一种促进细胞再生的组合物及其制备方法和用途

一种促进细胞再生的组合物及其制备方法和用途
【专利摘要】本发明公开了一种促进细胞再生的组合物及其制备方法和用途。本发明的一种促进细胞再生的组合物是通过以下方法制备得到的：首先于体外培养人体骨髓间叶干细胞，在无血清的DMEM末代培养液中添加人类干细胞生长因子、白血球生长因子及蚬萃取物，使得人体骨髓间叶干细胞可分泌多种人类生长因子以形成人类生长因子组合物，最后再以油包水-水包油（Water–in-Oil-in-Water，W/O/W）的微脂体包埋技术包埋，即得。经包埋而成的组合物可经由表皮涂抹方式，促进表皮组织伤口愈合再生、减少疤痕产生，并可活化毛囊黑色素细胞及刺激毛囊细胞再生。此外亦可经由口服方式，促进脑部受损黑质细胞再生修护与海马回区神经细胞新生，以及刺激骨髓造血干细胞增生。
【专利说明】一种促进细胞再生的组合物及其制备方法和用途

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种促进细胞再生的组合物及其制备方法和用途。具体而言，本发明 涉及一种含有人类生长因子及利用微脂体包埋技术包埋的促进细胞再生的组合物及其制 备方法。

【背景技术】
[0002] 皮肤不但具有调节人体的体温、水分等功能，也是人体免疫系统的第一道防线，一 旦失去表皮的保护就极容易遭受外来病原感染。而经历烧伤、溃疡、发炎、放射线治疗、手术 以及糖尿病的患者，长时间处于皮肤缺损及异常的情形下，容易造成感染而对身体产生莫 大的伤害。而人体内部组织器官因老化、疾病所造成的凋亡、功能衰竭等，尤其是脑部退化 性疾病或急性损伤造成的脑部伤害，影响人类的健康甚巨，因此组织细胞伤口愈合及再生 修护机制是一项重要的医学研究领域。
[0003] 目前用于治疗伤口及促进愈合的药物多为杀菌剂、抗生素、皮质类固醇激素等， 对于伤口愈合皆各有其缺点，且伤口愈合率差。因而发展出人工皮肤或其它皮肤替代物、 细胞治疗等方法。相关研究指出，在皮肤的伤口愈合过程中，有多种生长因子扮演了重要 的角色。皮肤受伤后，血小板会释放出其中所含的多种生长因子及细胞激素，包括表皮生 长因子（epidermal growth factor，EGF)、喊性纤维母细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF)、血小板衍化生长因子（platelet-derived growth factor， FOGF)、人类胰岛素生长因子（insulin-like growth factor, IGF-1)、血管内皮生长因子 (vascular endothelial growth factor,VEGF)、转化生长因子 a (transforming growth factor-α , TGF-α )、转化生长因子 β (transforming growth factor-β , TGF-β )、介白 素（interleukin，IL)、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF)、激 活素（activin)、肿瘤坏死因子a (tumour necrosis factor, TNF-α)等。这些生长因子 可吸引嗜中性白血球（neutrophil)和巨噬细胞（macrophage)朝向伤口处聚集，以清除受 伤组织、细胞并吞噬感染物，亦可活化附近的纤维母细胞及角质细胞以及诱导周围血管进 行血管新生作用。
