专利名称：用作转化生长因子β蛋白质的溶解赋形剂的肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及溶解蛋白质的赋形剂和试剂。特别地，本发明涉及在多种生物化学的条件下保持或增加蛋白质溶解度的组合物和方法。本发明也涉及用于使已经从溶液沉淀出来的蛋白质再溶解的方法和组合物。在特别的方面中，本发明涉及保持或增加属于转化生长因子-β(TGF-β)超家族的蛋白质溶解度的组合物和方法。
背景技术：
TGF-β超家族由存在于脊椎动物和无脊椎动物中的25种以上不同的信号蛋白质组成。TGF-β超家族的蛋白质成员影响各种各样的生物进程，包括细胞生长、细胞生长抑制、组织修复、细胞分化、细胞程序性死亡、背腹侧胚胎体轴的形成，和胞外基质成分的分泌(Ebendal等.1998，Journal of Neuroscience 51139)。因此，TGF-β超家族的成员提供用于开发药物激动剂和拮抗剂的有吸引力的标靶，从而可用来治疗受一个或多个超家族成员活性影响的多种人类疾病或病症。例如，TGF-β超家族成员的拮抗剂和激动剂已经实际应用于组织修复和再生的范围，以及多潜能干细胞分化成为优选谱系的细胞或组织的范围内。此外，TGF-β超家族成员也提供用于基因治疗的标靶。已经描述了该家族许多成员的克隆和表达。(参见例如美国专利号4,877,864；5,108,922；5,013,649；5,116,738；5,106,748；5,187,076；5,141,905；5,688,678；5,661,007；5,637,480；5,639,638；5,658,882；和5,635,372)。
在TGF-β超家族的成员中有骨形态发生蛋白质(BMP)。起初确定BMPs为软骨和骨形成的调节子。随后的工作已经表明BMPs，类似于其他的TGF-β超家族成员，在许多不同的生物进程，包括胚胎发生和多种器官和组织的形态发生中起作用。另外，BMPs在几个不同的细胞类型，例如造血细胞、上皮细胞、间充质细胞、和神经元细胞的生长、分化和趋化性中发挥作用(Reddi，1998，Nature Biotechnology 16247；Ebendal，同上)。
BMPs，类似于TGF-β超家族的其他成员，在不同的动物种属之间是高度保守的。例如成人BMP-2，与小鼠和大鼠的BMP-2是完全同源的。BMP-2的生物活性形式是由二硫化物连接羧基端114个氨基酸结构域组成的同源二聚体。BMP-2通过结合由异低聚物组成的细胞表面受体而对靶细胞施加其影响。该受体是2个丝氨酸/苏氨酸激酶受体的复合物(参见Ebendal，同上；Reddi同上)。
已经克隆出BMP-2的人同系物，Wozney，1989，Prog.GrowthFactor Res.1(4)267。重组的人BMP-2可以是表达全长BMP-2中第266-396位或第283-396位氨基酸的片段。这些片段形成同源二聚体和异二聚体而产生6种不同的同工型。6种二聚的同工型是指＜Q283/＜Q283、＜Q283/Q283、Q283/Q283、＜Q283/T266、Q283/T266，和T266/T266，并且可通过阳离子交换层析来分离(
图1)。号码283或266是指全长rhBMP-2中N-末端氨基酸的位置。字母是指N-末端的氨基酸(即Q或T)，而″＜″是指283位的谷氨酰胺(Q)环化形成焦谷氨酸。因此，例如＜Q283/Q283是指rhBMP-2二硫化物连接的二聚体，其中二聚体的一个单体具有环化的N-末端谷氨酰胺，而另一个单体没有环化。
rhBMP-2在需要骨再生时有一些临床应用。因此，rhBMP-2可用于脊柱融合术以治疗退化的椎间盘(disk)疾病。rhBMP-2也可用来治疗长骨骨折。它还可用来治疗缺乏足够的骨质量以支持植入物的需要假牙的个体。
保持蛋白质的溶解度对于保持蛋白质的生物有效性和/或活性经常是很重要的。蛋白质溶解度依赖于多种因素。这些因素包括环境条件，例如pH、盐浓度、温度和溶剂的化学特性，以及目标蛋白质的固有特性，例如蛋白质的初级氨基酸序列和结构构象。经常地，涉及目标蛋白质的生物医药和/或药理学的应用需要的环境条件不能优化目标蛋白质的溶解度。结果蛋白质会沉淀，从而限制目标蛋白质的生物有效性和/或活性。因此本发明的一个目的是增加目标蛋白质，例如TGF-β超家族成员的溶解度，并且由此增加其作为药物组合物或研究试剂的生物有效性和/或活性。
本发明通过证明rhBMP-2的多种肽片段增加蛋白质，例如TGF-β超家族成员的溶解度和/或抑制其沉淀，来达到增加蛋白质溶解度，或抑制蛋白质沉淀的目的。
发明概述本发明涉及重组的人BMP-2(rhBMP-2)的T266同工型N-末端17个氨基酸突出端(extension)及其片段增加蛋白质，例如rhBMP-2的溶解度和/或抑制其沉淀的发现。本发明也涉及rhBMP2的T266同工型N-末端17个氨基酸的突出端可使已经沉淀析出溶液的蛋白质再溶解的发现。因此，本发明可用作在药物组合物或研究试剂中保持或增加目标蛋白质的溶解度的赋形剂。本发明也可用于使已经沉淀析出溶液的蛋白质再溶解。
因此本发明涉及包括rhBMP-2的T266同工型N-末端17个氨基酸突出端或其片段的组合物，其抑制目标蛋白质从溶液沉淀出来，和/或增加其溶解度。在一个实施方案中，目标蛋白质是TGF-β超家族的成员，例如BMP-2、TGF-β、BMP-12、BMP-13、BMP-6。在另外一个实施方案中，目标蛋白质是rhBMP-2同工型的任何一种，例如Q283/＜Q283、＜Q283/Q283和Q283/Q283。
