皮肤更新生长因子及其于皮肤保养的用途及含其的保养品的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种皮肤更新生长因子，该皮肤更新生长因子是由猪全血分离出血小板后，通过活化剂激活血小板，然后经过离心以及冷冻干燥而得之；本发明更提供一种前述的皮肤更新生长因子促进皮肤细胞再生的用途；本发明再提供一种前述的皮肤更新生长因子抑制黑色素分泌的用途；本发明再提供一种用于皮肤保养的保养品，其包含前述皮肤更新生长因子。本发明的皮肤更新生长因子可长时间保存，且由猪血获得利于大规模制造，相当具有经济效益，并可用于保养皮肤的保养品，由此促进皮肤细胞再生以及抑制黑色素分泌。
【专利说明】皮肤更新生长因子及其于皮肤保养的用途及含其的保养品
【技术领域】
[0001]一种皮肤更新生长因子，尤指一种由猪全血分离血小板，并通过活化剂激活血小板以及离心及冷冻干燥的方法而得的皮肤更新生长因子。
【背景技术】
[0002]血小板(platelets)于医学上应用已有很长的一段时间，尤其是血小板所衍生的生长因子，可应用于组织工程以及伤口愈合。其中血小板丰富血浆(platelet-richplasma, P RP)是由聚集血小板(aggregated platelets)释放血小板颗粒(plateletgranules)所得的富含生长因子(growth factors,GFs)浓缩液,其生长因子包括血小板衍生生长因子(platelet-derivedgrow factor, F1DGF)、转化生长因子(transforming growthfactor β , TGF-β )、基本纤维母细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)、血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor, VEGF)、类膜岛素生长因子 1、II (insulin-like growthfactor-1, II，IGF-1, II)以及与类胰岛素生长因子1、II结合的类胰岛素生长因子结合蛋白(IGF binding protein, IGFBPs),并且上述生长因子具有促进伤口愈合、修补组织以及血管新生等特性，血小板丰富血衆被广泛应用矫型外科学(orthopaedics)、运动相关伤害(sport-relatedinjuries)、肿瘤生物学(cancer biology)以及皮肤学(dermatology)等。
[0003]自体血小板丰富血浆虽可避免传染性疾病的缺点，但自体可萃取的血小板有限，且萃取所得的血小板为液状，以及血小板生命周期短(约为7天至10天)，而使得保存血小板丰富血浆相当困难，并使得血小板丰富血浆应用于大面积的伤口以及保养品大规模量产相当有限，而且现有技术的血小板丰富血浆仅应用于伤口愈合以及修补组织。
[0004]现有技术的血小板丰`富血浆保存不易、且源于自体所萃取而得的血小板丰富血浆相当有限。因此，研发出一种可长时间维持活性的血小板丰富血浆，并使其应用于保养品，仍是本领域亟待解决的问题之一。
【发明内容】
[0005]为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种由猪全血(porcine wholeblood)分离血小板，并通过活化剂激活血小板，以及离心及冷冻干燥的方法而得的皮肤更新生长因子(skin renewal growth factors, SRGF),该皮肤更新生长因子可长时间维持活性，并将该皮肤更新生长因子应用于皮肤保养等相关领域。
[0006]为达上述目的，本发明提供一种皮肤更新生长因子，该皮肤更新生长因子是由猪全血分离出血小板后，通过活化剂激活血小板，然后经过离心以及冷冻干燥而获得该皮肤更新生长因子，其中该皮肤更新生长因子具有促进皮肤细胞再生以及抑制黑色素分泌的能力。
[0007]依据本发明，“活化剂激活血小板”如此处所指是利用活化剂与与血小板共培育，而与血小板反应，释放出适当细胞激素。优选地，是通过将活化剂与血小板置于一容器中，摇晃该容器使得血小板细胞质中的细胞器的阿法颗粒(a granule)被活化而释放皮肤更新生长因子。
[0008]在上述皮肤更新生长因子中，优选地，所述活化剂为牛凝血酶以及氯化钙。