[0004] 另一方面，伤口部位的纤维母细胞会在某些生长因子，特别是I3DGF及TGF-β的影 响下，转型为肌纤维母细胞。这些肌纤维母细胞会大量表达α肌动蛋白（α-actin)以利收 缩伤口，并合成胶原蛋白纤维。这些沉积于伤口处的胶原蛋白纤维的排列方式受到肌纤维 母细胞收缩的影响而与原本正常组织的胶原蛋白纤维列方式不同，因而形成疤痕组织。在 受伤后第四星期开始一直到约六个月间，疤痕组织中的胶原蛋白会重新排列，而使得疤痕 组织的外形及机能接近原先的正常组织。近来有研究指出，TGF-β于伤口愈合的调节上， 不仅对巨噬细胞与纤维细胞有趋化性，并可刺激第I型及第II型胶原蛋白的mRNA的转录 作用，以促进伤口中胶原蛋白的聚积，以提高伤口的愈合率。故TGF-β经证实可产生无疤 的上皮再生作用，并加速愈合因放射线照射所形成的皮肤伤口。研究指出，在哺乳动物的胚 胎时期可分泌大量TGF-β，然而，成体哺乳动物的表皮于受伤时，所分泌的TGF-β的含量 却非常少，是以出生后的伤口，易有肌纤维细胞收缩而造成的疤痕。
[0005] 由于生长因子对于伤口的再生修复机制扮演了重要的角色，各种如G-CSF、EGF、 bFGF、IGF-I、PDGF-BB及VEGF生长因子皆已广泛运用于医药及美容保养产业。而针对G-CSF 而言，早已在医疗上治疗骨髓移植用途多年，而目前在临床上也有注射到栓塞型中风病人 身上，可以帮助脑部瘀血区域的复原。此病人若接受一般复健治疗半年到一年，能恢复部分 肌力，但不一定能站得起来，但是在中风3天内连续5天注射G-CSF后，3个月内可站可走， 甚至有人能跑能跳，恢复相当迅速。因为G-CSF将骨髓中的干细胞逼到周边血管，中风处会 有蛋白质表达，吸引干细胞到患处修补，分化成脑神经、血管等细胞，因此有助中风患者迅 速恢复。此外，G-CSF可保护神经，使脑神经不致因中风缺血而坏死，并有抗发炎作用，可抑 制中风处的发炎组织及细胞。但G-CSF注射治疗仅对栓塞型脑中风有效，出血型中风仍以 血块清除手术为主。而目前的科学报告中证实，SCF与G-CSF组合应用于阿兹海默症与栓 塞型脑中风动物实验，效果远较单独使用G-CSF为更好。因此多种生长因子复方做为不同 用途的医药应用，将会具有其市场价值。
[0006] 然而，目前在利用基因工程以大量制备上述生长因子时，需将表达上述人类生长 因子的基因个别插入载体内以大量繁殖，并进一步纯化其表达的人类生长因子。虽然此种 方法可降低成本，但其缺点在于纯化后的蛋白质的纯度不一，且可能含有内毒素或其他不 良的蛋白质，而影响疗效或并发过敏反应；此外，一个质体要同时插入三种以上的生长因子 蛋白质基因，且皆有表达活性，难度非常高，若欲同时操作多个选殖质体既费时又费工；再 者，以原核生物或真菌类来表达人类生长因子蛋白质时，大部分所产生的蛋白质的活性会 降低。
[0007] 另一方面，干细胞治疗则是利用人类成体干细胞，例如位于骨髓、表皮、肠道等部 位的干细胞来治疗各种疾病。由人类骨髓分离的间叶干细胞（human mesenchymal stem cell，hMSC)是一种成体干细胞，其具有多种分化潜能，在不同的培养环境下可分化成骨骼、 软骨、肌肉、皮肤等组织，又有易于分离、培养与体外增生速度快的特性，已有多项研究证实 其可强化组织细胞的再生愈合机制。然而，以干细胞注射或手术移植入人体，需要长期的临 床试验以评估异体干细胞移植是否产生免疫排斥反应。再者，干细胞治疗耗费的医疗资源 以及金钱亦高于一般疗法。
[0008] 因此，需要提出一种方法，可以结合基因工程以及干细胞疗法的优点并改进其缺 点。亦即，需要一种方法可同时提供三种以上由人类细胞表达的生长因子蛋白质，同时可通 过一般外用或口服的途径施用该生长因子，以促进组织细胞的再生修护。


【发明内容】

[0009] 鉴于上述问题，本发明提出了一种含有人类生长因子，并利用微脂体包埋技术包 埋的促进细胞再生的组合物及其制备方法。
[0010] 因此，本发明一方面提供一种用于制备人类生长因子的组合物，其包含 人类干细胞生长因子（stem cell factor, SCF)、白血球生长因子（granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)以及蚬萃取物，其中，优选的，该人类干细胞生长因 子、白血球生长因子及蚬萃取物的浓度皆为5?100ng/ml。 toon] 所述的"蚬萃取物"又叫"蚬精粉"，可购买自市场，同时也可通过以下方法制备得 至IJ :将吐沙后的生蚬放入沸水中煮10-60分钟，随后将蚬肉经冷冻干燥制成冻干粉末进行 萃取。将蚬冻干粉末溶于其约10倍体积的乙醇中搅拌萃取，之后离心取出上清液，过滤后 减压浓缩得到一干燥物，最后将该干燥物溶于70%乙醇溶液即得。
