用于黄瓜子房离体再生的联合用培养基的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物离体再生技术领域，具体涉及用于黄瓜子房离体再生的联合用培 养基。
【背景技术】
[0002] 黄瓜（Cucumis sativus L.)是世界上的主要蔬菜之一，栽培历史悠久，黄瓜富含 纤维素、多种维生素和矿质元素，有很高的营养及药用价值，深受广大消费者喜爱。由于种 内资源有限，很难通过常规育种方法研制出黄瓜新品种，利用基因工程技术将是今后黄瓜 品种改良的有效手段。因此建立高效的黄瓜离体再生体系，对于进一步的转基因等研宄十 分必要。
[0003] 自1979年佐滕正孝获得首例黄瓜再生植株以来，黄瓜组织培养开始逐渐发展，至 今国内外对黄瓜再生培养的研宄已有一些成功的报道。黄瓜再生分化的主流方法是通过子 叶、子叶节培养，以器官直接发生途径得到再生植株。在器官发生途径中，伴随有少量或没 有愈伤组织，但这些愈伤组织不分化。这种发生途径存在很多问题：①基因型制约大，部分 基因型不能通过该途径分化得到植株；②工作量大：种子灭菌-无菌苗培养-子叶/子叶节 切取-接种子叶/子叶节-诱导分化-再生苗伸长培养-再生苗生根培养，每个步骤缺一 不可；③通过该途径得到的分化苗少，单个子叶节/子叶仅能分化1-2棵完整植株，再生频 率低；④需要耗费大量的种子，如果需要1000个外植体，需要使用500-1000颗饱满、新鲜的 种子。而且受到制种周期和制种成本的制约，成本昂贵。
[0004] 通常，在黄瓜的组织培养中，影响组织培养成功率的因素主要有外植体、培养基、 激素等，高效的离体再生需要多种因素的配合。有一些利用黄瓜子叶、下胚轴、叶片、叶柄等 外植体通过愈伤组织方式再生植株的报道，但普遍存在基因型制约大、再生率低、重复性差 等问题。
[0005] 另外也有利用子房作为外植体的，如：杜胜利等（黄瓜雌核发育及染色体倍性鉴 定与加倍研宄，天津：南开大学，2002)利用黄瓜未授粉子房建立离体再生体系，但该方法 得到再生植株不仅再生频率低，而且是单倍体、二倍体及多倍体的混合，需要对再生植株进 行染色体倍性鉴定来区分，大大增加了工作量。
[0006] -直以来，研宄者都试图利用组织培养的方法方便而高效地得到黄瓜再生植株， 以便满足育种和品种改良的需要。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于提供用于黄瓜子房高效离体再生的联合用培养基。
[0008] 本发明提供了用于黄瓜子房离体再生的联合用培养基，它包括愈伤组织诱导培养 基、愈伤组织增殖及分化培养基、不定苗伸长培养基、生根培养基，
[0009] 所述愈伤组织诱导培养基为：以NB培养基为基本培养基，添加终浓度为30~ 40g/L 的碳源、4 ~7g/L 的凝胶剂、1. 2 ~2. Omg/L 的 TDZ、0. 2 ~0. 5mg/L 的 NAA ;
[0010] 所述愈伤组织增殖及分化培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为 30 ~40g/L 的碳源、4 ~7g/L 的凝胶齐lj、L 5 ~3. Omg/L 的 6-BA、0. 01 ~0· lmg/L 的 NAA ; [0011] 所述不定苗伸长培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30~40g/L 的碳源、5~7g/L的凝胶剂、0. 1~0. 5mg/L的6-BA ;
[0012] 所述生根培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30~40g/L的碳 源、7g/L的凝胶剂、0. 05mg/L的IBA。
[0013] TDZ :噻苯隆，是一种细胞分裂素；
[0014] NAA :萘乙酸，是一种生长素；
[0015] 6-BA :6_苄氨基嘌呤，是一种细胞分裂素；
[0016] IBA :吲噪乙酸，是一种生长素；
[0017] ΑΒΑ:脱落酸；
[0018] NB 培养基组分：KNO3 2830mg/L、（NH4)2SO4 463mg/L、CaCl2 125. 33mg/L、 KH2PCM 400mg/L、MgSO4 90. 37mg/L、H3BO3 3mg/L、MnSO4 · H2010mg/L、ZnSO4 · 7H20 2mg/L、 Na2MoO4 · 2H20 0· 25mg/L、CuSO4 · 5H200. 025mg/L、CoCl2 · 6H20 0· 025mg/L、KI 0· 75mg/L、 FeS04.7H20 27.8mg/L、Na2EDTA.2H20 37.26mg/L、肌醇 100mg/L、烟酸 VB5 lmg/L、维生素 B1 10mg/L、维生素 B6 lmg/L;
