专利名称：转化生长因子-β1(TGF-β1)抑制剂肽治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊的应用的制作方法
技术领域：
本发明大体上涉及预防和/或治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊的产品、组合物和方法。本发明的方法包括使用转化生长因子-β l(TGF-i3 I)抑制剂肽或编码所述肽的多核 苷酸。
背景技术：
眼表面，S卩，角膜，由分层的上皮和底层结缔组织覆盖。其作为眼结构的外层，阻止化学组分、微生物侵袭或机械性创伤的外界刺激的干扰。角膜无血管、透明且正常弯曲，这对于适当的光线折射是必要的，因此，对视力也是必要的。角膜浑浊是正常清晰的眼睛前表面的模糊，且其发展被认为是属于角膜先天伤口愈合机制的副作用。一旦组织被损伤，间充质细胞和渗透的炎症细胞(即，巨噬细胞)分泌各种生长因子/细胞因子，包括转化生长因子-TGF-β 1(TGF-β I), TGF-β I是最重要的致纤维生长因子之一。尽管TGF-β I对于维持组织完整是至关重要的，但它也促进了愈合上皮下组织的纤维增生反应。角膜组织修复所涉及的主要成分与皮肤修复所涉及的主要成分极其相似；分层的上皮和位于其下面的含有间充质细胞(角膜成纤维细胞)的胶原基质。Ι、ΙΙΙ和V型胶原纤维和纤维之间的蛋白聚糖的有序的细胞外基质结构对于维持角膜透明度和常规形状是必要的。角膜纤维化导致透明度损失、组织收缩及疤痕转变，因此导致角膜浑浊。目前，治疗角膜浑浊广泛使用局部消炎类固醇药物(诸如地塞米松、氟米龙或强的松龙)和抗代谢物(诸如丝裂霉素C)。然而这些药物可能伴有严重的并发症。使用局部类固醇可能导致眼压升高，导致视神经损伤和视野改变。使用丝裂霉素C是因为其能阻止某些类型细胞的增殖或增长，例如那些在眼内产生疤痕或浑浊的细胞；然而，在某些环境下丝裂霉素C具有非常强大且潜在的毒性。使用丝裂霉素C后，据报道会出现一些眼相关并发症，包括但不限于结膜充血(眼睛发红)、永久干细胞缺乏症、需要角膜移植的角膜或巩膜变薄或穿孔、角膜代偿失调、白内障、视网膜血管闭塞。TGF-β I已成为角膜和其他组织浑浊和疤痕的重要调节剂。事实上，在成人组织中TGF- β I和TGF- β 2表达增加。类似地，添加外源性TGF- β I治疗角膜伤口引起夸张的疤痕和纤维化。使用不同方法的TGF-β I抑制作用已证明可成功地应用于体内或体外，诸如通过使用特异性中和抗体[参见，例如，Jester等，Cornea 1997; 16 (2) : 177-87 ;Moller-Pedersen 等，Current Eye Research 1998 Jul. ; 17 (7) : 736-47; Biihren 等，Invest.Ophthalmol. Vis. Sci. 2009February; 50 (2) : 634-43]、阻断 TGF-β I 表达的编码 TGF-β I 的基因的反义寡核苷酸[Cordeiro等，Gene Therapy 2003;10:59-71]。尽管用抗TGF-βΙ抗体抑制TGF-β I加速了角膜的上皮重新形成，同时通过角膜细胞减少了基质的细胞再增殖[Carrington 等，Invest. Ophthalmol Vis Sci 2006; 47:1886-1894],但是抗体的使用提供了这种细胞因子(TGF-βΙ)的全部和特定阻断，然而血液中外源性免疫球蛋白的存在和TGF-β I的系统性阻断所产生的影响，促进了某些副作用。此外，随着时间的推移，免疫球蛋白的稳定性不能立即控制这种细胞因子的活性。反义寡核苷酸在基因表达水平抑制TGF-β I的产生，事实上，其可导致所有这种细胞因子参与的过程的重要的反调节。为防止屈光手术后的浑浊，已提出其他TGF-β I抑制剂，诸如甘露糖-6-磷酸酯[Angunawela & Marshall, J. Cataract. Refract. Surg. 2010; 36:121-126] 然而，甘露糖-6-磷酸酯在加速分裂的厚皮移植供区愈合的第二阶段临床试验中失败了，未提供临床抗肝纤维化疗效的证据。US 6，399，107公开了使用粘多糖合成的抑制剂治疗角膜浑浊。