[0012] 另一方面，本发明提供一种用于制备人类生长因子的方法。首先，在初代培养液 中进行人体骨髓间叶干细胞的初代培养。接着，去除初代培养液中的悬浮细胞并选择贴 壁细胞，并以继代培养液进行继代培养。其后，选择贴壁细胞并以前述组合物制备的末代 培养液进行末代培养，上述末代培养液是一种无血清DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium)培养液，并且添加微生物基因工程产制的人类干细胞生长因子（SCF)、白血球生长 因子（G-CSF)以及蚬萃取物，使得人体骨髓间叶干细胞可表达多种人类生长因子组合物于 第四日的末代培养分泌液中，最后再以油包水-水包油（Water - in-〇il-in-Water，W/0/W) 的微脂体包埋技术包埋。
[0013] 特殊配方的末代培养液可使得贴壁骨髓干细胞能够分泌多种人类生长因子至末 代培养分泌液中，以形成含有多种人类生长因子的溶液。亦即，上述多种人类生长因子溶液 至少包含人类骨髓干细胞所分泌的多种人类生长因子的组合物，即为本发明所称的"人类 生长因子组合物"。上述的组合物包含至少三种以上选自下列群组的生长因子：SCF、EGF、 VEGF-D、VEGF、bFGF、中性粒细胞活化肽78(ENA-78)、生长调节致癌基因（Growth-regulated oncogene，GR0)、干扰素 γ (丨11丨61€61'〇11-丫，]^^-丫）、16?-1、血管生成素（41^;[08611；[11)、单 核球趋化性蛋白质 I (MCP-1)、FOGF-BB、胎盘生长因子（placenta growth factor, PIGF)、 TGF-βΙ、金属蛋白酶组织抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP-1; TIMP-2)、瘦体素（leptin)、血小板生长因子（thrombopoietin，Tpo)、趋化因子（RANTES)、 IL-6、IL-8等21种细胞激素。
[0014] 利用本发明实施例的制备人类生长因子的方法，可轻易得到一种人类生长因子组 合物，其中所含的人类生长因子的种类、活性、安全性皆高于利用基因工程所产生者。且根 据本发明实施例的方法所得到的生长因子组合物至少包含多种和细胞再生相关的生长因 子，可有效提升细胞再生的能力。
[0015] 此外，根据本发明实施例的特殊配方的末代培养液，不但可在人类生长因子组合 物制备过程中提供额外的养分给人体骨髓间叶干细胞，亦有助于提升本发明实施例的用以 促进细胞再生的组合物中所含的人类生长因子组合物促进细胞再生的能力。
[0016] 又一方面，本发明提供一种用以促进细胞再生的组合物，上述组合物至少包含本 发明的人类生长因子组合物、营养成分、乳化剂溶液、油相液体，以及增加安定性与耐胃酸 的胶体。上述营养成分包含根据本发明实施例制备人类生长因子组合物时，所用的营养液 的一部份。上述乳化剂溶液以及油相液体可将人类骨髓干细胞制造的复合组合物以油包 水-水包油（Water - in-〇il-in-Water，W/0/W)的方式包埋成一种安定性高的微脂体包埋 物。不仅以表皮涂抹方式，利用磷脂层膜易渗透吸收的特性，将抗皱的赋活因子运送至肌肤 底层释放，从肌肤表皮层稳固干细胞环境，达到防护干细胞增植的功效，有效抗皱与避免老 化，促进细胞再生；亦可以口服方式，通过消化道到血液循环中，仍然具有修护表皮外伤的 生物活性。
[0017] 根据本发明的具体实施例，该促进细胞再生的组合物所包埋成的微脂体包埋物可 应用于实验动物的人造伤口。涂抹于人造伤口上，可观察到该组合物可促进伤口愈合，减缓 伤口发炎及感染的机率，并减少疤痕的产生。此外，该组合物涂抹于受试者的皮肤上，可观 察到皱纹明显减少，青春痘数量变少，并减缓痘疤的产生，因此可知该组合物可运用于制备 促进伤口愈合，减缓伤口发炎及感染的医药组合物或辅助物。
