岛素样生长因子(IGF-1，又称为生长调节素C)的复杂信号转导网络参与向角质细胞的增殖和/或分化。(Fuchs E. Skin stem cells:rising to the surface. ,/ ( W/ Biol.2008; 180:273 -84.)人工皮肤修复的研究起初仅修饰覆盖在损伤上的用于临时保护创伤表面的材料，现在已经达到利用诸如与创伤愈合有关的细胞因子和生长因子的试剂诱导更积极的治疗。然而，需要能够促进和诱导上皮形成的技术，其有用于再生和修复从简单到难愈性的各种程度的皮肤创伤，包括再生皮下组织。使用皮肤替代物治疗完全丧失全厚皮肤的患者已经可行。包含表皮细胞的皮肤替代物被称为人工表皮，包含真皮成纤维细胞的皮肤替代物被称为人工真皮，包含以上二者的皮肤替代物被称为人工皮肤。目前可用的人工真皮是其中含有成纤维细胞的具有不同基质的产品，例如Trans Cyte+1 Dermag raft*。然而,人工真皮以及人工表皮不具有在大创伤中诱导上皮形成的能力。含有表皮细胞和成纤维细胞的人工皮肤可以以Apligragt (NOVARTIS Pharma)^VivoDermR (Bristol-Myers Squibb)获得。然而，关于人工表皮层与真皮层之间的亲和力以及可获得的临床效果不足存在问题。此外，存在对目前的高度依赖于动物胶原蛋白或人血浆组分的皮肤替代物的安全性的担忧。供体组织极度缺乏，并且用免疫抑制药物治疗移植受体对移植受体产生大量的健康风险。自体或同种异体组织移植已经使用，但成功有限。可选的策略是利用植入的干细胞促进体内组织生长或产生用于移植的人工组织(由Vogel, Science 283:1432-1434 (1999)综述)。干细胞是可以自我更新并产生具有更特化功能的细胞的细胞(由Blau, Cell 105:829-841(2001) ;Weissman，Cell100:157-168(2000)综述)。利用包含多层皮肤等效物的间叶细胞干细胞进行皮肤再生的方法公开于EP0953040，所述多层皮肤等效物具有(i)含有真皮形成细胞的支架层，和(ii)角质细胞层。然而，除了伦理问题，外来干细胞的使用还引起了对于由未分化的多能细胞导致的致肿瘤性和由外来物导致的免疫原性的担忧。因此，需要通过激活内源性(先存的)干细胞而避免与目前的干细胞疗法有关的多种缺点的可用于再生和修复皮肤的产品。发明概述伴随老化的干细胞活性降低在阻碍愈合和组织再生中起到重要的作用。本发明基于这样的发现成人皮肤细胞可被原位诱导从而经历向再生组织所需的多种细胞类型的分化。为了避免与传统干细胞治疗方案如干细胞分离、制备、手术、摘取等相关的缺点，本发明提供了通过局部递送干细胞活化剂和生长基质而用于内源干细胞活化的方法和组合物。
本发明提供了用于在足以修复和再生内源皮肤细胞和组织的时间段内、于局部位置缓释生长因子以活化内源干细胞的组合物和方法。所述方法通过增加这样的过程而利用了修复组织的自然本身的方法。如下文所详细描述的，本发明涉及一种产品，所述产品能在其应用的人或其他动物的局部区域内诱导分化和生长。所述产品用于老化、病变、创伤、疾病或异常的再生和修复，尤其用于再生和/或修复皮肤。描述了应用所述产品来再生和修复皮肤的方法。该产品可以通过局部应用、注射或向受影响的区域应用贴剂而用于再生皮肤。如在创伤愈合和美容应用中，提供了在处理和修复皮肤瑕疵中用于注射的实例方法。为了刺激新皮肤组织的产生，在有或没有其他物质如胶原蛋白、透明质素(也称为透明质酸(透明质酸)或透明质酸盐)和/或生物可吸收凝胶和/或支架或插入物的情况下，用含有生物学或药理学活性剂如胰岛素样生长因子-I (IGF-I)的针或注射器注射真皮或其他合适的区域。其他物质充当载体、生长基质、帮助机械刺激干细胞和/或以受控的方式释放生物活性剂。具有高生物相容性的透明质素、胶原蛋白或生物可吸收凝胶可以充当由该方法诱导的细胞和基质生长的生物材料架。所述支架或插入物还可以充当生长的永久性或暂时性支架或基质。可以在医生的办公室里将所述产品注射入真皮中，例如随时间以与目前在医师办公室里注射透明质素相似的方式重复注射。所述方法还用于多种应用中，包括其他组织修复。