本发明进一步涉及包括编码rhBMP-2的T266同工型N-末端17个氨基酸突出端或其片段的DNA序列(SEQ ID NO2)的组合物，其抑制目标蛋白质从溶液沉淀出来，和/或增加其溶解度。在一个实施方案中，目标蛋白质是TGF-β超家族的成员，例如BMP-2、TGF-β、BMP-12、BMP-13、BMP-6。在另外的实施方案中，目标蛋白质是rhBMP-2同工型的任何一种，例如Q283/＜Q283、＜Q283/Q283和Q283/Q283。
本发明也涉及抑制目标蛋白质从溶液沉淀出来和/或增加目标蛋白质的溶解度的方法。所述的方法包括将目标蛋白质与足够量的抑制所述蛋白质沉淀的肽或其片段接触，其中所述的肽包括Thr-Phe-Gly-His-Asp-Gly-Lys-Gly-His-Pro-Leu-His-Lys-Arg-Glu-Lys-Arg(SEQ IDNO1)。在一个特别的实施方案中，肽是由包括ACG TTT GGC CACGAC GGC AAA GGC CAC CCC CTG CAC AAA AGA GAG AAAAGA(SEQ ID NO2)的DNA序列编码的，该肽以足够的量抑制所述蛋白质的沉淀。该目标蛋白质可以是任何蛋白质。在一个实施方案中，目标蛋白质是TGF-β超家族的成员，例如BMP-2、TGF-β、BMP-12、BMP-13、BMP-6。在另外的实施方案中，目标蛋白质是由Q283或＜Q283组成的rhBMP-2同工型亚基的至少一种。
本发明另外的目的和优点部分地将在下列的说明书中阐明，并且部分地将明显从该说明书，或通过本发明的实施加以阐明。本发明的目的和优点可通过在所附的权利要求中特别指出的要素和组合来实现和获得。
可以理解上述的一般说明及其后的发明详述都只是例证性和说明性的，而不是如权利要求来限制本发明。
结合并组成本说明书的一部分的附图，可用来和本说明书一起解释本发明的原理。
附图简述图1的色谱图表明rhBMP-2的6种同工型从阳离子交换柱洗脱出来的洗脱图谱。
图2显示rhBMP2同工型在5mM硫酸钠中的溶解度。
图3显示rhBMP-2同工型Q283/Q283与rhBMP-2同工型T266/T266的再溶解。
图4显示rhBMP-2同工型Q283/Q283与rhBMP-2同工型＜Q283/T266的再溶解。
图5显示＜Q283/＜Q283与来源于rhBMP-2的N-末端延伸形式(266-396)的合成肽的再溶解。
实施方案的说明本发明基于来源于rhBMP-2的肽及其片段增加rhBMP-2的多种同工型的溶解度的意外发现。该肽包括rhBMP-2(SEQ ID NO1)的氨基酸第266-282位。片段是SEQ ID NO1的至少4个氨基酸、至少6个氨基酸、至少8个氨基酸、至少10个氨基酸、至少12个氨基酸、至少14个氨基酸、至少16个氨基酸。该肽亦称为rhBMP T266同工型的N-末端17个氨基酸突出端。
存在6种rhBMP-2的二聚同工型。6种同工型包括＜Q283/＜Q283、＜Q283/Q283、Q283/Q283、＜Q283/T266、Q283/T266和T266/T266。T266/T266的二聚同工型在存在硫酸钠时是高度可溶的，然而与其他同工型相比其生物活性是有限的。当透析进入无盐或低盐缓冲液时，T266/T266同工型保持为溶解的，同时在透析除去盐期间，包含＜Q283或Q283同工型亚基的二聚体沉淀出来。Q283和＜Q283同工型亚基在N-末端上的氨基酸第283位是截短的。因此Q283同工型亚基包含BMP-2的氨基酸第283-396位，其是存在于体内的同工型。283同工型亚基不包含T266同工型亚基的17个N-末端氨基酸突出端，即位于T266同工型亚基上的氨基酸第266-282位。
当T266同工型中存在17个氨基酸突出端时，它赋予rhBMP-2增加的溶解度。此外，T266同工型的17个氨基酸的N-末端可使沉淀的rhBMP-2同工型再溶解。令人惊讶地，来源于rhBMP-2的T266同工型的第266-282位N-末端延伸的片段也赋予rhBMP-2增加的溶解度并且抑制沉淀。
因此，本发明的一个实施方案提供增加用作药物组合物或研究试剂的更多活性形式的rhBMP-2的溶解度，抑制其沉淀，使其再溶解的方法。本发明另外的实施方案提供包括来源于rhBMP的T266同工型的肽的组合物，其中所述的肽增加目标蛋白质的溶解度，和/或抑制目标蛋白质的沉淀，和/或使已经从溶液沉淀析出的目标蛋白质再溶解。在这种实施方案中，本发明的组合物包括rhBMP-2(SEQ ID NO1)的T266同工型的N-末端17个氨基酸突出端。在另外的实施方案中，本发明包含SEQ ID NO1的片段，包括但不限于，例如SEQ ID NO1的氨基酸第6-17位，SEQ ID NO1的第11-17位氨基酸，或SEQ ID NO1的氨基酸第14-17位，当其接触目标白质时，增加目标蛋白质的溶解度和/或抑制目标蛋白质的沉淀和/或使已经从溶液沉淀出来的目标蛋白质再溶解。本领域的技术人员将理解为了确定SEQ ID NO1的片段增加目标蛋白质的溶解度，或抑制其沉淀，或使目标蛋白质再溶解，熟练的技术人员将比较在使目标蛋白质与SEQ ID NO1的片段接触前后，或有和没有使两者接触的情况下目标蛋白质的溶解度、或沉淀、或再溶解。
在一个实施方案中，定义溶解度为，当在路径长度为1厘米的石英比色杯中通过分光光度计在波长为340纳米处测量吸光度为≤0.1。分光光度计可例如是日立(Hitachi)U-2000。
在本发明的一个实施方案中，当由SEQ ID NO1编码的肽或由SEQID NO1编码的肽的片段与目标蛋白质接触时，导致所述的目标蛋白质变得更易溶解，和/或较小可能沉淀出来，和/或如果所述的蛋白质已经沉淀出来，则使其再溶解。
在本发明的备选实施方案中，当由包含SEQ ID NO2的DNA序列编码的肽，或由包含SEQ ID NO2的DNA序列编码的肽的片段与目标蛋白质接触时，导致所述的目标蛋白质变得更易溶解，和/或较小可能沉淀出来，和/或如果所述的蛋白质已经沉淀出来，使其再溶解。