[0018] 本发明的一具体实施例为灰发动物的应用，使用本发明的灰发动物模式，仿真人 类因老化而造成毛囊黑色素细胞死亡，所造成的白发征状。涂抹本发明的促进细胞再生的 组合物，可明显观察到实验动物的白发征状明显改善，说明此组合物可应用于制备活化毛 囊黑色素细胞，改善因衰老而造成的白发的医药组合物或辅助物。
[0019] 本发明的一具体实施例为秃发动物的应用，使用本发明的秃发动物模式，仿真人 类的秃发模式。涂抹本发明的促进细胞再生的组合物，可明显观察到实验动物的秃发征 状明显改善，而应用于受试者的头皮上，可明显观察到受试者的发量明显增加，毛囊密度提 高，发色变深等现象，说明本发明的组合物可应用于制备刺激毛囊生长，活化毛囊黑色素细 胞的医药组合物或辅助物。
[0020] 本发明的一具体实施例为延缓脑部神经退化的应用，帕金森是目前老龄常见的 神经退化性疾病之一，因此本发明以帕金森动物试验为例，通过神经毒物1-甲基-4-酚 基 -1，2, 3, 6-四氢噪呤（l-methyl-4-phenyl-l，2, 3, 6-tetrahydropyridine，MPTP)造成小 鼠产生帕金森氏症的动物征状，再给予小鼠口服本发明的促进细胞再生的组合物。由结果 显示，帕金森氏症模式小鼠口服本发明的组合物后，可明显减缓大脑黑质区多巴胺神经细 胞的退化，增加脑内多巴胺的分泌，并促进大脑海马回神经细胞的增生，说明本发明的组合 物可应用于制备延缓脑部退化性神经疾病的医药组合物或辅助物。
[0021] 本发明的一具体实施例为促进血液造血干细胞的应用，给予受试者口服本发明的 促进细胞再生的组合物后，可明显增加血液中造血干细胞数量，说明本发明的组合物可应 用于制备促进血液造血干细胞的医药组合物或辅助物。
[0022] 本发明的该等及其他方面，可通过以下的较佳具体实施例的描述以及图式，得以 更为明晰；即便其中可能会有变化或修饰，但皆不背离本发明所揭露的新颖观念的精神及 范畴。

【专利附图】

【附图说明】
[0023] 出于阐释本发明的目的，在图式中显示当前较佳的实施例。然而，应理解的是，本 发明不限于图式中的较佳实施例。
[0024] 图1显示人类生长因子抗体微阵图，其中（A)为人类生长因子抗体微阵芯片所列 举的人类生长因子种类；(B)为在含有干细胞生长因子（SCF)及白血球生长因子（G-CSF)的 末代培养液中所分泌的人类生长因子；（C)为在含有干细胞生长因子（SCF)、白血球生长因 子（G-CSF)及蚬萃取物的末代培养液中所分泌的人类生长因子。
[0025] 图2显示在ELISA试验中利用标准品求得本发明的生长因子的浓度，其中（A)显 示干细胞生长因子的浓度及（B)显示血管内皮生长因子的浓度。
[0026] 图3提供本发明制备的微脂体的结构示意图，其中（A)显示光学显微镜下的微脂 体结构；(B)显示荧光显微镜下的微脂体结构；及（C)显示微脂体制备时与油相及水相液体 的相关不意图。
[0027] 图4显示口服包埋白血球生长因子（G-SCF)的微脂体对增加血液中白血球数目的 效果。
[0028] 图5显示小鼠皮肤伤口愈合的情形，其中使用本发明所提供的促进细胞再生的组 合物时，㈧为第〇日的伤口影像，⑶为第3日的伤口影像；未使用本发明所提供的促进 细胞再生的组合物时，（C)为第0日的伤口影像，（D)为第3日的伤口影像。
[0029] 图6显示小鼠伤口愈合率的比较图。
[0030] 图7显示小鼠毛囊黑色素细胞活化的情形，其中（A)、（C)、（E)分别为阳性对照组 在第9、14、21天的情形，及出）、（0)、的分别为试验组在第9、14、21天的情形。
[0031] 图8显示小鼠毛囊细胞增生的情形，其中（A)、（C)、（E)、（G)分别为阳性对照组在 第0、7、14、21天的情形，及⑶、（D)、（F)、（H)分别为试验组在第0、7、14、21天的情形。