[0009]在上述皮肤更新生长因子中，更优选地，所述牛凝血酶在所述血小板中的浓度为20U/mL至30U/mL ;氯化钙在所述血小板中的质量浓度为7.5%至15%。
[0010]依据本发明，“冷冻干燥”如此处所指是将皮肤更新生长因子经过瞬间降温使其凝固，并于缓慢回复至室温环境下连续抽真空并析出水分所制得。
[0011]在上述皮肤更新生长因子中，优选地，所述冷冻干燥是经过将一诸如经培育的培养基的样品瞬间降温凝固呈固态；缓慢上升温度，使得样品内水气升华至空气中；连续低压令水分从样品中升华；提升温度，使样品回温过程中避免水分再次渗入样品；维持环境温度，使样品适应环境温度时的湿度，达到平衡状态，以取得所欲的皮肤更新生长因子。
[0012]依据本发明，优选地，“适应环境温度时的湿度，达到平衡状态”如此处所指是样品于平均湿度为60%至70%的无菌室中，封装并冷藏于-20°C以下，即可长时间保持皮肤更新生长因子的品质。
[0013]依据本发明，所述的皮肤更新生长因子的品质包括皮肤更新生长因子可以促进皮肤细胞再生以及抑制黑色素分泌的能力。
[0014]在上述皮肤更新生长因子中，更优选地，所述冷冻干燥包含以下7个区段:区段I是于零下20°C保持5小时；区段2至区段4是于32小时内，缓慢地将温度由零下10°C提升4°C;区段5是于10°C保持16小时，并连续抽真空；区段6是于25°C保持15小时；区段7是维持于27°C—段时间，以达到平衡状态；该达到平衡的时间可无限延长至经冷冻干燥的含有皮肤更新生长因子的样品被使用之前。
[0015]本发明更提供一种皮肤更新生长因子促进皮肤细胞再生的用途，其包含:
[0016]齐备一如前述的皮肤更新生长因子，其通过促使皮肤细胞的纤维母细胞数量增多、促进胶原蛋白表现、增加蛋白多糖(proteoglycan)合成以及抑制角质细胞分化以达到促进皮肤细胞再生。换而言之，本发明提供一种皮肤更新生长因子在具有促进皮肤细胞再生作用的保养品中的应用。
[0017]依据本发明，“促进皮肤细胞再生”如此处所指意指能够促使皮肤细胞的纤维母细胞数量增多、促进胶原蛋白表现、增加蛋白多糖合成以及抑制角质细胞分化，根据本发明的具体实施方案，促进皮肤细胞再生可透过活体外细胞增生倍率、蛋白多糖合成增加以及角质细胞相关基因表现予以测定而得。
[0018]在上述方法中，优选地，所述抑制角质细胞分化是指抑制包括，但不限于基膜素V (IamininV)及角蛋白10 (keratin 10)的基因表现。
[0019]在上述方法中，优选地，以总重量为基础，所述促进皮肤细胞再生的皮肤更新生长因子的质量浓度为0.06wt%至0.3wt%。
[0020]本发明再提供一种皮肤更新生长因子抑制黑色素分泌的用途，其包含:
[0021]齐备一如前述的皮肤更新生长因子，其通过抑制皮肤的黑色素细胞增殖以及抑制黑色素生成的相关基因或蛋白酶表现以达到抑制黑色素分泌。换而言之，本发明提供一种皮肤更新生长因子在具有抑制黑色素分泌作用的保养品中的应用。
[0022]依据本发明，“抑制黑色素分泌”如此处所指意指能够抑制皮肤的黑色素细胞增殖以及抑制黑色素生成的相关基因或蛋白酶表现，根据本发明的具体实施方案，其可抑制PAX3 (paired box 3)基因表现、抑制小眼畸形相关转录因子(microphthalmia-associtated transcription factor, MITF)基因表现、抑制酪胺酸酶(tyrosinase)表现以及抑制黑色素分泌，并可透过活体外细胞抑制增生倍率以及抑制上述相关基因表现予以测定而得。
[0023]在上述方法中，优选地，以总重量为基础，所述抑制黑色素分泌的皮肤更新生长因子的质量浓度为0.06wt%至0.3wt%。
[0024]本发明再提供一种用于皮肤保养的保养品，其包含如前述的皮肤更新生长因子。
[0025]本发明通过猪全血分离出血小板后，通过活化剂激活血小板，并经过离心以及冷冻干燥所得的皮肤更新生长因子经证实具有促进皮肤细胞再生以及抑制黑色素分泌的功效；相较于现有技术的血小板丰富血浆，本发明经特定浓度的活化剂激活血小板后，可释放较多皮肤更新生长因子，且该皮肤更新生长因子经由冷冻干燥可避免冷冻或\及解冻过程中形成冰晶而破坏生长因子的结构以及可降低污染的机率，而使得本发明的皮肤更新生长因子可长时间保存并具有较高的活性，且由猪血获得较利于较大规模制造，相当具有经济效益，是以能作为一种新颖的、用于皮肤保养的保养品，由此来促进皮肤细胞再生以及抑制黑色素分泌。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为实施例的皮肤更新生长因子于不同活化剂比例的活性表现图。