这些组合物和方法可用于处理和治疗老化、病变、创伤、疾病或异常，尤其用于再生和/或修复皮肤。所述处理方法包括预防性应用和治疗性应用。在本发明的一方面中，本文所公开的IGF-I的制剂和给药方法能降低副作用和不利反应，诸如低血糖症，这通常与当前给予IGF-I的方法相关，前给予IGF-I的方法随时间延长会导致高血清浓度。出人意料的是，本发明的发明人发现，当与用于缓释的HA (或其它生物可吸收聚合物、微型针、支架或插入物)联合并在小区域(0. I至10cm2，优选0. 25至6cm2的表面积或2至IOOOcm3输注体积)中局部给药来局部递送20、50、100、200、300、200或500ng(比目前为儿童规定的IGF-I剂量低约10，000倍)的单剂量的IGF-1时，能在注射的局部区域内产生意料不到的组织再生结果。此外，以这种方式给予的IGF-I的血清浓度保持在正常的生理范围内，因而避免了不想要的副作用和不利反应。根据结合附图对优选实施方案的以下详细描述，这些方面和其它方面将变得显而易见，但是可以进行改变和修改，而不会脱离本公开的新颖概念的实质和范围。
以下附图形成本说明书的一部分并包括在说明书中以进一步说明本公开的某些方面，通过参考这些附图中的一个或多个结合以下对具体实施方案的详细描述可以更好地理解本发明。专利或申请文件含有至少一张彩色制作的附图。具有彩色附图的本专利或专利申请公开的副本可以根据请求并在必要的付费后由专利局提供。图1A-1C展示了用注射器向小鼠真皮的局部区域注射PBS(对照，图1A)、HA(受损的，图1B)或GG002(具有透明质素的生物活性剂IGF-1)(再生的，图1C)之后14天的效果。每个图面展示4个不同的小鼠样品，切片并用苏木精和曙红(H&E)染色并在5倍放大倍率下观察的6_的钻孔活组织检查。 发明的详细描述本说明书所用的术语在本发明的背景下和在每个术语所用的具体背景下，通常具有其领域内的普通含义。以下或在说明书的其他地方将论述用于描述本发明的某些术语，从而为与本发明的描述相关的从业者提供另外的指导。为了方便，例如可以利用斜体和/或引号来突出某些术语。使用突出对术语的范围和含义没有影响。在相同的背景下，术语的范围和含义是相同的，无论其是否被突出。应当理解，同一事物可以以多于一种方式来说明。因此，对于本文所论述的任何一个或多个术语，都可以使用备选的语言和同义词，对无论是否在本文进行阐述或论述的术语均没有限制任何具体的意义。提供了某些术语的同义词。一个或多个同义词的表述不排除其他同义词的使用。本说明书中的任何地方所用的实例包括本文所论述的任何术语的实例都仅是示例性的，并且没有以任何方式限制本发明或任何示例的术语的范围和含义。同样，本发明并不局限于本说明书中所给出的各实施方案。除非另外定义，本文所用的所有技术和科学术语都具有本发明所属技术领域的技术人员通常所理解的含义。在有冲突的情况下，以本申请文件包括定义为准。本发明基于促进、刺激或诱导细胞迁移和/或增殖，这可用于创伤愈合、组织工程、美容和治疗性处理如皮肤替代和皮肤补充以及需要上皮细胞迁移和增殖的烧伤处理。不需要获得、摘取、分离或纯化外源干细胞；步骤可以在医生办公室里进行；生物活性剂和其它成分可以是生物可吸收的；药物递送是在损伤位置局部的，例如局部皮肤递送；所述步骤是微创的。在小鼠和人中，皮肤基底的细胞层含有能够发育成上述层中特化细胞的干细胞。两种转录因子C/EBPa和C/EBPP在基底角质细胞中共表达，并且当角质细胞经历终末分化时，二者被协同上调(Lopez RG et al. , Nat Cell Biol. 200911 (10) : 1181-1190)。利用动物模型，发现毛囊中的干细胞可被募集以辅助治愈皮肤中的创伤(Ito, M.，et al. Nat Med. 2005; 11 (12) : 1351-1354)。该发现提出了开发支持和促进创伤愈合的药物的一个治疗靶标。对成人毛囊(HF)中干细胞的研究揭示了，确实有一批极其多样的且动态的具有干细胞特性的角质细胞存在于HF的不同区域。尽管在正常的毛囊维持中被赋予了特定的功能，但是这些细胞的大多数可以充当多能干细胞(Jaks，V.，et al.，ExpCell Res. 2010;316(8):1422-1428)。