[0032] 图9显示皮肤伤口愈合与淡化细纹的情形，其中（A)、（C)、（E)、（G)为涂抹本发明 所提供的促进细胞再生的组合物前的皮肤状况，及（B)、（D)、（F)、（H)为涂抹30日后的皮 肤状况。
[0033] 图10显示人体头部毛囊细胞增生及活化黑色素细胞的情形，其中（A)、（C)、（E)为 涂抹本发明所提供的促进细胞再生的组合物前的头发状况，及（B)、（D)、（F)为涂抹后的头 发状况。
[0034] 图11显示小鼠黑质区多巴胺神经细胞退化的情形，其中㈧为正常小鼠；(B)为 施以MPTP注射的小鼠；及（C)为施以MPTP注射且给予本发明所提供的促进细胞再生的组 合物治疗的小鼠。
[0035] 图12显示小鼠海马回区新生神经细胞增生的情形，其中㈧为正常小鼠；(B)为 施以MPTP注射的小鼠；及（C)为施以MPTP注射且给予本发明所提供的促进细胞再生的组 合物治疗的小鼠。
[0036] 图13显示慢性帕金森小鼠脑部多巴胺浓度的比较图。
[0037] 图14显示急性帕金森小鼠脑部多巴胺浓度的比较图。
[0038] 图15显示利用流式细胞仪分析服用本发明所提供的促进细胞再生的组合物，影 响人类血液中造血干细胞增生的情形，其中（A)、（C)、（E)服用前的情形，及（B)、（D)、（F) 为服用后的情形。

【具体实施方式】
[0039] 在下列具体实施例中，本发明将被更特定地描述。值得注意的是，下列所述本发明 的具体实施例仅是用于说明，并非为详列或限缩本发明范围至所揭露的特定形式。
[0040] 实施例（一）
[0041] 制备人类生长因子的方法
[0042] 该方法包含下列步骤：
[0043] (a)在初代培养液中进行人体骨髓间叶干细胞的初代培养；
[0044] (b)去除初代培养液中的悬浮细胞并选择贴壁细胞，并以继代培养液进行继代培 养；以及
[0045] (C)选择继代培养液中的贴壁细胞，并以末代培养液进行末代培养。上述末代培养 液为无血清培养液且含有人类生长因子和/或蚬萃取物，以使得贴壁细胞能够分泌多种生 长因子至末代培养液中，以形成人类生长因子溶液。
[0046] 在上述步骤中，是将健康人体骨髓间叶干细胞(购自The National Disease Research Interchange，NDRI，USA)以含 10% 胎牛血清的 DMEM 培养液（Dulbecco，s modified eagle medium，购自 Gibico，Cat.No. 12100-061)作为初代培养液，进行初代培 养3日。接着去除初代培养液中的悬浮细胞并选择贴壁细胞，再以含10%胎牛血清的DMEM 培养液作为继代培养液，进行继代培养3日。继代培养之后，以末代培养液进行末代培养3 日，上述末代培养液为一种无血清培养液，且含有约5?100ng/ml SCF及G-CSF，和/或蚬 萃取物5?100ng/ml。
[0047] 蚬萃取物的制备方式为：将吐沙后的生蚬放入沸水中煮10-60分钟，随后将蚬肉 经冷冻干燥制成冻干粉末进行萃取。将蚬冻干粉末溶于其约10倍体积的乙醇中搅拌萃取， 之后离心取出上清液，过滤后减压浓缩得到一干燥物，最后将该干燥物溶于70%乙醇溶液 即得。
[0048] 在末代培养步骤中，末代培养液中的贴壁细胞可分泌复数种人类生长因子至末代 培养液中，以形成一种人类生长因子组合物。该人类生长因子组合物至少包含三种下列生 长因子：SCF、EGF、VEGF-D、VEGF、bFGF、ENA-78、GR0、IFN-γ、IGF-UAngiogenin (血管生成 素）、MCP-l、PDGF-BB、PIGF、TGF-Pl、HMP-l、HMP-2、kptin、Tpo、RANTES、IL-6#&IL-8。
[0049] 继代培养步骤可视需求重复至多20次。且可在继代培养步骤后将经培养的人体 骨髓间叶干细胞冷冻保存，且此一冷冻保存的人体骨髓间叶干细胞经解冻后可再度进行继 代培养，但解冻后的人体骨髓间叶干细胞的继代培养次数最多只可重复3次。