由于已知的遗传密码简并性，一个以上的密码子可编码相同的氨基酸，不同于SEQ ID NO2中所示的序列的DNA序列，可能仍然编码具有SEQ ID NO1的氨基酸序列的多肽。这种变化的DNA序列可能由沉默突变产生(例如，在PCR扩增期间发生)，或可能是天然序列的特意诱变的产物。
因此本发明提供编码本发明多肽的分离的DNA序列，选自(a)包含SEQ ID NO2的核苷酸序列的DNA；(b)编码SEQ ID NO1的多肽的DNA；(c)能够与(a)或(b)的DNA在中等严谨条件下杂交，并且编码具有本发明肽的功能特性的肽的DNA(即，增加目标蛋白质的溶解度或使目标蛋白质再溶解)；(d)能够与(a)或(b)的DNA在高严谨条件下杂交，并且编码具有本发明肽的功能特性的肽的DNA，以及(e)与(a)、(b)、(c)、或(d)所限定的DNA具有遗传密码简并性，并且编码具有本发明肽的功能特性的肽的DNA。当然，本发明包括由这种DNA序列编码的多肽。
如在此所使用的，中等严谨的条件可由本领域普通的技术人员根据例如，DNA的长度而容易地确定。Sambrook等人阐明了基本的条件，Molecular CloningA Laboratory Manual，2ed.Vol.1，pp.1.101-104，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989)并且包括使用硝酸纤维素滤膜的预洗涤溶液，5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)、杂交条件为大约50％甲酰胺、6×SSC，在大约42℃(或其他类似的杂交溶液，例如Stark′s溶液，在大约50％甲酰胺中，在42℃)，而洗涤条件为大约60℃，0.5×SSC，0.1％SDS。熟练的技术人员也可根据例如，DNA的长度容易地确定高严谨条件。一般地，定义这种条件为如上的杂交条件，并且在大约68℃，用0.2×SSC，0.1％SDS洗涤。熟练的技术人员可认识到温度和洗液的盐浓度可根据例如探针长度等因素，按照需要进行调节。
在另外的实施方案中，本发明的核酸分子也包括与SEQ ID NO2至少80％相同的核苷酸序列。还预期的实施方案是核酸分子包括与SEQID NO2至少90％相同、至少95％相同、至少98％相同、至少99％相同、或至少99.9％相同的序列。
可通过目测检查和数学计算确定同一性百分数。备选地，可利用由Devereux等人(Nucl.Acids Res.12387，1984)描述，并且可以从威斯康星大学遗传学计算机组(UWGCG)获得版本6.0的GAP计算机程序，比较序列信息来确定2个核酸序列的同一性百分数。用于GAP程序的优选缺省参数包括(1)核苷酸的一元比较矩阵(包含值为1为相同，而值为0为不相同)，以及Gribskov和Burgess的加权比较矩阵，Nucl.Acids Res.146745，1986，如Schwartz和Dayhoff编辑的，Atlas of Protein Sequence and Structure，National Biomedical ResearchFoundation，pp.353-358，1979所描述的；(2)每个缺口的罚分为3.0，每个缺口中各个标记附加0.10的罚分；以及(3)末端缺口没有罚分。也可使用本领域技术人员用于序列比较的其他程序。
本发明也涉及使得目标蛋白质更易溶解，或较小可能从溶液沉淀出来的方法，所述的方法包括通过将编码rhBMP(SEQ ID NO2)的T266同工型N末端17个氨基酸的DNA序列、或其片段，与编码所述目标蛋白质的DNA序列而遗传工程化的所述的蛋白质退火。编码所述目标蛋白质的DNA序列可以是当被翻译时产生所述目标蛋白质的任何DNA序列(例如基因组DNA、cDNA)。在一个实施方案中，将本发明的DNA序列(SEQ ID NO2)或其片段与所述目标蛋白质的氨基(N)末端退火。在另外的实施方案中，将本发明的DNA序列(SEQ ID NO2)或其片段与所述目标蛋白质的羧基(C)末端退火。可将与SEQ ID NO2或其片段退火的编码所述目标蛋白质的DNA工程化到本领域已知的任何载体或质粒中。表达载体和克隆载体如下有描述，例如CloningVectorsA Laboratory Manual(Powells等.1985，Supp.1987)和Molecular Cloning A Laboratory Manual第二版(Sambrook等.1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press)备选地，可利用聚合酶链式反应(PCR)(Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley andSons，New York，1989)扩增编码目标蛋白质的DNA序列。
可通过用与SEQ ID NO2或其片段退火的编码所述目标蛋白质的所有或部分DNA转化或转染合适的宿主细胞来产生与SEQ ID NO2退火的目标蛋白质。分子生物学领域的技术人员将理解任何的各种表达系统都可用来表达编码与SEQ ID NO2或其片段退火的目标蛋白质的DNA。所使用的具体的宿主细胞对本发明不是关键的。宿主细胞的实例包括，但不限于原核细胞，例如大肠杆菌，或真核细胞，例如COS1、CHO、NIH3T3、草地夜蛾(S.Frugiperda)，或啤酒酵母(S.cerevisiae)。这种细胞可以从各种各样的来源容易地获得(例如，美国典型培养物保藏中心，Rockland，Md.)转染的方法和表达质粒或载体的选择可能取决于所选择的宿主系统。例如在上述Ausubel中描述了转化和转染的方法。