信号转导级联的复杂网络如EGFR、Notch、胰岛素样生长因子(IGF-1)/IGF-Rl、免疫球蛋白样结构域I (Lrigl)、Myc、转化生长因子(TGF-0)和多梳家族蛋白BMI-1参与皮肤组织再生过程中角质细胞干细胞(KSC)增殖和/或分化成角质细胞的严格调控(Mimeault, M. and Batra, S. K. (2010). J, ( ell. and MoL Meci.. 14:116 - 134)。在一个实施方案中，递送至意图修复或再生皮肤的位置处的生物活性剂是IGF-I。在注射入受影响的区域后，生物活性物质(例如IGF-1)活化所述区域的内源干细胞从而产生新组织，例如真皮和皮下细胞和组织。人或其他动物中所用的用于再生目的的制剂由单独的诸如胰岛素样生长因子-I (IGF-I)的生物活性剂组成或联合有生物可吸收聚合物或其他合适的物质，所述生物可吸收聚合物如Uietel .、胶原蛋白、羟磷灰石、聚L乳酸、弹性蛋白、微球体、废弃的人皮肤基质和/或透明质素。 所用的IGF-I可以为FDA批准的任何制药有效的可商购获得的形式。在一个实施方案中，使用与天然激素IGF-I相同的重组产生的形式即丨ncreiex (Tercica, Inc.)。Inerelex 是唯一分离的IGF-I的替代疗法，指明可特异地用于长期治疗患有重度原发性IGF-I缺乏的儿童的生长缺陷。目前，FDA批准的利用IGF-I进行治疗的只有Increlex⑧。然而，目前用于IGF-I给药的标准方案导致IGF-I的高血清浓度，并持续很长的时间段，从而产生不利反应和不想要的副作用。给予IGF-I缺乏儿童如Inerelex 的标准治疗剂量是每两天0. 06至0. 12mg/kg,或对于20kg的儿童每天I. 2至I. 4mg,每天给药两次,持续数年(Inerelex 包装插入物 ;www. inerelex. com/hcp-full-prescribing-information. asp；2010年8月30日录入)。按照说明书，在IGF-1缺乏的儿童中hicrdex 在3小时内导致IGF-I的血浆浓度达到高峰。Inerelex 的给药维持igf-i缺乏的儿童中血浆浓度升高超过12小时，每12小时重复给药，以便实现身高生长。如丨nerelex 说明书中所列，主要的不良反应(在超过40%的患者中观察到)是重度低血糖症，包括低血糖突发和由于igf-i的全身浓度较高造成的意识丧失。相比之下，本发明IGF-I的制剂和给药方法在递送后1、2、3、4、6、8、24或48小时没有导致IGF-I的现有血浆浓度可检测地增加，并且没有观察到低血糖症。如本文所公开的，对于局部递送药物，剂量处于或接近IGF-I的人生理水平，并因而避免了副作用。正常的血清胰岛素样生长因子-I (IGF-I)水平为约250ng/mL。对于IGF-I而言，所需的剂量反应为20ng/mL至500ng/mL。该剂量范围低于全身剂量的至少约10，000倍(500ng/mL对10mg/mL inerelex )，因而避免了不良反应。除了大约低于10，000倍的IGF-I浓度之外，本组合物以单一剂量递送，从该给药的缓释在1、2、3、4、12或24小时内分别小于500、400、300、200、100或50ng/mL。所述组合物还包含生物可吸收/可降解基质，从而形成包含纳米颗粒的缓释制齐U。包含以下任何一种的所述基质可以机械活化内源干细胞，并且还充当细胞生长的基质或支架生物可吸收凝胶、胶原蛋白、羟磷灰石、聚L乳酸、弹性蛋白、微球体、废弃的人皮肤基质、透明质素、插入物或支架。在一个实施方案中，基质形成成分包含透明质素(hyaluronan)。透明质酸(“HA”)是由D-葡糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖胺组成的多糖。其已被用于经皮药物递送。发现HA存在于哺乳动物细胞表面上、脊椎动物结缔组织的基本细胞外物质中、关节滑液、眼睛的玻璃液、人脐带组织和鸡冠中。其是细胞外基质的主要成分。HA在很多组织细胞的机械支持中起到重要作用，诸如皮肤、腱、肌肉和软骨。来自天然聚合物、生物相容物质和生物可降解物质的纳米颗粒可以用于其运输的活性分子的控释和向靶组织的定向。