US2004/0001821公开了使用纤溶酶原激活剂防止激光视力矫正手术后的角膜和上皮下浑浊，但未报道角膜浑浊改善的临床数据。尽管有不同的方法预防和/或治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊，然而，本领域仍需 要开发新的治疗方法减少角膜纤维化和/或角膜浑浊，最小化或避免副作用。现在已发现TGF- β I抑制剂肽能够用于预防和/或治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊。之前已公开了使用所述肽(W0 2005/019244)和免疫调节剂(W0 2007/048857)治疗肝纤维化。
发明内容
本发明涉及预防和/或治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊的产品、组合物和方法。该组合物包含至少一种TGF-β I抑制剂肽或编码所述肽的多核苷酸。因此，一方面，本发明涉及选自由如下物质组成的组中的产品a)TGF-β I抑制剂肽、或其功能相等的衍生物、变体、类似物或片段，b)包含如a)中限定的肽的融合蛋白，c)编码如a)中限定的肽或如b)中限定的融合蛋白的多核苷酸，d)包含如c)中限定的多核苷酸的载体，e)包含如a)中限定的肽、如b)中限定的融合蛋白、如c)中限定的多核苷酸和/或如d)中限定的载体的细胞，以及f)a)、b)、c)、d)和/或e)的一种或多种的组合，所述产品用于预防和/或治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊。可选地，本发明涉及一种产品在制备用于预防和/或治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊的药物组合物中的用途，所述产品选自由如下物质组成的组中a)TGF-β I抑制剂肽、或其功能相等的衍生物、变体、类似物或片段，b)包含如a)中限定的肽的融合蛋白，c)编码如a)中限定的肽或如b)中限定的融合蛋白的多核苷酸，d)包含如c)中限定的多核苷酸的载体，e)包含如a)中限定的肽、如b)中限定的融合蛋白、如c)中限定的多核苷酸和/或如d)中限定的载体的细胞，以及f) a)、b)、c)、d)和/或e)的一种或多种的组合，另一方面，本发明涉及用于预防和/或治疗角膜纤维化或角膜浑浊的方法，其包含向需要治疗的受试者施用治疗有效量的选自由如下物质组成的组中的产品
a)TGF-β I抑制剂肽、或其功能相等的衍生物、变体、类似物或片段，b)包含如a)中限定的肽的融合蛋白，c)编码如a)中限定的肽或如b)中限定的融合蛋白的多核苷酸，d)包含如c)中限定的多核苷酸的载体，e)包含如a)中限定的肽、如b)中限定的融合蛋白、如c)中限定的多核苷酸和/或如d)中限定的载体的细胞，以及
f) a)、b)、c)、d)和/或e)的一种或多种的组合。另一方面，本发明涉及用于眼部的药物组合物，其包含治疗有效量的选自由如下物质组成的组中的产品a)TGF-β I抑制剂肽、或其功能相等的衍生物、变体、类似物或片段，b)包含如a)中限定的肽的融合蛋白，c)编码如a)中限定的肽或如b)中限定的融合蛋白的多核苷酸，d)包含如c)中限定的多核苷酸的载体，e)包含如a)中限定的肽、如b)中限定的融合蛋白、如c)中限定的多核苷酸和/或如d)中限定的载体的细胞，以及f) a)、b)、c)、d)和/或e)的一种或多种的组合；以及所述化合物的药学上可接受的载体，其中所述药学上可接受的载体是适用于眼部施用的载体。在一个特定的实施方式中，所述产品是组合物的形式，其中所述组合物包含所述产品a)至e)的一种或多种。在另一个特定的实施方式中，所述组合物还包含药学上可接受的载体和/或治疗性化合物。在一个特定的实施方式中，所述TGF β I抑制剂肽选自由pl44(SEQ ID NO :6)、P17 (SEQ ID NO 17)及其组合构成的肽的组中。