本发明也涉及由SEQ ID NO1编码的肽或其片段，其中在所述肽或其片段内的至少一个氨基酸已经通过突变、缺失或用不同的氨基酸取代而改变，但不改变该肽的活性，即，所述改变的肽仍然增加目标蛋白质的溶解度，或抑制其沉淀或备选地使沉淀的目标蛋白质再溶解。在另外的方面，本发明涉及由SEQ ID NO1编码的肽或其片段，其中至少一个氨基酸已经加到C-末端上。在另外的方面，本发明涉及由SEQ IDNO1编码的肽或其片段，其中至少一个氨基酸已经加到N-末端上。在另一实施方案中，肽或其片段中的突变，导致氨基酸取代，其中所述的取代是保守取代。保守取代指用具有相似化学特性，例如极性、疏水性、电荷的其他氨基酸取代一个氨基酸。保守取代的实例包括丝氨酸对苏氨酸的取代，或精氨酸对赖氨酸的取代，或缬氨酸对丙氨酸的取代。熟练的技术人员将理解许多保守取代都是可能的。在特别的实施方案中，改变的肽与由SEQ ID NO1编码的肽是至少70％相同、80％相同、90％相同或99％相同的。
可使用本领域已知的用于诱变的任何技术，以产生由SEQ ID NO1编码的肽的突变体，尤其包括体外定点诱变(Hutchinson等，(1978)Biol Chem.2536551；Zoller and Smith，(1984)DNA，3479-488；Oliphant等，(1986)Gene 44177；Hutchinson等，(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83710；Huygen等，(1996)Nature Medicine，2(8)893-898)以及使用TAB接头(Pharmacia)。PCR技术可用于定点诱变(Higuchi，1989，″Using PCR to Engineer DNA″，in PCRTechnologyPrinciples and Applications for DNA Amplification，H.Erlich，ed.，Stockton Press，Chapter 6，pp.61-70)。
目标蛋白质可以是任何蛋白质。本发明的一个方面中，目标蛋白质是BMP-2或rhBMP-2。在另外的方面，目标蛋白质是rhBMP-2的至少一种同工型亚基，例如＜Q283和Q283。rhBMP的同工型亚基可以单体或多聚体，例如二聚体存在。在另一方面，目标蛋白质是共有BMP-2的序列和/或结构同源性的TGF-β超家族的任何成员，例如TGF-β、BMP-12、BMP-6、BMP-13。
本发明也提供包括由SEQ ID NO1编码的肽或其片段，例如SEQID NO1的氨基酸第6-17位、SEQ ID NO1的第11-17位氨基酸、或SEQID NO1的氨基酸第14-17位，和生物学活性分子的药物组合物，其中所述的由SEQ ID NO1编码的肽或其所述的片段增加所述生物学活性分子和载体的溶解度，和/或抑制其沉淀，和/或使其再溶解。在一个实施方案中，生物学活性分子是蛋白质或肽。因此，生物学活性分子可以是TGF-β超家族的成员，例如TGF-β、BMP-12、BMP-6、BMP-13，或衍生自TGF-β超家族的成员，例如TGF-β超家族成员的肽片段。该蛋白质可以是例如，BMP-2或rhBMP-2。备选地，该蛋白质或肽可以是rhBMP-2的同工型亚基，例如＜Q283和Q283。所述的同工型亚基可以是单体或多聚体，例如二聚体。载体可以是本领域已知的任何合适的载体。例如但不限于，该载体可以是可吸收的胶原海绵(ACS)。
本发明涉及包含SEQ ID NO1或SEQ ID NO1的片段的肽，包括例如，SEQ ID NO1的氨基酸第6-17位、SEQ ID NO1的第11-17位氨基酸、或SEQ ID NO1的氨基酸第14-17位。可通过本领域已知的肽合成的任何方法产生所述的肽或其片段。例如但不限于，可使用固相肽合成来产生本发明的组合物。例如这种方法由Steward和Young描述(SolidPhase Peptide Synthesis(Freeman and Co.，San Francisco，1969)。
可利用重组DNA技术制备由SEQ ID NO1编码的肽或其片段。参见例如，在Sambrook等人.1990，Molecular Cloning，A LaboratoryManual，2d Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY中所描述的技术。原核(例如，大肠杆菌)或真核细胞(例如，Cos细胞、CHO细胞)可用于表达本发明的重组肽或其片段。备选地，利用苜蓿丫纹夜蛾(Autographa californica)核多角体病病毒(AcNPV)的昆虫系统可用于表达本发明的肽或其片段。重组的昆虫病毒可在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。
本发明的肽或其片段，可以表达融合蛋白质。融合蛋白质提供更大稳定性和便于纯化该肽或其片段的优点。例如但不限于，该肽或其片段可表示为GST融合肽或His标记的融合肽。优选地，该融合标记可被切割，从而可以在纯化步骤后除去该标记。
本发明也涉及将药物组合物递送到需要治疗疾病或病症的哺乳动物的方法。该药物组合物包括生物学活性分子和包含SEQ ID NO1或其片段的肽。该方法包括将药物组合物施用于所述的哺乳动物以治疗所述的病症。该生物学活性分子可以是例如，TGF-β超家族的任何成员或当与包含SEQ ID NO1或其片段的肽接触时，和未与包含SEQ ID NO1或其片段的肽接触的相同蛋白质相比，变得更易溶解、或再溶解的其他蛋白质。在一个实施方案中，生物学活性分子是BMP-2或rhBMP-2。