[0027]图2为实施例的皮肤更新生长因子以冷冻干燥处理的区段所需时间与温度的曲线图。
[0028]图3为实施例的经冷冻干燥处理的皮肤更新生长因子粉末与溶液状态的皮肤更新生长因子的活性曲线图。
[0029]图4为实施例的经冷冻干燥处理的皮肤更新生长因子再经研磨处理与研磨前的活性比较的柱状图。
[0030]图5为实施例的经冷冻干燥处理的皮肤更新生长因子于零下20°C保存4年后，与新鲜制备的皮肤更新生长因子的活性比较的柱状图。
[0031]图6A为实施例的含有0.3wt%皮肤更新生长因子与对照组对于促进人类皮肤纤维母细胞增殖的柱状图。
[0032]图6B为实施例的对照组的人类皮肤纤维母细胞状态图。
[0033]图6C为实施例的含有0.3wt%皮肤更新生长因子的人类皮肤纤维母细胞状态图。
[0034]图7为实施例的含有0.3wt%皮肤更新生长因子与对照组对于促进人类皮肤纤维母细胞的胶原蛋白次型的增加倍率的柱状图。
[0035]图8A为实施例的含有0.06wt%、0.15wt%以及0.3wt%皮肤更新生长因子与对照组对于促进人类皮肤纤维母细胞的蛋白多糖合成的柱状图。
[0036]图8B为实施例的以艾尔逊蓝染色评估含有0.06wt%、0.15wt%&0.3wt%皮肤更新生长因子的培养液对于促进蛋白多糖合成影响的人类皮肤纤维母细胞染色图。
[0037]图9A为实施例的含有0.3wt%皮肤更新生长因子与对照组对于抑制人类表皮角质细胞增殖的柱状图。[0038]图9B为实施例的对照组的人类表皮角质细胞状态图。
[0039]图9C为实施例的含有0.3wt%皮肤更新生长因子的人类表皮角质细胞状态图。
[0040]图10为实施例的含有0.06wt%、0.15wt%以及0.3wt%皮肤更新生长因子与对照组对于抑制人类表皮角质细胞的基膜素V的柱状图。
[0041]图11为实施例的含有0.06wt%、0.15wt%以及0.3wt%皮肤更新生长因子与对照组对于抑制人类表皮角质细胞的角蛋白10的柱状图。
[0042]图12A为实施例的含有0.3wt%皮肤更新生长因子与对照组对于抑制人类黑色素细胞生长的柱状图。
[0043]图12B为实施例的对照组的人类黑色素细胞状态图。
[0044]图12C为实施例的含有0.3wt%皮肤更新生长因子的人类黑色素细胞状态图。
[0045]图13为实施例的含有0.06wt%、0.15wt%以及0.3wt%皮肤更新生长因子与对照组对于抑制人类黑色素细胞的PAX3基因表现的柱状图。
[0046]图14为实施例的含有0.06wt%、0.15wt%以及0.3wt%皮肤更新生长因子与对照组对于抑制人类黑色素细胞的MITF基因表现的柱状图。
[0047]图15为实施例的含有0.06wt%、0.15wt%以及0.3wt%皮肤更新生长因子与对照组对于抑制人类黑色素细胞的酪胺酸酶表现的柱状图。
[0048]图16为实施例的含有0.3wt%皮肤更新生长因子与对照组对于抑制人类黑色素细胞分泌黑色素的柱状图。
【具体实施方式】
[0049]本发明将由下列的实施例作为进一步说明，这些实施例并不限制本发明前面所揭示的内容。所述领域的一般技术人员，可以做些许的改良与修饰，但不脱离本发明的范畴。
[0050]制备例
[0051]材料与方法[0052]1.化学药品与试剂
[0053]牛凝血酶(bovine thrombin)购自美国SIGMA公司；氯化钙(CaCl2)购自美国SIGMA 公司；酵素免疫分析套组(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)购自德国Quantikine公司；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)购自美国GIBCO公司；青霉素-链霉素(penicillin-streptomycin)购自美国GIBCO公司；杜氏改良英格尔培养基(Dulbecco' s Modified Eagle' s medium, DMEM)购自美国 GIBCO 公司；M154 基础培养液(M154basal medium)购自美国Cascade Biologies公司；含有人类黑色素细胞生长添加剂(human melanocyte growth supplement-2, HMGS-2)的 254 培养液(254medium)购自美国Cascade Biologies公司；3_(4, 5_ 二四基噻唑_2) _2, 5_ 二苯基四氮唑溴盐{3_[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT}购自德国 Roche公司；Trizol?'