图I示出了 TGF- β I抑制剂肽(ρ17和ρ144)对于角膜浑浊的效果的进展。图2示出了肽ρ17和ρ144对于上皮闭合的效果的进展。图3示出了应用ρ17后角膜浑浊的发展，其中*#ρ〈0· 001 ;对照组vs. pl7在第五周高度显著；tvv丨)<0.00 i :笫五周的对照组vs.第O天的对照组高度显著；以及###p<0. 001 ;第五周的治疗组vs.第O天的治疗组高度显著。图4示出了应用pl7后上皮闭合的发展，其中**p〈0. 01 ;对照组vs. pl7在第五周非常显著；tt p<0.0卜第五周的对照组vs.第O天的对照组非常显著；以及###p<0. 001 ;第五周的治疗组vs.第O天的治疗组高度显著。图5示出了应用pl44后角膜浑浊的发展，其中*#ρ〈0· 001 ;对照组vs. pl7在第五周高度显著；*ρ〈0· 05 ;对照组vs. pl7在第二周和第四周显著；ν- -t ρ· .().()() I :第五周的对照组vs.第O天的对照组高度显著；以及
###p<0. 001 ;第五周的治疗组vs.第O天的治疗组高度显著。图6示出了应用pl44后上皮闭合的发展，其中*#ρ〈0· 001 ;对照组vs. pl7在第五周高度显著；*ρ〈0· 05 ;对照组vs. pl7在第四周显著；ff p<0.01 ;第五周的对照组vs.第O天的对照组非常显著；以及###p<0. 001 ;第五周的治疗组vs.第O天的治疗组高度显著。图7示出了 pl7和pl44对于p-Smad 2、总Smad2和β_激动蛋白(加样对照)的免疫印迹的结果。图8示出了在兔角膜成纤维细胞中对于Smad2/3的免疫印迹的结果。 图9示出了在TGF-β与ρ17和ρ144治疗的兔角膜成纤维细胞中对于Smad7的免疫印迹的结果。图10示出了在无TGF-β I治疗的和用3ng/ml与5ng/ml的TGF-β I治疗后的兔角膜成纤维细胞上关于p_Smad2的免疫荧光研究的结果。图11示出了在无TGF-β I与pl7或pl44治疗的和用不同浓度的这些物质治疗后的兔角膜成纤维细胞上关于p_Smad2的免疫荧光研究的结果。
具体实施例方式本发明人已公开向角膜纤维化的实验动物模型施用TGF-β I抑制剂肽，所述角膜纤维化由化学物(NaOH)损伤角膜后导致，所述施用意外地减少了所述动物中的角膜纤维化和/或角膜浑浊，从而提供了一种预防和/或治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊的新的治
疗窗口。因此，本发明涉及一种用于治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊的TGF- β I抑制剂肽，然而本发明还考虑使用多种不同的TGF-β I抑制剂肽用于治疗所述疾病的可能性。同样地，本领域技术人员将理解TGF-β I抑制剂肽可以多种形式存在，例如，肽、融合蛋白、多核苷酸、载体、细胞等。因此，在第一发明方面，本发明涉及一种产品，下文中被称为本发明的产品，其选自由如下物质组成的组中，a)TGF-β I抑制剂肽、或其功能相等的衍生物、变体、类似物或片段，b)包含如a)中限定的肽的融合蛋白，c)编码如a)中限定的肽或如b)中限定的融合蛋白的多核苷酸，d)包含如c)中限定的多核苷酸的载体，e)包含如a)中限定的肽、如b)中限定的融合蛋白、如c)中限定的多核苷酸和/或如d)中限定的载体的细胞，以及f) a)、b)、c)、d)和/或e)的一种或多种的组合，所述产品用于预防和/或治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊。可选地，本发明涉及一种产品(本发明的产品)在用于预防和/或治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊的药物组合物的制造中的用途，所述产品选自由如下物质组成的组中，a) TGF- β I抑制剂肽，或其功能相等的衍生物、变体、类似物或片段，b)包含如a)中限定的肽的融合蛋白，
