用于肝细胞癌症的微rna表达谱分析的组合物和方法

专利名称：用于肝细胞癌症的微rna表达谱分析的组合物和方法
技术领域：
本发明涉及用于肝细胞癌症(hepatocellular cancer)的微RNA(microRNA)表达谱分析的组合物和方法。
背景技术：
肝细胞癌症(也称作肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC))是世界范围内最常见的实体恶性肿瘤之一。其代表了肝癌的主要组织学类型，可能占所有肝癌病例的70%-85%。世界每年有大约500000个新病例，和几乎相同数目的死亡病例，这反映出对这种疾病缺乏有效的早期检测和治疗选择(综述参见例如Thorgeirsson, S. S. and Grisham,J. ff. (2002) Nat. Genet. 31, 339-346 ；Parkin, D. M. et al. (2005) CA Cancer J. Clin. 55,74-108)。 因此，肝细胞肝癌是一类预后很差的癌症。结果不佳是由于肝细胞癌症的主要特点即肝内转移或手术后复发。新的肿瘤克隆(tumor colony)通常侵袭门静脉的主要分支及可能侵袭肝脏的其他部分(综述见例如Tang, Z. Y. (2001)World J Gastroenterol 7,445-454 ；Chambers, A. F. et al. (2002) Nat. Rev. Cancer 2，563-572)。切除和 / 或肝移植是可能治愈的最佳选择。然而，目前仅大约10% -20%的肝细胞癌症患者符合外科手术条件，所述肝细胞癌症的手术条件是通过可利用的临床分期系统根据相对正常的肝功能和可处理的肿瘤损害等参数而确定。此外，进行切除术的患者通常具有高频率的转移/复发，术后5年存活率仅为30 % -40 %。肝细胞肿瘤包括不同的良性赘生物和恶性赘生物。尽管能大致地在组织学方面区分表型，这些肿瘤的临床表现和预后可以大大不同。因此，需要对这种肿瘤的早期检测以区别这些不同类型的肿瘤并使得可以对显示或怀疑具有(良性)癌前病变(pre-canceixmsstate)的患者的进行可靠的危险评估，即所述癌前状态是否将发展为癌症。癌症发展的预测可用于指导对显示肝细胞癌症类型的患者的治疗决定，并因此可明显有助于改善长期生存率。尽管近年来早期检测和手术切除肝细胞肿瘤显著改善了患者的生存率，但是大多数肿瘤在肿瘤进展期间即在非致命期仍未被早期检测出。目前，仅有一种血清标记U-甲胎蛋白，AFP)通常用于早期检测肝细胞癌症(参见例如Mizejewski，G. J. (2003)ExpertRev.Anticancer Ther. 2,709-735 ；Paul, S.B.et al. (2007)Oncology 72, Suppl.I,117-123)。然而这个标记具有低特异性，且通常由于假阳性结果而是不合适的。血清AFP检验仅在60%的患者中可易于检测出肝细胞肿瘤。另一方面，在大量的肝硬化患者中，在不存在癌症状态时AFP也可升高。因此，发现新的生物标记将会有极大的临床重要性，特别是如果这些标记使得能够在肿瘤发展的早期进行诊断从而允许癌症的早期治疗。理想的是这些标记应该能使得在恶性细胞的存在尚不能由原位技术或活组织检查或切除材料的显微镜分析检测到的阶段就能鉴定癌症。许多诊断测定也由如下事实妨碍，即它们通常是基于分析仅仅单个分子标记，这可能影响检测可靠性和/或准确度。另外，单个标记通常不能进行有关潜伏期、肿瘤发展等的详细预测。因此，仍然持续需要鉴定其它的分子标记和克服这些限制的其他测定形式。一种解决这一问题的方法可以基于小调节RNA分子，特别是微RNA(miRNA)，它们是一类进化保守的内源表达的小的非编码RNA，大小为20-25个核苷酸(nt)，可以介导靶mRNA的表达。自从它们在大约10年前被发现就被认为在细胞发育、分化、增殖和凋亡中有重要功能。miRNA是从初级转录物产生的,初级转录物被RNase III Drosha加工为莖-环结构前体(pre-miRNA)。在转运到细胞质后,另一种称为Dicer的RNase III切割pre_miRNA 发夹的环以形成短双链(ds)RNA，其中一条链作为成熟miRNA掺入miRNA-蛋白质(miRNP)中。miRNA指导miRNP到达它们的靶mRNA，在此它们发挥功能(综述参见例如Bartel，D. P. (2004) Cell 23, 281-292 ；He, L. and Hannon, G. J. (2004) Nat. Rev. Genet. 5, 522-531)。根据miRNA与其祀之间的互补性程度,miRNA可以指导不同的调节过程。