已知并入活性组分的盐形式的透明质酸颗粒，优选聚合物的钠盐或与磁铁颗粒混合，直径小于180nm，无论其性质是亲水的还是疏水的。利用透明质酸纳米颗粒产生用于经皮药物递送方法中的这种纳米颗粒的步骤描述于美国专利第7，371，738 号(Mohapatra et al.)中。同其他纳米颗粒一样，HA作为这些细胞的基因、药物或蛋白载体有几个优点。其免疫原性较低或是非免疫原性的。其分子结构是所有哺乳动物中共有的(HA是所有组织的细胞外基质的主要成分)。HA的衍生物对特定的生物医药应用具有独特的性质，并且没有任何已知的不利影响。本发明组合物中的透明质酸的量可以为2、4、6、8、10、20、30、40、50或60mg/mL。在 优选的实施方案中，透明质酸的浓度范围为4mg/mL至60mg/mL。可选择地，提供支架的基质例如透明质酸可以是用IGF-I浸溃的、包被的或连接的。IGF-I可以包埋/悬浮/包被于透明质酸中。公开了用于恢复面部或身体所选区域中年龄相关组织丧失的处理方法，包括将含有生长因子和作为载体的透明质酸的可注射组合物注射入面部的各区域或人体所选区域的真皮、皮下组织或真皮与皮下组织，以刺激胶原蛋白、弹性蛋白或脂肪细胞产生，进而恢复面部或身体所选区域中年龄相关组织丧失，其公开于美国专利申请系列第20060073178号(VC Giampapa)中。“水凝胶”是当有机聚合物(可以是天然的或合成的)经设置或固化而产生三维开放晶格结构时所形成的物质，所述结构包封水分子或其他溶液以形成凝胶。可以通过聚集、凝固、疏水相互作用、交联或相似的方式而发生固化。优选地，与原位干细胞或孢子样细胞及其子代结合使用的水凝胶形成在应用位置保留细胞的基质，并且随后其他细胞能迁移入该基质。这种基质-细胞组合增强应用位置处的新的细胞生长。水凝胶也是生物相容的(例如，它们对细胞无毒)。本文的“水凝胶-细胞组合物”是指应用领域内的包括水凝胶和干细胞或孢子样细胞或其子代的悬浮液。透明质酸水凝胶可以是原位聚合的、生物可降解的，并且可以充当组织粘合剂、组织隔离物、药物递送系统、细胞培养基质和组织再生的暂时性支架(美国专利第6，630，457号;Aeschlimann et al.)。适用于本发明的可商购获得的透明质素的一个实例是R.LS’!'Y LAN LR(Q-med, Seminariegatan, Uppsala)。或者，其他基质形成组分也可以包含在制剂中。这些组分的实例在下文作了描述。丨,Arrm,.览可吸收聚合物是用于医学应用的可生物降解的聚合物，其由乙交酯、丙交酯和e _己内酯单体组成。(Durect Corp. Cupertino CA)。胶原蛋白是细胞外基质的主要组分，其是向组织提供拉伸强度的纤维蛋白。医学上，胶原蛋白已被广泛用于像真皮假体、创伤修复/外科止血、药物递送、组织工程和像涂层一样的各种应用中，以增加许多医疗器械的生物相容性。重组产生的人胶原蛋白(rhCIII)FG-5030*可获自 Fibrogen, Inc. San Francisco CA)。透明质酸组分的替代物选自羟磷灰石；胶原蛋白；交联的透明质酸；多种不同的MWs HA ;任何合适的基质形成剂；生物可吸收凝胶；基于移植的填充物，例如成纤维细胞或脂肪细胞；基于合成聚合物的填充物，例如聚丙烯酰胺凝胶聚烷基胺凝胶(polyalkylimide gel, Bio- Alcamid )、聚 L-乳酸(Sculptra/ NewFill )、聚甲基丙烯酸甲酯(ArteFill/ ArteCoIl )、轻磷灰石、弹性蛋白、微球体、废弃的天然或合成的人皮肤基质。在本发明的重要方面，组合物的局部递送产生用于局部缓释的贮库(cbpot)。当以低的近生理水平局部给予时，包含IGF-I与HA的组合的本发明的缓释制剂产生出人意料的皮肤组织再生结果。然而，根据目前已批准的给药方案，在数年里每天递送两次IGF-1 (Inerelex )，从而在IGF-I缺陷儿童中达到数千份剂量(0. 06-0. 12mg/kg，每天2次，或对于20kg的儿童每天I. 2-1. 