c)编码如a)中限定的肽或如b)中限定的融合蛋白的多核苷酸，d)包含如c)中限定的多核苷酸的载体，e)包含如a)中限定的肽、如b)中限定的融合蛋白、如c)中限定的多核苷酸和/或如d)中限定的载体的细胞，以及f) a)、b)、c)、d)和/或e)的一种或多种的组合。a)本发明的TGF- β I抑制剂肽根据本发明，在一个特定的实施方式中，本发明的产品是TGF-β I抑制剂肽(以下被称为本发明的TGF-β I)、或其功能相等的衍生物、变体、类似物或片段。在本发明中，术语“TGF-β I抑制剂肽”渉及能够抑制TGF-β I生物活性的肽；TGF-β I生物活性的抑制例如可以通过与TGF-β I的活性形式相互作用。在特定的实施方 式中，TGF-β I抑制剂肽直接与TGF-β I结合并抑制所述TGF-β I的生物活性。TGF-β I是属于结构相关的调节蛋白(细胞因子)超家族的糖蛋白，是哺乳动物中所述的三种异构体(TGF β 1、2和3)之一。最高丰度的异构体是TGF β 1，其由25kDa的同源二聚体组成，所述同源二聚体由通过二硫键连接的两个亚基组成。几个动物种类的所述生长因子的序列是众所周知的。Derynck等已公开人TGF-β I的氨基酸序列[DerynckK 等，“Human transforming growth factor-beta complementary DNA sequence andexpression in normal and transformed cells，，· Nature 316 (6030)，701-705(1985)]。人类序列的GenBank登录号对应于TGF_0 I和TGF-β I前体NP_000651 (蛋白质)和NM_000660 (cDNA)，TGF- β 2 和 TGF- β 2 前体ΝΡ_003229 (蛋白质)和 NM_003238 (cDNA)及TGF- β 3 和 TGF- β 3 前体ΝΡ_003230 (蛋白质)和 NlLOO3239 (cDNA)。登录号 GenBank AAL27646. 2示出了 TGF β I的其他氨基酸序列。TGF β I是在进化上具有高度保守序列的分子。尽管最初由在大鼠成纤维细胞中诱导独立于增殖和形态变化的粘结的能力定义TGF TGF-β 1，但随后的调查表明TGF-β I是广泛的细胞类型的增殖的普遍抑制剂。分子由多种细胞类型在细胞分化的所有阶段在不同组织中产生。其具有许多的生物效应，且产生与发展、生理和免疫应答有关的强力的且非常频繁的相反的效应。许多疾病或病理变化与TGF-β I的过度表达或抑制表达相关，例如，与器官或组织功能丧失相关的纤维化，或手术或美容并发症，例如肝纤维化或肺间质纤维化。TGF-β I抑制剂肽分子本质上是肽，意味着其包含通过酰胺键(即，肽键)相连接的α-氨基酸。术语“肽”不限于短氨基酸链；其可以包括长度超过50个氨基酸的链。因此，本文中使用的术语肽一般包括多肽和蛋白质。TGF-β I抑制剂肽的说明性、非限制的例子包括TO 00/31135或US 7，528，226 (表2-6)以及WO 2005/019244中公开的肽，它们的全部内容通过引用纳入本文中。在一个特定的实施方式中，TGF-β I抑制剂肽优选为具有与下文表I所示的SEQID NO 1-23的氨基酸序列中的任何一个氨基酸序列至少70%、有利地至少80%、优选至少90%、更优选至少95%序列同一性的肽。表ITGF-β I抑制剂肽
权利要求
1.一种用于预防和/或治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊的产品，其选自由以下物质组成的组中 a)TGF-βI抑制剂肽、或其功能相等的衍生物、变体、类似物或片段， b)包含如a)中限定的肽的融合蛋白， c)编码如a)中限定的肽或如b)中限定的融合蛋白的多核苷酸， d)包含如c)中限定的多核苷酸的载体， e)包含如a)中限定的肽、如b)中限定的融合蛋白、如c)中限定的多核苷酸和/或如d)中限定的载体的细胞，以及 f)a)、b)、c)、d)和/或e)的一种或多种的组合。
2.根据权利要求I所述的产品，其以包含一种或多种所述产品a)到e)的组合物的形式存在。
3.根据权利要求I或2所述的产品，其中所述TGF-βI抑制剂肽是与SEQ ID NO 1-23所不的任一氨基酸序列具有至少70%序列同一'丨生的肽。
4.根据权利要求I或2所述的产品，其中所述TGF-βI抑制剂肽是这样的一个肽或其功能相等的衍生物、变体、类似物或片段或盐，所述肽选自其氨基酸序列如SEQ ID NO:K SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ IDNO: 7,SEQ ID NO: 8,SEQ ID NO: 9,SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO: IUSEQ ID NO: 12、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22、或 SEQ IDNO: 23所示的肽组。