与miRNA高度互补的靶mRNA通过与RNA干扰(RNAi)相同的机制被特异切割。因此，在这种情况中，miRNA的功能是作为短干扰RNA(siRNA)。与miRNA互补性较低的靶mRNA要么被指引进入细胞降解途径要么被阻遏翻译而不影响mRNA水平。但是，miRNA如何阻遏它们的靶mRNA的翻译的机制尚有争论。可获得的现有数据表明miRNA表达的调节异常(dysregulation)可能与某些类型癌症的发生和/或发展相关。例如，已表明两种miRNA，miR-15及miR-16-l定位在慢性淋巴性白血病(CLL)中缺失的遗传基因座上，并且发现在大约70%的CLL患者中，两种miRNA基因被缺失或下调。另外，在结肠直肠瘤形成中观察到miR-143及miR-145的下调，而miRNAlet-7 的表达在肺癌中经常降低(Michael,Μ. Z. et al. (2003)Mol. Cancer Res. 1,882-891 ；Mayr, C. et al. (2007) Science 315,1576—1579)。事实上，基于 miRNA 表达中的癌症相关改变和miRNA通常位于参与癌症的基因组区域的观察推测miRNA可能既作为肿瘤阻抑基因也作为癌基因(综述参见例如 Esquela-Kerscher, A. and Slack, F. J(2006)Nat. Rev.Cancer 6,259-269 ；Calin, G. A. and Croce, C. M. (2007)J. Clin. Invest. 117,2059-2066 ；Blenkiron, C. and Miska, E.A. (2007)Hum. Mol. Genet. 16, R106-R113)。更多的系统性基于珠的流式细胞术miRNA表达分析已经揭示在肿瘤中的全局性miRNA调节,表明宿主细胞的miRNA谱分析可能确实适用于癌症诊断(综述参见例如LuJ. et al. (2005)Nature 435,834-838 ；Volinia, S. et al. (2006)Proc. Natl. Acad. Sci. USA103,2257-2261)并且已经鉴定了不同miRNA，它们的表达看起来对特定肿瘤是特征性的(Calin, G. A. and Croce, C. Μ. (2007), supra)。但是，目前仅有极少数这些异常表达的miRNA与用于肿瘤发生和/或发展的临床相关的预后因子直接相关联。一些研究报导了人肝细胞癌症中miRNA表达谱分析(参见例如Murakami, Y. etal. (2006)Oncogene 25,2537-2545 ；Li, ff. et al. (2008)Int. J. Cancer 123,1616-1622 ；Huang, Y. S. et al. (2008)Hepatology 23,87-94 ；Ladeiro, Y. et al. (2008)Hepatology47，1955-1963 Jiang, J. et al. (2008)Clin. Cancer Res. 14，419-427)。同样地，这些研究示出与在非恶性肝细胞或组织相比，特异性miRNA在恶性细胞或组织中异常表达。因此，这种miRNA可提供关于涉及恶性转化的细胞过程的认识。然而，这些研究针对肿瘤组织，未分离恶性细胞。因此，40%报导的HCC相关miRNA在不同研究中示出不同(部分甚至相反的)调节模式。此外，未获得关于miRNA表达与HCC早期之间相关性的数据。因此,仍需要(一组)诊断标记，特别是“表达特征(expression signature)”或“分子足迹(molecular footprint) ”形式的诊断标记，以使得可以快速、可靠和便宜地鉴定和/或治疗显示肝细胞癌症或具有发生肝细胞癌症倾向的细胞。另外，还持续需要相应的方法以鉴定和治疗展示这种癌表型的靶细胞。发明目的和发明概述本发明的一个目的是提供通过确定多种核酸分子而诊断和/或治疗肝细胞癌症和/或发生这种病症的倾向的新方法，每种所述核酸分子编码微RNA(miRNA)序列，其中与健康对照细胞相比，所述多种核酸分子的一或多种在所分析的靶细胞中差异表达，并且其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表一种核酸表达特征，该核酸表达特征是存在肝细胞癌症或倾向发生肝细胞癌症的指征。·