本发明的方法可用于治疗需要施用生物学活性分子的病症，其中当所述的生物学活性分子与包含SEQ ID NO1或其片段的肽接触时，比未接触的活性分子是更易溶解的。本发明的方法可用于治疗需要施用生物学活性分子的病症，其中当所述的生物学活性分子与包含SEQ IDNO1或其片段的肽接触时是再溶解的。在一个实施方案中，待治疗的病症需要骨的再生，例如脊柱融合术或长骨骨折，以及需要生物学活性分子即，BMP-2或rhBMP-2或rhBMP-2的同工型亚基。
哺乳动物可以是任何哺乳动物，包括但不限于狗、猫、大鼠、小鼠、灵长类、家畜，例如牛、山羊、猪或绵羊。在一个实施方案中，该哺乳动物是人。
本发明的方法可在不防碍SEQ ID NO1的肽或其片段的活性的任何生物化学药品和物理条件下实施。例如但不限于，本发明的方法可在温度为20℃和pH为4.5时实施，其中该肽的浓度过量于目标蛋白质的10-20倍摩尔。
本领域中已知的任何方法均可用于确定本发明的方法是否导致目标蛋白质溶解度的增加，或导致目标蛋白质的再溶解。例如但不限于，测量包含目标蛋白质的溶液的吸光度和/或光散射可用于确定本发明的方法是否增加目标蛋白质的溶解度或再溶解目标蛋白质。可在将目标蛋白质与包含SEQ ID NO1或其片段的肽接触前后进行测量。
本发明的方法可在＞0℃和＜65℃的温度范围内实施。在一个实施方案中，本发明的方法在20℃的温度实施。在另外的实施方案中，本发明的方法在4℃的温度实施。在另一实施方案中，本发明的方法在37℃的温度实施。
本发明的方法可在任何pH实施，只要和未与包含SEQ ID NO1或其片段的肽接触的所述目标蛋白质的溶解度相比，本方法导致目标蛋白质与包含SEQ ID NO1或其片段的肽接触时，其溶解度增加。备选地，本发明的方法可在当目标蛋白质与包含SEQ ID NO1或其片段的肽接触时，导致目标蛋白质再溶解的pH下实施。因此，在一个实施方案中，本发明的方法可在＞1和＜7.5之间的pH实施。在另外的实施方案中，本发明的方法在生理学的pH实施。在另一实施方案中，本发明在pH 4.5实施。
任何浓度的包含SEQ ID NO1或其片段的肽可被用于实施本发明的方法，只要该方法使得，和未与包含SEQ ID NO1或其片段的肽接触的所述目标蛋白质的溶解度相比，当目标蛋白质与包含SEQ ID NO1或其片段的肽接触时，其溶解度增加。备选地，任何浓度的包含SEQ IDNO1或其片段的肽均可用于实施本发明的方法，只要该方法在当目标蛋白质与包含SEQ ID NO1或其片段的肽接触时，导致目标蛋白质再溶解。在一个实施方案中，本发明的方法用包含SEQ ID NO1或其片段的肽，在1-1,000纳摩的浓度范围内实施。在另外的实施方案中，本发明的方法用包含SEQ ID NO1或其片段的肽，在1-1,000微摩尔的浓度范围内实施。在另外的实施方案中，本发明的方法用包含SEQ ID NO1或其片段的肽，在1-1,000毫摩的浓度范围内实施。在另外的实施方案中，本发明的方法用包含SEQ ID NO1或其片段的肽，在1-1,000摩尔的浓度范围内实施。
本发明的方法包括将目标蛋白质与包含SEQ ID NO1或其片段的肽接触，其中所述的肽或其片段增加目标蛋白质的溶解度或使目标蛋白质再溶解。在本发明的一个方面，本发明的方法用以与目标蛋白质相比存在过量的摩尔数的包含SEQ ID NO1或其片段的肽来实施。该肽可与目标蛋白质相比以1-1000-倍摩尔过量的方式存在。在本发明另外的方面，本发明的方法用与包含SEQ ID NO1或其片段的肽相比过量摩尔数的目标蛋白质来实施。目标蛋白质，相对于包含SEQ ID NO1或其片段的肽可以1-1000-倍摩尔过量的范围存在。在一个实施方案中，本发明的方法用与目标蛋白质相比10-20倍摩尔过量存在的包含SEQ IDNO1或其片段的肽来实施。
除了在可操作的实施例中，或其中另外标明，可以理解在本说明书和权利要求中所使用的表示成分的数量、反应条件诸如此类的所有数字通过术语″大约″，在一切情况下是可改变的。因此，除非相反地指明，本说明书和所附权利要求中阐明的数值参数是近似值，其可根据通过本发明寻求获得的所需要特性而变化。至少，但不意图限制相当于本权利要求范围的原理的施用，各个数值参数应该被视为考虑到有效数字和常规四舍五入处理的数值。
尽管阐明本发明广泛范围的数值范围和参数是近似值，特定实施例中阐述的数值是尽可能精确地加以报道的。本领域的技术人员可认识到任何数值，固有地包含在其各自的试验测定中存在的由标准偏差产生的某些必然误差。
下列实施例说明，但不是意图限制本发明的范围。
实施例1rhBMP-2的6个同工型的溶解度在CHO细胞中产生rhBMP-2，并且包含6种二聚同工型＜Q283/＜Q283，Q283/Q283、＜Q283/T266、Q283/T266和T266/T266。T266亚基的N-末端上具有17个氨基酸突出端，其在Q283和＜Q283亚基中缺失。这个延伸由细胞代谢过程期间PACE酶未能在C-末端切割Arg282处而产生。其发生是因为在CHO细胞中过生产重组的蛋白质，因此使PACE酶的载量饱和。
rhBMP-2具有独特的溶解度图谱。它在低盐浓度和低pH时溶解度最大。然而，如果盐浓度增至高于0.15M的离子强度它在更高的pH值保持溶解。为了确定在rh BMP2的不同同工型之间是否存在任何固有溶解度的差异，纯化同工型并且用5mM硫酸钠处理。利用在340nm处吸光度的光散射测量溶解度。
利用5mM Na2SO4作为蛋白质沉淀剂进行研究。在5mM L-谷氨酸、5mM NaCl、2.5％甘氨酸、0.5％蔗糖、0.01％(w/v)聚山梨酸酯80 pH4.5中，蛋白质浓度为0.5mg/mL以及体积为0.5mL下进行实验。对于分子的沉淀和再溶解，孵育时间都是室温下10分钟。通过340nm处的光散射测量沉淀程度。