5.根据权利要求4所述的产品，其中所述片段包含SEQID NO: USEQ ID NO: 2, SEQID NO: 3、SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5、SEQ ID NO: 6、SEQ ID NO: 7、SEQ ID NO: 8、SEQ ID NO: 9,SEQ ID NO: 10,SEQ ID NO: IUSEQ ID NO: 12,SEQ ID NO: 13,SEQ IDNO 14、SEQ ID NO 15、SEQ ID NO 16、SEQ ID NO 17、SEQ ID NO 18、SEQ ID NO 19、SEQ ID NO: 20、SEQ ID NO: 21、SEQ ID NO: 22、或 SEQ ID NO: 23 的 5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个连续氨基酸残基，并维持了抑制TGF-β I的能力。
6.根据权利要求I或2所述的产品，其中所述TGF-βI抑制剂肽选自肽pl44 (SEQID NO: 6)、pl7 (SEQ ID NO :17)、包含 SEQ ID NO 6 或 SEQ ID NO :17 的 9、10、11、12、13或14个连续氨基酸残基的片段、或它们的药学上可接受的盐，其中所述片段维持了抑制TGF-β I的能力。
7.根据权利要求I或2所述的产品，其中所述TGFβ 抑制剂肽选自pl44 (SEQ IDNO:6)、pl7 (SEQ ID NO :17)及其组合。
8.一种产品在制备用于预防和/或治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊的药物组合物中的应用，所述产品选自以下物质组成的组中 a)TGF-βI抑制剂肽、或其功能相等的衍生物、变体、类似物或片段， b)包含如a)中限定的肽的融合蛋白， c)编码如a)中限定的肽或如b)中限定的融合蛋白的多核苷酸， d)包含如c)中限定的多核苷酸的载体， e)包含如a)中限定的肽、如b)中限定的融合蛋白、如c)中限定的多核苷酸和/或如d)中限定的载体的细胞，以及 f) a)、b)、c)、d)和/或e)的一种或多种的组合。
9.一种预防和/或治疗角膜纤维化或角膜浑浊的方法，其包含向需要治疗的受试者施用治疗有效量的选自以下物质组成的组中的产品 a)TGF-βI抑制剂肽、或其功能相等的衍生物、变体、类似物或片段， b)包含如a)中限定的肽的融合蛋白， c)编码如a)中限定的肽或如b)中限定的融合蛋白的多核苷酸， d)包含如c)中限定的多核苷酸的载体， e)包含如a)中限定的肽、如b)中限定的融合蛋白、如c)中限定的多核苷酸和/或如d)中限定的载体的细胞，以及 f)a)、b)、c)、d)和/或e)的一种或多种的组合。
10.一种用于眼部的药物组合物，其包含治疗有效量的选自以下物质组成的组中的产品 a)TGF-βI抑制剂肽、或其功能相等的衍生物、变体、类似物或片段， b)包含如a)中限定的肽的融合蛋白， c)编码如a)中限定的肽或如b)中限定的融合蛋白的多核苷酸， d)包含如c)中限定的多核苷酸的载体， e)包含如a)中限定的肽、如b)中限定的融合蛋白、如c)中限定的多核苷酸和/或如d)中限定的载体的细胞，以及 f)a)、b)、c)、d)和/或e)的一种或多种的组合； 以及所述化合物的药学上可接受的载体，其中所述药学上可接受的载体是适用于眼部施用的载体。
全文摘要
本发明涉及转化生长因子-β1(TGF-β1)抑制剂肽或编码所述肽的多核苷酸在预防和/或治疗角膜纤维化和/或角膜浑浊中的应用。
文档编号A61P27/02GK102791283SQ201180010487
公开日2012年11月21日 申请日期2011年2月21日 优先权日2010年2月22日
发明者哈维尔·多特德拉斯埃雷里亚斯, 米格尔何塞·马尔多纳多洛佩斯 申请人:西马生物医学计划公司, 迪格纳生物技术公司