更具体地，本发明的一个目的是提供用于区别不同类型的肝细胞癌症和/或肿瘤发展的不同期的组合物。另外，本发明的一个目的是提供相应的方法用于鉴定显示肝细胞癌症或具有发生肝细胞癌症倾向的一或多种哺乳动物靶细胞以及用于预防或治疗这种病症。这些及其它目的从以下描述将变得清楚，它们由独立权利要求的主题实现。本发明的一些优选实施方案由从属权利要求的主题限定。在第一方面，本发明涉及用于鉴定显示肝细胞癌症或具有发生肝细胞癌症倾向的一或多种哺乳动物靶细胞的分子标记的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一或多种在靶细胞和在一或多种对照细胞中差异表达，并且其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达特征，该核酸表达特征是存在肝细胞癌症或发生肝细胞癌症倾向的指征。本文限定的核酸表达特征可包括至少五种核酸分子，优选地至少八种核酸分子，特别优选地至少十二种核酸分子。在另一个实施方案中，本文限定的核酸表达特征可包括至少六种核酸分子，优选地至少十二种核酸分子，特别优选地至少二十种核酸分子。在具体的实施方案中，所述核酸表达特征包括至少一种编码其表达在一或多种靶细胞中与一或多种对照细胞相比被上调的微RNA序列的核酸分子；以及包括至少一种编码其表达在一或多种靶细胞中与一或多种对照细胞相比被下调的微RNA序列的核酸分子。在优选的实施方案中，所述核酸表达特征包括编码hsa-mir-221、hsa-mir-324-5p、hsa-mir-96、hsa-mir-18a、hsa-mir-18b、hsa-mir-30d、hsa-mir-331-3p、hsa-mir-183、 hsa-mir-55Ib、 hsa-mir-l39_5p、 hsa-mir-144、 hsa-mir-144* 和hsa-mir-450a的任一或多种核酸分子。特别优选地，与所述一或多种对照细胞相比，在所述一或多种靶细胞中编码hsa-mir—221、hsa-mir-324_5p、hsa-mir—96、hsa-mir_18a、hsa-mir_18b、hsa-mir_30d、hsa-mir-331-3p、hsa-mir_183和hsa-mir_551b的任一或多种核酸分子的表达被上调以及hsa-mir-139_5p、hsa-mir-144、hsa-mir-144* 和 hsa-mir_450a 的任一或多种核酸分子的
表达被下调。在本发明另外的具体实施方案中，所述诊断试剂盒进一步用于区别选自肝细胞癌和癌栓(carcinoma embolus)中的肝细胞癌症。在优选的实施方案中，所述肝细胞癌症是肝细胞癌，所述核酸表达特征包含编码 hsa-miR-224、hsa-miR-532_3p、hsa-miR-663、hsa_miR-99b、hsa-miR-362_5p、hsa-miR-652、hsa-miR-222、hsa-miR-501_3p、hsa-miR-375、hsa-miR-451 和 hsa-miR-335的任一或多种核酸分子。特别优选地，与所述一或多种对照细胞相比，在所述一或多种靶细胞中编码 hsa-miR-224、hsa-miR-532_3p、hsa-miR-663Λ hsa_miR-99b、hsa-miR-362_5p、hsa-miR-652、hsa-miR-222和hsa-miR-501_3p的任一或多种核酸分子的表达被上调以及hsaniR-375、hsaniR-451和hsaniR-335的任一或多种核酸分子的表达被下调。在其它优选的实施方案中，所述肝细胞癌症是癌栓，所述核酸表达特征包含编码 hsa-miR-199b_5p、hsa-miR-21、hsa_miR-19b、hsa-miR-103、hsa_miR-23a、hsa-miR-125b-2*、hsa-miR-30c-2*、hsa-miR-505* 和 hsa-miR-203 的任一或多种核酸分子。
特别优选地，与所述一或多种对照细胞相比，在所述一或多种靶细胞中编码hsa-miR-199b_5p、hsa-miR-21 Λ hsa_miR-19b、hsa-miR-103 和 hsa_miR-23a 的任一或多种核酸分子的表达被上调以及hsa-miR-125b-2*、hsa-miR-30c_2*、hsa-miR-505*和hsa-miR-203的任一或多种核酸分子的表达被下调。在另一个实施方案中，本文限定的核酸表达特征可包括至少六种核酸分子，优选地至少十二种核酸分子，特别优选地至少二十种核酸分子。优选地，所述核酸表达特征包括编码hsa-miR-505、hsa-miR-139_5p、hsa-miR-122*、hsa_miR-30a*、hsa_miR-30e*、hsa-miR-378* 的任一或多种核酸分子。更优选地，所述核酸表达特征包括编码hsa-miR-505、hsa-miR-139_5p、hsa-miR-122' hsa_miR-30a' hsa_miR-30e' hsa-miR-378' hsa-miR-100、hsa-miR-lOa、hsa-miR-192' hsa_miR-29c*的任一或多种核酸分子。