将从用5mM和18mM Na2SO4沉淀的rhBMP-2获得的上清液进行反相和阳离子交换层析。从通过在14,000RPM，与大约2℃至8℃微离心30分钟沉淀分离上清液。
通过阳离子交换层析分离rhBMP-2的6种二聚同工型(图1)。孵育与低水平的Na2SO4混合的所有6种rhBMP-2同工型导致同工型沉淀物的指示性吸光度增加。吸光度增加在大约3mM至4mM Na2SO4的范围内是明显的。通过反相色谱法，比较原始材料和沉淀物上清液中蛋白质的浓度来确定沉淀物的数量。在5mM Na2SO4，蛋白质浓度减少至原始数量的63％。在18mM Na2SO4，蛋白质浓度减少至起始浓度的81％。通过阳离子交换层析分析沉淀物的上清液。发现富集沉淀物的上清液包含T266亚基的二聚体。这个起始的观察证明6种rhBMP-2同工型间溶解度的差异。
为了进一步研究这个现象，纯化每种同工型，并且与5mM Na2SO4孵育，以更好的评估它们的相对溶解度。通过340nM处的光散射测量同工型的沉淀。在加入5mM Na2SO4后包含T266亚基的所有同工型保持澄清状态。包含Q283亚基或＜Q283亚基而非T266亚基的所有同工型变为乳白色并且导致340nM处的吸光度增加。这个结果表明在存在5mM Na2SO4时，Q283和＜Q283同工型沉淀，而T266亚基不沉淀(图2)。
其次的实验研究T266/T266同工型使沉淀的Q283/Q283同工型再溶解的能力。用5mM Na2SO4沉淀10纳摩的Q283/Q283同工型。将不同数量的T266/T266同工型(也在5mM Na2SO4中)加入沉淀的Q283/Q283同工型，并且在340nM处测量吸光度。向沉淀的Q283/Q283同工型加入T266/T266导致340nM处溶液吸光度呈剂量依赖性的方式减少。在加入5纳摩的T266/T266后，10纳摩的Q263/Q263变得澄清。这发生在室温下孵育10分钟内(图3)。向10纳摩沉淀的Q283/Q283加入＜Q283/T266同工型导致类似的340nM处吸光度的减少，然而需要更高浓度的＜Q283/T266同工型以达到相同的效果(图4)。
T266同工型和Q283和＜Q283同工型之间的差异是T266同工型N-末端上17个氨基酸突出端。进行其次的实验以确定17个氨基酸突出端或其片段是否能够再溶解rhBMP-2。合成相应于T266同工型N-末端的17个氨基酸的肽，并且进行研究以确定这些肽是否使成熟rhBMP-2再溶解。
合成下列肽S17Thr-Phe-Gly-His-Asp-Gly-Lys-Gly-His-Pro-Leu-His-Lys-Arg-Glu-Lys-Arg(SEQ ID NO1)；S12Gly-Lys-Gly-His-Pro-Leu-His-Lys-Arg-Glu-Lys-Arg(SEQ ID NO1的第6-17位氨基酸)；S7Leu-His-Lys-Arg-Glu-Lys-Arg(SEQ ID NO1的第11-17位氨基酸)；Arg-Glu-Lys-Arg(SEQ ID NO1的氨基酸第14-17位)。
所有的合成肽都能够使已经用5mM Na2SO4沉淀的10纳摩＜Q283/＜Q283再溶解(图5)。溶解能力随链长度而的减少。S4，最小的肽对于再溶解＜Q283/＜Q283仍然是有效的，但是需要高浓度的肽。
用除了硫酸盐外的其他阴离子检验合成肽再溶解＜Q283/＜Q283同工型的能力。该肽能够使被氯化钠和磷酸钠沉淀的Q283/＜Q283再溶解。
包含T266亚基的rhBMP-2同工型比只包含＜Q283或Q283亚基的同工型是更易溶解的。在多种阴离子存在的情况下溶解度的增加与T266亚基17个氨基酸突出端有关。
由T266的17个N-末端氨基酸突出端或其片段组成的肽可用作赋形剂以防止阴离子诱导的例如rhBMP-2的蛋白质的沉淀。由于TGF-β超家族成员间存在的高度序列和构象同源性，T266的17个N-末端氨基酸突出端或其片段可用作TGF-β超家族任何成员的赋形剂或增溶剂。
T266的N-末端17个氨基酸突出端可用于溶解或再溶解rhBMP-2或增加其溶解度。因此，在产生或纯化蛋白质时，该肽或其片段可用于增加rhBMP-2的溶解度以从该蛋白质除去不完全的阴离子。当它与rhBMP-2递送载体的可吸收胶原海绵(ACS)接触时，也可用来溶解rhBMP-2蛋白质。ACS包含非控制水平的多种阴离子，包括硫酸盐、磷酸盐和氯化物。
实施例2生产具有增加溶解度的rhBMP-2通过PCR，根据本领域已知的PCR方法产生rhBMP Q283/Q283同工型的DNA片段，该片段的N末端连接有SEQ ID NO2并且其侧翼有限制酶切位点BamH1和Nde1。将PCR产物连接到大肠杆菌表达载体pT-16b(Novagen，Madison，WI)中。然后该质粒用于转化大肠杆菌JM109。通过用IPTG处理细胞实现刺激融合蛋白质的表达，其中该融合蛋白质包括具有SEQ ID NO2编码的肽的rhBMP蛋白质和Q283/Q283同工型。通过金属螯合色谱法，根据本领域已知的方法分离重组蛋白质(例如Studier等.Methods in Enzymology60-89，1990)。与rhBMP的Q283/Q283同工型相比，该融合蛋白质显示出增加的溶解度，并且例如可用于药物组合物。
考虑到在此公开的本发明的说明书和实施例，本发明的其他实施方案对本领域的技术人员来说将是显而易见的。认为本说明书和实施例只是例证性的，通过下列的权利要求表明本发明得真实范围和精神，并且相当于其被授权的完全范围。
在此引用的所有参考文献在此全部引入作为参考，为了所有的目的达到相同的程度，正如各种单独的出版物、专利、或专利申请具体地并且分别地指明为所有目的全部引入作为参考。
序列表<110>Nichols，Pilarin E.L.