[0019] MS 培养基组分：KNO3 1900mg/L、NH4NO3 1650mg/L、KH2PO4 170mg/L、ZnSO4 · 7H20 8. 6mg/L、CaCl2 332. 2mg/L、Na2EDTA · 2H20 37. 26mg/L、ZnSO4 · 7H20 8. 6mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0· 25mg/L、MgSO4 180. 7mg/L、CuSO4 · 5H200. 025mg/L、CoCl2 · 6H20 0· 025mg/L、FeSO4 · 7H20 27. 8mg/L、MnSO4 · H2016. 9mg/L、KI 0· 83mg/L、甘氨酸 2mg/L、肌醇 100mg/L、烟酸 VB5 0· 5mg/L、维生素 B1 0· lmg/L、维生素 B6 0· 5mg/L。
[0020] NB培养基、MS培养基是植物组织培养常用的基本培养基，在实际应用中根据不同 培养阶段和不同材料来源，通常需要在基本培养基中加入植物激素，例如不同种类和含量 的生长素、细胞分裂素等，合适的植物组织培养基组成是植物组织培养成功的基础。
[0021] 进一步地，所述愈伤组织诱导培养基为：以NB培养基为基本培养基，添加终浓度 为 30g/L 的碳源、7g/L 的凝胶剂、L 2 ~2. 0mg/L 的 TDZ、0. 2 ~0· 5mg/L 的 NAA ;
[0022] 所述愈伤组织增殖及分化培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为 30g/L 的碳源、7g/L 的凝胶剂、2. 0 ~3. 0mg/L 的 6-BA、0. 01 ~0. lmg/L 的 NAA ;
[0023] 所述不定苗伸长培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的碳 源、7g/L的凝胶剂、0. 1~0. 5mg/L的6-BA ;
[0024] 所述生根培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的碳源、7g/ L的凝胶剂、0· 05mg/L的IBA。
[0025] 更进一步地，所述愈伤组织诱导培养基为：以NB培养基为基本培养基，添加终浓 度为30g/L的碳源、7g/L的凝胶剂、I. 5mg/L的TDZ、0. 2mg/L的NAA ;
[0026] 所述愈伤组织增殖及分化培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为 30g/L 的碳源、7g/L 的凝胶剂、2. 5mg/L 的 6-BA、0. 01mg/L 的 NAA ;
[0027] 所述不定苗伸长培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的碳 源、7g/L的凝胶剂、0· 5mg/L的6-BA ;
[0028] 所述生根培养基为：以MS培养基为基本培养基，添加终浓度为30g/L的碳源、7g/ L的凝胶剂、0· 05mg/L的IBA。
[0029] 其中，所述碳源为蔗糖；所述凝胶剂为琼脂。
[0030] 本发明提供了上述联合用培养基的制备方法，步骤如下：
[0031] 称取愈伤组织诱导培养基的各组分，混匀溶解后，得愈伤组织诱导培养基；
[0032] 称取愈伤组织增殖及分化培养基的各组分，混匀溶解后，得愈伤组织增殖及分化 培养基；
[0033] 称取不定苗伸长培养基的各组分，混匀溶解后，得不定苗伸长培养基；
[0034] 称取生根培养基的各组分，混匀溶解后，得生根培养基。
[0035] 本发明还提供了上述联合用培养基在黄瓜子房离体再生中的用途。
[0036] 本发明的联合用培养基，可以用于黄瓜子房离体再生，使黄瓜子房通过愈伤组织 再生分化途径得到形态正常的普通二倍体再生植株。
[0037] 本发明的有益效果如下：
[0038] (1)基因型制约较小：对中国黄瓜主要栽培类型华北型和华南型黄瓜均适用；
[0039] (2)可以实现黄瓜的高效离体再生：首先愈伤组织诱导率高，10粒种子可得到200 个子房，可诱导初始愈伤组织60个以上，大大节约种子使用量；其次愈伤组织增殖能力强， 在离体再生过程中再生的愈伤组织可以大量增殖，无限扩繁；而且愈伤组织分化能力强，单 个直径约3cm的愈伤组织可分化再生苗4-6苗，可达到黄瓜再生苗的持续不断的、规模化生 产；
[0040] (3)工作量小：与主流的子叶/子叶节诱导得到再生植株方法相比，减少了从种子 得到无菌苗的培养步骤。
[0041] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0042] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】