[0050] 在本发明的一具体实施例中，可于末代培养液中加入营养液，上述营养液包含至 少一种氨基酸和/或至少一种维生素。上述的氨基酸可为丙氨酸、精氨酸、天门冬酰氨酸、 天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、麸氨酸、甘氨酸、组氨酸、异白氨酸、白氨酸、离氨酸、甲硫氨 酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸或缬氨酸，且所选的每种氨基酸的浓 度约为5?100mg/L。上述的维生素可为维生素 A、维生素 B1、维生素 B2、维生素 B3、维生素 B5、维生素 B6、维生素 B12、维生素 C、维生素 D2、维生素 E、维生素 H、维生素 K3、氯化胆碱、叶 酸、或肌醇，且所选的每种维生素的浓度约为0. 1?l〇mg/L。
[0051] 在本发明一实施例中，将利用本发明实施例制备的人类生长因子组合物进行透 析，以进一步纯化该人类生长因子组合物。根据本发明的一具体实施例，利用一 3. 5KD的透 析膜（购自 Pierce，SnakeSkinTMPleated Dialysis Tubing，3,500MWC0)来进行上述人类 生长因子组合物的透析，透析可持续进行约3?5日。通过透析步骤，可实质上移除人类生 长因子溶液中分子量小于3, 500道尔顿（Dalton，D)的物质，因而达到纯化人类生长因子溶 液的目的。
[0052] 由于根据本发明实施例欲制备的人类生长因子组合物中所含的人类生长因子的 分子量皆远大于3. 5KD，例如EGF的分子量约为6KD而TGF- β 3的分子量更高达250KD，故 根据本发明实施例的方法所产生的人类生长因子大部分会留存于透析膜之中。最后，收集 透析膜中留存的溶液，其至少包含三种人类生长因子。此种利用本发明实施例的方法所制 备的人类生长因子组成的特征在于包含至少三种可侦测的生长因子(侦测方法将于下文 详述），上述生长因子可以是 SCF、EGF、VEGF-D、VEGF、bFGF、ENA-78、GR0、IFN-γ、IGF-1、 Angiogenin、MCP-1、PDGF-BB、PIGF、TGF-β 1、--ΜΡ-1、--ΜΡ-2、1 印tin、Tpo、RANTES、IL-6 以及IL-8。
[0053] 实施例（二）
[0054] 人类生长因子组合物的定性分析
[0055] 以人类细胞介素抗体微阵芯片（RayBio TMHuman Cytokine Antibody Arrays) 检测该透析液中的生长因子组成，检测结果如图I的人类生长因子抗体微阵图所示。由图 I(A)可以发现，根据本发明实施例制备的人类生长因子组成所含的人类生长因子种类及 其侦测极限（limit of detection, LoD)如下：EGF (侦测极限lpg/ml)、bFGF (侦测极限 10000pg/ml)、IGF-I (侦测极限 10pg/ml)、PDGF (侦测极限 1000pg/ml)、VEGF (侦测极限 100pg/ml)、TGF-β 1 (侦测极限 100pg/ml)、Angiogenin (侦测极限 10pg/ml)、IFN-γ (侦 测极限 l〇〇pg/ml)、RANTES (侦测极限 2000pg/ml)、Thrombopoietin (侦测极限 100pg/ml)、 --ΜΡ (侦测极限 lpg/ml)、GRO (侦测极限 100pg/ml)、IL-6 (侦测极限 lpg/ml)、以及 IL-8 (侦测极限lpg/ml)。
[0056] 本说明书中，"侦测极限"一词是指利用本发明实施例的方法进行人类生长因子定 性分析时，所采用的检测方法的最低侦测浓度。换句话说，待测样本中所含的特定人类生长 因子的浓度，必须至少等同于或大于检测方法所用的侦测极限，才可能被检测出来，在此种 情形下，亦可将该特定人类生长因子称为"可侦测的"人类生长因子。而额外添加蚬萃取物 于末代培养液中，可观察到各种生长因子有显著的增加（图1(B)、图I(C)及表一)。
[0057] 表一生长因子于微阵芯片中浓度的相对倍数