试剂以及SuperSuMple III 反转录酶(reverse transcriptase)购自美国Invitrogen公司；Taq脱氧核糖核酸聚合酶(Taq DNA polymerase)购自美国Invitrogen公司；洋菜胶(agarose gel)购自美国AMRESC0公司。
[0054]2.细胞培养
[0055]成人人类皮肤纤维母细胞(adult human dermal fibroblast, hDFa)购自美国CascadeBiologics公司，细胞以每毫升5X IO5密度培养于含有体积浓度10v/v%胎牛血清、1￥八％的靑霉素-链霉素的DMEM培养液，并于37°C含有体积浓度5%二氧化碳的培养箱培养。
[0056]人类表皮角质细胞(humandermal keratinocyte, HEK)购自美国 CascadeBiologies公司，细胞以每毫升5 X IO5密度培养于含有体积浓度10v/v%胎牛血清、lv/v%的靑霉素-链霉素的M154基础培养液，并于37°C含有体积浓度5%二氧化碳的培养箱培养。
[0057]人类黑色素细胞(humanepidermal melanocytes)购自美国 Cascade Biologies公司，细胞以每毫升5X IO5密度培养于含有体积浓度10V/V%胎牛血清、1V/V%的靑霉素-链霉素以及含有人类黑色素细胞生长添加剂的254培养液，并于37°C含有体积浓度5 %二氧化碳的培养箱培养。
[0058]3.方法
[0059](I)制备皮肤更新生长因子(skin renewal growth factors, SRGF)
[0060]将猪全血收集后，通过MCS+血衆收集系统(MCS+plasma collection system)(购自美国Haemonetics公司)分离血小板。
[0061]表1以不同浓度、种类活化剂所使用的浓度
[0062]
【权利要求】
1.一种皮肤更新生长因子，该皮肤更新生长因子是由猪全血分离出血小板后，通过活化剂激活血小板，然后经过离心以及冷冻干燥而获得该皮肤更新生长因子，其中该皮肤更新生长因子具有促进细胞再生以及抑制黑色素分泌的能力。
2.如权利要求1所述的皮肤更新生长因子，其中，所述活化剂为牛凝血酶以及氯化钙。
3.如权利要求2所述的皮肤更新生长因子，其中，所述牛凝血酶的浓度为20U/mL至30U/mL ;所述氯化钙的质量浓度为7.5%至15%。
4.一种用于保养皮肤的保养品，其包含如权利要求1至3任一项所述的皮肤更新生长因子。
5.一种皮肤更新生长因子促进皮肤细胞再生的用途，其包含: 齐备一如权利要求1至3任一项所述的皮肤更新生长因子，其通过促使皮肤细胞的纤维母细胞数量增多、促进胶原蛋白表现、增加蛋白多糖合成以及抑制角质细胞分化以达到促进皮肤细胞再生。
6.如权利要求5所述的用途，其中，所述抑制角质细胞分化是指抑制基膜素V及角蛋白10的基因表现。
7.如权利要求5或6所述的用途，其中，以总重量为基础，所述皮肤更新生长因子的质量浓度为0.06%至0.3%0
8.一种皮肤更新生长因子抑制黑色素分泌的用途，其包含: 齐备一如权利要求1至3任一项所述的皮肤更新生长因子，其通过抑制皮肤的黑色素细胞增殖以及抑制黑色素生成 的相关基因或蛋白酶表现以达到抑制黑色素分泌。
9.如权利要求8所述的用途，其中，所述黑色素生成的相关基因或蛋白酶为PAX3基因、小眼畸形相关转录因子基因以及酪胺酸酶。
10.如权利要求8或9所述的用途，其中，以总重量为基础，所述皮肤更新生长因子的质量浓度为0.06%至0.3%。
【文档编号】A61Q19/00GK103524613SQ201210229686
【公开日】2014年1月22日 申请日期:2012年7月4日 优先权日:2012年7月4日
【发明者】罗文政, 陈韦弘, 林佐文 申请人:晶光源生技股份有限公司