4mg)，从而增加身体生长，本发明人发现，每剂量20、50、 100、200、300、200或500ng的单剂量IGF-1 ((比目前给予儿童的IGF-I剂量低约10，000 倍))与用于缓释的HA(或其他生无可吸收的聚合物，微针状体、支架或插入物)联合，并在小区域(0. 1-lOcm2、优选地0. 25-6cm2的表面积，或2-lOOOcm3的输注量)上局部给药，在注射的局部区域产生了意料不到的令人惊讶的真皮组织再生结果(参见，图1A-1C)。此外，这类制剂通常导致IGF-I在1、2、3、4、12或24小时内的释放分别小于500、400、300、200、100或50nm/mL,这不足以引起诸如高血糖症的副作用。软组织体积和位置的丧失暴露了下面的骨骼轮廓，这是许多老化表现的原因。通过恢复软组织体积和复位恢复活力，因此，实现面部填充物的功能。直接位于真皮之下的皮下脂肪层，相当于皮下组织，是机械和化学保护性的。(Office-Based Cosmetic Procedures and Techniques,ed. Eremia S.CambridgeUniversity Press, 2010.)由于脂肪萎缩而导致的皮下组织体积的丧失显著促成老化过程。这可以通过给予包含IGF-I的本发明的制剂补救，所述给予通过(a)向中层真皮或皮下组织(皮下组织)注射，(b)微针递送，(C)局部乳剂、洗液、或密封敷料(贴剂)以及其他合适递送方式。可以通过局部应用、注射或向受影响的区域应用贴剂和/或插入支架或插入物或利用合成或天然皮肤进行制剂的应用。可以重复该过程以获得所需结果。该产品可以在医务室中用作透明质素注射物在Restylane* (Medicis Aesthetics Inc. , Scottsdale AZ)中使用，或在其他医疗处理期间或之后使用，或用于再生或修复由于老化或损伤或外科手术或疾病或其他机制而受损的器官、组织或细胞。在一实施方案中，以注射的方式将组合物以多份部分剂量注射到中至深层真皮或皮下组织中，用于给药，从而将该组合物以小剂量散布在局部区域上，根据本发明所述局部区域可以是0. 25,0. 5,0. 75,1. 0,2. 0,3. 0,4. 0,5. 0或6. 0cm2。这也可以通过微针、贴剂或局部乳剂利用稀释(高达20，000倍)的IGF-I制剂实现。在几个实施方案中，将所述生长因子和所述生物可吸收聚合物同时或相继应用于邻近位置。这可以通过以下实现注射一种成分，随后在几分钟内(通常不到15分钟，有时不到10分钟或5分钟，优选2分钟内)将第二成分注射到同一注射位置或附近的另一位置(优选2. Ocm以内或更近,优选0. 5 cm以内)。具有证明的治疗价值的本发明的制剂可以经由独立的或被动的经皮药物递送通过皮肤运输。通过皮肤运输分子的主要屏障是角质层(皮肤的最外层)。已经公开了用于通过皮肤和其他表面递送治疗剂和其他物质的装置，所述装置包括相对小的结构阵列，所述相对小的结构有时称为微针或微钉。通常靠着皮肤挤压所述装置以刺穿角质层，使得治疗剂和其他物质能够通过角质层并进入下面的组织。可选择地，可以从添加了穿透角质层后可以溶解的硬化剂的制剂产生针样突出物。制备方法及从金属、硅、二氧化硅、陶瓷和聚合材料制造的有孔或中空微针阵列的使用是本领域内已知的(参见，例如美国专利第6，503，231 号)。所述处理方法可以包括预防性应用和治疗性应用。本发明的组合物和方法适用于数种治疗适应症，包括但不限于脂肪垫再生；毛发再生；具有神经和细胞器的皮肤再生；创伤愈合，包括糖尿病性溃疡；烧伤愈合；皮肤再生和修复；提高皮肤质量或外观；皮肤病症的预防或补救；瘢痕组织的减弱或消除；乳腺皮 肤再生(术后)；美容应用，例如抗老化应用；用于皱纹和其他皮肤瑕疵的真皮再生；促进毛囊生长、神经和其他细胞器再生；脂肪组织再生；皮下脂肪含量；抗擦伤；有或没有抗生素的局部软膏或贴剂；角膜修复；用于HIV或糖尿病或或年龄相关脂肪代谢障碍的局部处理；无瘢痕的愈合或减小瘢痕的再愈合；以及创伤包扎或敷料。本发明优势基于活化内源干细胞，因此避免了与当前干细胞治疗方案相关的很多难题无干细胞分离，不用制备、不用手术或摘取；不用体外增殖或再移植；没有对移植细胞或添加剂的免疫反应；不用选择合适的起始细胞类型；以及不用添加生长因子、饲养细胞、其他试剂的混合物。