[0058]

【权利要求】
1. 一种用于制备人类生长因子的组合物，其包含人类干细胞生长因子、白血球生长因 子及蚬萃取物。
2. 如权利要求1所述的组合物，其中该人类生长因子具有可侦测的浓度。
3. 如权利要求1所述的组合物，其中该人类干细胞生长因子、白血球生长因子及蚬萃 取物的浓度皆为5?100ng/ml。
4. 一种制备人类生长因子的方法，该方法包含： 进行初代培养，其是在初代培养液中培养人体骨髓间叶干细胞； 取出该初代培养液中的贴壁细胞，并以继代培养液以进行继代培养；以及 取出该继代培养液中的贴壁细胞，并以末代培养液进行末代培养，让该末代培养液中 的贴壁细胞分泌多种生长因子至该末代培养液中以形成人类生长因子溶液，其中该末代培 养液为无血清培养液且包含如权利要求1至3项中任一所述的组合物。
5. 如权利要求4所述的方法，其中该初代培养液以及该继代培养液为含胎牛血清的 DMHM培养液。
6. 如权利要求4所述的方法，其中该初代培养的步骤进行3日。
7. 如权利要求4所述的方法，其中该继代培养的步骤进行3日。
8. 如权利要求4所述的方法，至少更包含重复进行该继代培养的步骤，其中该重复次 数最多20次。
9. 如权利要求4所述的方法，其中该末代培养的步骤进行3日。
10. 如权利要求4所述的方法，更包含取出该人类生长因子溶液进行透析，以纯化该人 类生长因子溶液。
11. 如权利要求10所述的方法，其中利用3500道尔顿的透析膜进行透析，且该透析步 骤进行3-5日。
12. -种人类生长因子组合物，其是利用如权利要求4至11项中任一项所述的方法 制备，其特征在于包含至少三种可侦测的生长因子，其中该生长因子是选自由SCF、EGF、 VEGF-D、VEGF、bFGF、ENA-78、GRO、IFN- y、IGF-1、Angiogenin、MCP-1、PDGF-BB、PIGF、 丁6卩-0 1、！1]\^-1、11]\^-2、1印衍11、了？〇、狀阶^5、11-6以及比-8所组成的群组。
13. -种用以促进细胞再生的组合物，其包含：如权利要求12所述的人类生长因子组 合物；一营养成分，其包含至少一氨基酸和/或至少一维生素，其中该氨基酸选自由丙氨 酸、精氨酸、天门冬酰氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、胱氨酸、麸氨酸、甘氨酸、组氨酸、异白氨 酸、白氨酸、离氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸及缬氨酸 所组成的群组，该维生素选自由维生素 A、维生素 B1、维生素 B2、维生素 B3、维生素 B5、维生 素 B6、维生素 B12、维生素 C、维生素 D2、维生素 E、维生素 H、维生素 K3、氯化胆碱、叶酸及肌 醇所组成的群组；一乳化剂溶液；以及一油相液体，其中该乳化剂溶液及该油相液体将该 人类生长因子组合物及该营养成分以油包水、水包油的方式包埋成一微脂体包埋物，其中 该微脂体包埋物是与一水溶性胶体混合，以增加该微脂体包埋物的安定性。
14. 如权利要求13所述的组合物，其是用于通过涂抹方式促进皮肤伤口愈合。
15. 如权利要求13所述的组合物，其是用于通过涂抹方式促进毛囊细胞生长。
16. 如权利要求13所述的组合物，其是用于通过涂抹方式活化黑色素细胞。
17. 如权利要求13所述的组合物，其是用于通过口服方式延缓脑部退化性神经疾病。
18. 如权利要求13所述的组合物，其是用于通过口服方式刺激造血干细胞。
19. 权利要求13-18任一项所述的组合物在制备治疗秃头药物中的用途。
20. 如权利要求13-18任一项所述的组合物在制备治疗灰发药物中的用途。
【文档编号】A61P17/14GK104436168SQ201310415430
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2013年9月12日 优先权日:2013年9月12日
【发明者】林佳静 申请人:林佳静