Perez-Ramirez，Bernardo<120>用作转化生长因子β蛋白质的溶解赋形剂的肽<130>08702.0019 00304<160>2<170>PatentIn versjon 3.1<210>1<211>17<212>PRT<213>Homo sapien<400>1Thr Phe Gly His Asp Gly Lys Gly His Pro Len His Lys Arg Glu Lys1 5 10 15Arg<210>2<211>51<212>DNA<213>Homo sapien<400>2acgtttggcc acgcggcaa aggccacccc ctgcacaaaaa gagagaaaag a5权利要求
1.一种抑制蛋白质从溶液中沉淀出来的组合物，其包含SEQ IDNO1编码的肽或其片段。
2.权利要求1的组合物，其中所述的蛋白质是TGF-β超家族的成员。
3.权利要求2的组合物，其中所述的蛋白质是BMP-2。
4.权利要求3的组合物，其中所述的BMP-2是人BMP-2。
5.权利要求4的组合物，其中所述的人BMP-2是rhBMP-2。
6.权利要求5的组合物，其中所述的rhBMP-2是rhBMP-2的同工型。
7.权利要求6的组合物，其中所述的同工型选自＜Q283或Q283。
8.权利要求7的组合物，其中所述的同工型是二聚体。
9.权利要求8的组合物，其中所述的二聚体选自＜Q283/＜Q283、＜Q283/Q283和Q283/Q283。
10.权利要求1的组合物，其中所述的肽或其片段，包含SEQ IDNO1的第6-17位氨基酸。
11.权利要求10的组合物，其中所述的蛋白质是TGF-β超家族的成员。
12.权利要求11的组合物，其中所述的蛋白质是BMP-2。
13.权利要求12的组合物，其中所述的BMP-2是人BMP-2。
14.权利要求13的组合物，其中所述的人BMP-2是rhBMP-2。
15.权利要求14的组合物，其中所述的rhBMP-2是rhBMP-2的同工型。
16.权利要求15的组合物，其中所述的同工型选自＜Q283或Q283。
17.权利要求16的组合物，其中所述的同工型是二聚体。
18.权利要求17的组合物，其中所述的二聚体选自＜Q283/＜Q283、＜Q283/Q283或Q283/Q283。
19.权利要求1的组合物，其中所述的肽包含SEQ ID NO1的第11-17位氨基酸。
20.权利要求19的组合物，其中所述的蛋白质是TGF-β超家族的成员。
21.权利要求20的组合物，其中所述的蛋白质是BMP-2。
22.权利要求21的组合物，其中所述的BMP-2是人BMP-2。
23.权利要求22的组合物，其中所述的人BMP-2是rhBMP-2。
24.权利要求23的组合物，其中所述的rhBMP-2是rhBMP-2的同工型。
25.权利要求24的组合物，其中所述的同工型选自＜Q283或Q283。
26.权利要求25的组合物，其中所述的同工型是二聚体。
27.权利要求26的组合物，其中所述的二聚体选自＜Q283/＜Q283、＜Q283/Q283或Q283/Q283。
28.权利要求1的组合物，其中所述的肽包含SEQ ID NO1第14-17位的氨基酸。
29.权利要求28的组合物，其中所述的蛋白质是TGF-β超家族的成员。
30.权利要求29的组合物，其中所述的蛋白质是BMP-2。
31.权利要求30的组合物，其中所述的BMP-2是人BMP-2。
32.权利要求31的组合物，其中所述的人BMP-2是rhBMP-2。
33.权利要求32的组合物，其中所述的rhBMP-2是rhBMP-2的同工型。
34.权利要求33的组合物，其中所述的同工型选自＜Q283或Q283。
35.权利要求34的组合物，其中所述的同工型是二聚体。
36.权利要求35的组合物，其中所述的二聚体选自＜Q283/＜Q283、＜Q283/Q283或Q283/Q283。
37.一种抑制目标蛋白质从溶液沉淀出来的方法，所述的方法包括将所述的蛋白质与有效量的抑制所述蛋白质沉淀的肽接触，其中所述的肽包含SEQ ID NO1或其片段。
38.权利要求37的方法，其中所述的蛋白质是TGF-β家族的成员。
39.权利要求38的方法，其中所述的蛋白质是BMP-2。
40.权利要求39的方法，其中所述的BMP-2是人BMP-2。
41.权利要求40的方法，其中所述的人BMP-2是rhBMP-2。
42.权利要求41的方法，其中该rhBMP-2是rhBMP-2的同工型。
43.权利要求42的方法，其中所述的同工型是二聚体。
44.权利要求43的方法，其中所述的二聚体选自＜Q283/＜Q283、＜Q283/Q283或Q283/Q283。
45.一种药物组合物，包括生物学活性分子和包含SEQ ID NO1的肽以及载体。
46.权利要求45的药物组合物，其中所述的生物学活性分子是TGF-β超家族的成员。
47.权利要求46的药物组合物，其中所述的TGF-β超家族成员是BMP-2。
48.权利要求47的药物组合物，其中所述的BMP-2是rhBMP-2。
49.权利要求48的药物组合物，其中所述的rhBMP-2是rhBMP-2的同工型。
50.权利要求49的药物组合物，其中所述的同工型是二聚体。
51.权利要求50的药物组合物，其中所述的二聚体选自＜Q283/＜Q283、＜Q283/Q283或Q283/Q283。
52.权利要求45的药物组合物，其中所述的载体是可吸收的胶原海绵。