试剂盒本发明提供了含有用于治疗本文所描述的病理性疾病状况的材料的成品(article of manufacture)和试剂盒。所述成品可以包括带有标签的本文所述药物的容器。合适的容器包括例如，瓶、小玻璃瓶、注射器和试管。所述容器可以由多种材料制成如玻璃或塑料。所述容器容纳具有活性剂的组合物，所述活性剂可有效用于治疗例如特征为皮肤退化或损伤的疾病。容器上的标签表明，所述组合物用于治疗皮肤疾病或损伤，还可以表明给药和监测技术(如上文所描述的那些)的指导。本发明的试剂盒包含上文所述的容器和可以包含药学可接受稀释液的第二容器。其还包含从商业或用户的立场看所需的其他材料，包括其他缓冲液、稀释液、过滤器、针、注射器以及具有使用说明的说明书。本发明还可以用于皮肤再生，包括皮下组织、真皮和表皮。皮肤填充的相似步骤已用于透明质素。
实施例实施例在下文给出本发明实施方案的示例性的仪器、装置、方法及其相关结果，而不希望限制本发明的范围。请注意，为了方便读者，在实施例中使用了标题和副标题，这绝不是限制本发明的范围。此外，本文提出并公开了某些理论，然而无论它们是否对错，它们绝非限制本发明的范围，只要本发明是根据本发明而不考虑任何具体理论或行动计划实施的。实施例I :在人体中再生真皮和皮下组织本实施例列举了本发明的组合物和局部应用所述组合物的方法，其适用于在人体(以及其他哺乳动物)中再生真皮和皮下组织。局部治疗剂量为或接近生理水平，从而避免副作用。
组合物A
成分注期■用浓度
透明质酸_ _40 mg/mL_
IGF-I__200 ng/mL [_]注射用IIl水_至i mL_
在无菌条件不通过混合伴随添加表明活性剂并 低pH值 直到形成纳米颗粒来合并组分。
可注射用透明质酸(例如Juvederm凡或Restylane )
可注射用 IGF-I (例如 Increlex*)_Hg=纳克；mg=毫克;mL=毫升将形成的组合物A分配到多个无菌注射器或小瓶中待用。利用已知的灭菌设备和技术，例如高压灭菌器、对流烘箱或用0. 2微米滤器过滤，将所有材料灭菌。首先，0. 5mL组合物A经注射(或者，通过微穿刺、局部乳剂、贴剂或其他局部递送方法)被局部递送到手背侧的真皮或皮下组织中的多个位置(或者，注射到脸、足、手背侧或前臂、膝盖骨区域，或其中皮下层待再生的任何其他区域)。另一方面，用同样的注射方法注射安慰剂。组合物A的注射方法包括利用尽量细的针头以降低疼痛和伤害，并在手背侧以一定模式注射多个小体积剂量，从而将组合物A散布在需要再生的区域。在注射前和注射后以及在注射2、4和6周后，用卡尺测量两只手的皮下(subcutaneous)(皮下(hypodermal))层的再生。在一些情况下，获得皮肤打孔切片(skinpunch)并随后利用薄切片和苏木精/曙红(H&E)染色制备用于组织学。实施例2 :在小鼠中再生真皮和皮下组织本实施例列举了本发明的组合物和局部应用所述组合物的方法，其适用于在小鼠中再生真皮和皮下组织。组合物B向中至深层真皮或皮下组织的局部递送产生了用于局部缓释的贮库，这再生皮下组织，其证据为小鼠中皮下层的厚度增加，再生的脂肪细胞、感受器和毛囊数量增加(参见附图)。首先，用针头和注射器在背部区域的4个位置(每个位置约0. 2mL)向每只小鼠注射0. 8mL组合物B或合适的对照。在每只小鼠的4个背部位置，用针头和注射器注射4只小鼠中的每一只，每只小鼠总共0. 8mL。在该组合物中，以20mg/mL的浓度给予透明质酸，以500ng/mL给予IGF-I。制备以下的组合物B，用于向中至深层真皮或皮下组织注射。
权利要求
1.用于修复或再生真皮组织的药物组合物，所述组合物包含 (a)用于活化内源干细胞的治疗有效量的生长因子；和 (b)生物可吸收聚合物。
2.如权利要求I所述的组合物，其中所述生长因子是胰岛素样生长因子-I(IGF-I)。
3.如权利要求I或2所述的组合物，其中所述药物组合物是缓释组合物，所述缓释组合物包含足以在修复和再生真皮组织的时间段内活化内源干细胞的量的所述生长因子。