53.一种将药物组合物递送到需要治疗病症或疾病的哺乳动物的方法，所述的方法包括将所述的药物组合物施用于所述的哺乳动物以治疗所述的病症或疾病，其中所述的药物组合物包括生物学活性分子、包含SEQ ID NO1或其片段的肽，以及载体，其中所述的包含SEQID NO1或其片段的肽可增加所述生物学活性分子的溶解度。
54.权利要求53的方法，其中所述的生物学活性分子是TGF-β超家族的成员。
55.权利要求54的方法，其中所述的TGF-β超家族的成员是BMP-2。
56.权利要求55的方法，其中所述的BMP-2是rhBMP-2。
57.权利要求56的方法，其中所述的rhBMP-2是rhBMP-2的同工型。
58.权利要求57的方法，其中所述的同工型是二聚体。
59.权利要求58的方法，其中所述的二聚体选自＜Q283/＜Q283、＜Q283/Q283或Q283/Q283。
60.权利要求53的方法，其中所述的哺乳动物是人。
61.权利要求53的方法，其中所述的载体是可吸收的胶原海绵。
62.一种使已经从溶液沉淀出来的蛋白质再溶解的组合物，其包括由SEQ ID NO1编码的肽或其片段。
63.权利要求62的组合物，其中所述的蛋白质是TGF-β超家族的成员。
64.权利要求63的组合物，其中所述的蛋白质是BMP-2。
65.权利要求64的组合物，其中所述的BMP-2是人BMP-2。
66.权利要求65的组合物，其中所述的人BMP-2是rhBMP-2。
67.权利要求66的组合物，其中所述的rhBMP-2是rhBMP-2的同工型。
68.权利要求67的组合物，其中所述的同工型选自＜Q283或Q283。
69.权利要求68的组合物，其中所述的同工型是二聚体。
70.权利要求69的组合物，其中所述的二聚体选自＜Q283/＜Q283、＜Q283/Q283和Q283/Q283。
71.权利要求62的组合物，其中所述的肽或其片段，包含SEQ IDNO1的第6-17位氨基酸。
72.权利要求71的组合物，其中所述的蛋白质是TGF-β超家族的成员。
73.权利要求72的组合物，其中所述的蛋白质是BMP-2。
74.权利要求73的组合物，其中所述的BMP-2是人BMP-2。
75.权利要求74的组合物，其中所述的人BMP-2是rhBMP-2。
76.权利要求75的组合物，其中所述的rhBMP-2是rhBMP-2的同工型。
77.权利要求76的组合物，其中所述的同工型选自＜Q283或Q283。
78.权利要求77的组合物，其中所述的同工型是二聚体。
79.权利要求78的组合物，其中所述的二聚体选自＜Q283/＜Q283、＜Q283/Q283或Q283/Q283。
80.权利要求62的组合物，其中所述的肽包含SEQ ID NO1的第11-17位氨基酸。
81.权利要求80的组合物，其中所述的蛋白质是TGF-β超家族的成员
82.权利要求81的组合物，其中所述的蛋白质是BMP-2。
83.权利要求82的组合物，其中所述的BMP-2是人BMP-2。
84.权利要求83的组合物，其中所述的人BMP-2是rhBMP-2。
85.权利要求84的组合物，其中所述的rhBMP-2是rhBMP-2的同工型。
86.权利要求85的组合物，其中所述的同工型选自＜Q283，Q283或T266。
87.权利要求86的组合物，其中所述的同工型是二聚体。
88.权利要求87的组合物，其中所述的二聚体选自＜Q283/＜Q283、＜Q283/Q2873或Q283/Q283。
89.权利要求62的组合物，其中所述的肽包含SEQ ID NO1的氨基酸第14-17位。
90.权利要求89的组合物，其中所述的蛋白质是TGF-β超家族的成员。
91.权利要求90的组合物，其中所述的蛋白质是BMP-2。
92.权利要求91的组合物，其中所述的BMP-2是人BMP-2。
93.权利要求92的组合物，其中所述的人BMP-2是rhBMP-2。
94.权利要求93的组合物，其中所述的rhBMP-2是rhBMP-2的同工型。
95.权利要求94的组合物，其中所述的同工型选自＜Q283或Q283。
96.权利要求95的组合物，其中所述的同工型是二聚体。
97.权利要求96的组合物，其中所述的二聚体选自＜Q283/＜Q283、＜Q283/Q283或Q283/Q283。
98.一种使目标蛋白质再溶解的方法，所述的方法包括将所述的蛋白质与有效量的使目标蛋白质再溶解的肽接触，其中所述的肽包含SEQ ID NO1或其片段。
99.权利要求98的方法，其中所述的蛋白质是TGF-β家族的成员。
100.权利要求99的方法，其中所述的蛋白质是BMP-2。
101.权利要求100的方法，其中所述的BMP-2是人BMP-2。
102.权利要求101的方法，其中所述的人BMP-2是rhBMP-2。
103.权利要求102的方法，其中该rhBMP-2是rhBMP-2的同工型。
104.权利要求103的方法，其中所述的同工型是二聚体。
105.权利要求104的方法，其中所述的二聚体选自＜Q283/＜Q283、＜Q283/Q283或Q283/Q283。
全文摘要
本发明涉及包括用于蛋白质的赋形剂或增溶剂的组合物。本发明涉及来源于rhBMP2的T266同工型N－末端延伸的肽具有增加蛋白质溶解度之特性的发现。本发明也涉及通过将蛋白质与包含rhBMP－2的T266同工型的17个氨基酸突出端的肽接触，使已经沉淀的蛋白质再溶解的方法。本发明也涉及通过将蛋白质与包含rhBMP－2的T266同工型的17个氨基酸突出端的肽接触，来增加蛋白质溶解度的方法。
文档编号C07K5/00GK1735426SQ03824166
公开日2006年2月15日 申请日期2003年8月12日 优先权日2002年8月13日
发明者P·E·L·尼科尔斯, B·佩雷斯－拉米雷斯 申请人:惠氏公司