4.如权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述生物可吸收聚合物选自透明质素、羟磷灰石；乙交酯、丙交酯和e -己内酯的聚合物；胶原蛋白；交联的透明质酸；多种不同的丽s HA ;任何合适的基质形成剂；生物可吸收凝胶；基于移植的填充物、成纤维细胞或脂肪细胞；基于合成聚合物的填充物，例如聚丙烯酰胺凝胶(Aquamid )、聚烷基胺凝胶《Bio-Alcamki )、聚L-乳酸(Sculptra/NewRlWD)、聚甲基丙烯酸甲酯(ArteFiii/ArteCoil )、弹性蛋白、微球体、废弃的天然或合成的人皮肤基质。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述生物可吸收聚合物是Lactel 9
6.如权利要求4所述的组合物，其中所述生物可吸收聚合物是重组人胶原蛋白。
7.如权利要求4所述的组合物，其中所述生物可吸收聚合物是透明质素。
8.如权利要求4所述的组合物，其中所述生物可吸收聚合物是废弃的天然或合成的人皮肤基质。
9.如权利要求4所述的组合物，其中所述生物可吸收聚合物是聚L-乳酸。
10.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含纳米颗粒。
11.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含水凝胶。
12.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含插入物或支架。
13.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含真皮贴剂。
14.如权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中所述组合物包含微针阵列。
15.如权利要求1-14中任一项所述的组合物，其中所述生物可吸收聚合物包含用于细胞生长的基质或支架。
16.如权利要求15所述的组合物，其中所述支架是用IGF-I浸溃的、包被的或连接的。
17.如权利要求2-16中任一项所述的组合物，其中所述IGF-I以20至500ng/mL的缓释剂量提供。
18.如权利要求2-16中任一项所述的组合物，其中所述IGF-I以选自以下的缓释剂量提供:20、50、100、200、300、200 或 500ng/mL。
19.如权利要求17-18中任一项所述的组合物，其中所述组合物在1、2、3、4、12或24小时内提供的IGF-I的缓释分别小于500、400、300、200、100或50ng/mL。
20.如权利要求7所述的组合物,其中所述透明质素以4mg/mL至60mg/mL的浓度存在。
21.如权利要求1-18中任一项所述的组合物，其中IGF-I和透明质素(HA)以1:4，000、1:40，000,1:400, 000,1:800, 000 或 1:8，000，000 (w/w)的 IGF-IiHA 比值存在。
22.如权利要求21所述的组合物，其中在0.25至6cm2的表面积或2至IOOOcm3的输注体积中局部给予时，IGF-I和透明质素(HA)以足以引起组织再生的量提供。
23.如权利要求22所述的组合物，其中所述IGF-I以不足以引起副作用、不良反应或低血糖症的血清水平释放。
24.如权利要求17-19中任一项所述的组合物，经配制用于治疗性处理选自以下的疾病或疾病状况脂肪垫再生；毛发再生；具有神经和细胞器的皮肤再生；创伤愈合，包括糖尿病性溃疡；烧伤愈合；皮肤再生和修复；提高皮肤质量或外观；皮肤病症的预防或补救；瘢痕组织的减弱或消除；乳腺皮肤再生(术后)；美容应用、抗老化应用、用于皱纹和其他皮肤瑕疵的真皮再生；促进毛囊生长、神经和其他细胞器再生；脂肪组织再生；皮下脂肪含量；抗擦伤；有或没有抗生素的局部软膏或贴剂；角膜修复；用于HIV或糖尿病或年龄相关脂肪代谢障碍的局部处理；无瘢痕的愈合或减小瘢痕的再愈合；以及创伤包扎或敷料。
25.如权利要求20所述的组合物，其中所述处理是预防性的或治疗性的。
26.如权利要求1-25中任一项所述的组合物，其中所述组合物的局部应用导致生长因子在局部位置的缓释，用于在足以修复和再生真皮细胞的时间段内活化内源干细胞。
27.用于修复或再生皮肤细胞的方法，所述方法包括 (a)提供如权利要求1-26中任一项所述的包含生长因子和生物可吸收聚合物的药物组合物；以及 (b)将所述组合物应用至有需要的位置，持续足以修复和再生所述皮肤细胞的时间段。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述生长因子是IGF-I。
29.如权利要求27-28中任一项所述的方法，其中所述生物可吸收聚合物是透明质素。
30.如权利要求27-29中任一项所述的方法，其中通过选自以下的方法应用所述组合物局部应用、注射、嵌入支架、真皮贴剂和微针阵列。
31.如权利要求27-30中任一项所述的方法，其中将所述组合物应用至包括0.25,0. 5、0.75,1. 0,2. 0,3. 0,4. 0,5. 0 或 6. Ocm2 的区域。
32.如权利要求27所述的方法，其中将所述组合物递送至皮下组织、真皮或表皮。
33.如权利要求27所述的方法，其中将所述生长因子和所述生物可吸收聚合物同时或相继应用于邻近位置。
34.如权利要求33所述的方法，其中在彼此相距15分钟内将所述生长因子和所述生物可吸收聚合物相继应用于邻近位置。
35.如权利要求34所述的方法，其中在彼此相距2分钟内将所述生长因子和所述生物可吸收聚合物相继应用于邻近位置。
36.如权利要求33所述的方法，其中所述邻近位置彼此相距2cm内。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述邻近位置彼此相距0.5cm内。
38.如权利要求33-37中任一项所述的方法，其中在邻近给予所述生物可吸收聚合物的位置的多个位置以多次部分剂量给予所述生长因子。
39.如权利要求27-38中任一项所述的方法，其中以能足以在所述位置局部维持生长因子库的方式应用，用于在足以修复和再生所述皮肤细胞的时间段内缓释。
40.如权利要求39所述的方法，其中在0.25至6cm2的表面积或2至IOOOcm3的输注体积中，局部给予包含选自20、50、100、200、300、200和500ng的单一剂量的IGF-I和透明质素的所述组合物。
41.如权利要求40所述的方法，其中透明质素和IGF-I的给药导致副作用或不良反应降低。
42.如权利要求41所述的方法，其中所述副作用或不良反应是低血糖症。
43.如权利要求27-42中任一项所述的方法，其中所述修复或再生皮肤细胞涉及处理选自以下的疾病或疾病状况脂肪垫再生；毛发再生；具有神经和细胞器的皮肤再生；创伤愈合，包括糖尿病性溃疡；烧伤愈合；皮肤再生和修复；提高皮肤质量或外观；皮肤病症的预防或补救；瘢痕组织的减弱或消除；乳腺皮肤再生(术后)；美容应用、抗老化应用、用于皱纹和其他皮肤瑕疵的真皮再生；促进毛囊生长、神经和其他细胞器再生；脂肪组织再生；皮下脂肪含量；抗擦伤；有或没有抗生素的局部软膏或贴剂；角膜修复；用于HIV或糖尿病或年龄相关脂肪代谢障碍的局部处理；无瘢痕的愈合或减小瘢痕的再愈合；以及创伤包扎或敷料。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述处理是预防性的或治疗性的。
45.用于制备修复或再生皮肤细胞的纳米颗粒药物组合物的方法，所述方法包括 (a)提供用于活化内源干细胞的治疗有效量的生长因子； (b)提供生物可吸收聚合物；以及 (c)在无菌条件下通过混合伴随添加表明活性剂并降低PH值，直到形成纳米颗粒来合并组分。
46.如权利要求46所述的方法，其中所述生长因子是IGF-1，且所述聚合物是透明质素。
全文摘要
提供了在人或其他动物的局部应用区域内诱导组织分化和生长的组合物和方法。提供了用于皮肤修复和再生的包含诸如胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的生物学或药理学活性剂的组合物以及包含IGF-1和诸如透明质素的基质形成成分的缓释纳米颗粒制剂。本发明的纳米颗粒活化给药的局部区域内的内源干细胞，从而产生新的真皮细胞和组织。
文档编号A61P17/02GK102781463SQ201080055562
公开日2012年11月14日 申请日期2010年10月7日 优先权日2009年10月7日
发明者南希·麦则 申请人:戈诺珍公司