在特别优选的实施方案中，所述核酸表达特征包括编码hsa-miR-505、hsa-miR-139_5p、 hsa-miR-122*、 hsa_miR-30a*、 hsa_miR-30e' hsa-miR-378*、hsa-miR-144' hsa-miR-378、hsa-miR-100、hsa-miR-lOa、hsa-miR-192' hsa_miR-29c'hsa-miR-194*、 hsa-miR-215、 hsa-miR-33l_3p、 hsa-miR-335、 hsa-miR-451、hsa-miR-486_5p、hsa-miR-505*、hsa-miR-542_5p 和 hsa_miR-551b 的任一或多种核酸分子。在另外特别优选的实施方案中，与所述一或多种对照细胞相比，在所述一或多种靶细胞中编码hsa-miR-331-3p和hsa_miR-551b的任一或多种核酸分子的表达被上调，以及编码hsa-miR-505、hsa-miR-139_5p、hsa-miR-122'hsa-miR-30a'hsa_miR-30e'hsa-miR-378'hsa-miR-144' hsa-miR-378、hsa-miR-100、hsa-miR-lOa、hsa-miR-192' hsa_miR-29c'hsa-miR-194' hsa-miR-215、hsa-miR-335、hsa-miR-451、hsa-miR-486_5p、hsa-miR-505*和hsa-miR-542_5p的任一或多种核酸分子的表达被下调。在另外的具体实施方案中，所述诊断试剂盒进一步用于区别选自肝细胞癌和癌栓的肝细胞癌症。在另外优选的实施方案，所述肝细胞癌症是癌栓，所述核酸表达特征包含编码 hsa-miR-505、hsa-miR-139_5p、hsa-miR-122' hsa_miR-30a' hsa_miR-30e'hsa-miR-378' hsa-miR-144' hsa-miR-378、hsa-miR-100、hsa-miR-lOa、hsa-miR-192'hsa_miR-29c*、hsa-miR-194*、hsa-miR-215、hsa-miR-33l_3p、hsa-miR-335、hsa-miR-451、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-505*、hsa-miR-542_5p和 hsa_miR-551b 的任一或多种核酸分子。特别优选地，与所述一或多种对照细胞相比，在所述一或多种靶细胞中编码hsa-miR-33l-3p和hsa_miR-551b的任一或多种核酸分子的表达被上调，以及编码hsa-miR-505、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-122*、hsa-miR-30a*、hsa-miR-30e*、hsa-miR-378*、hsa-miR-144*、hsa-miR-378、hsa-miR-100、hsa-miR-10a、hsa-miR-192*、hsa_miR-29c*、hsa-miR-194*、hsa-miR-215、hsa-miR-335、hsa-miR-451、hsa-miR-486_5p、hsa-miR-505*和hsa-miR-542_5p的任一或多种核酸分子的表达被下调。
在第二方面中，本发明涉及一种鉴定显示肝细胞癌症或具有发生肝细胞癌症倾向的一或多种哺乳动物靶细胞的方法，所述方法包括(a)在一或多种靶细胞中确定多种核酸分子的表达水平，每种核酸分子编码微RNA序列；(b)在一或多种对照细胞中确定所述多种核酸分子的表达水平 '及(C)通过比较在步骤(a)和(b)中获得的各自表达水平而从所述多种核酸分子中鉴定在靶细胞和对照细胞中差异表达的一或多种核酸分子，其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表了本文限定的核酸表达特征，该核酸表达特征是存在肝细胞癌症或发生肝细胞癌症倾向的指征。在本发明的优选的实施方案中，所述方法进一步用于区别选自肝细胞癌和癌栓的肝细胞癌症。在第三方面，本发明涉及在一或多种哺乳动物靶细胞中预防或治疗肝细胞癌症的方法，所述方法包括(a)用本文限定的方法在一或多种靶细胞中鉴定核酸表达特征；和
(b)在所述一或多种细胞中修饰包含在所述核酸表达特征中的编码微RNA序列的一或多种核酸分子的表达，以使得其表达在一或多种靶细胞中被上调的核酸分子的表达被下调以及其表达在一或多种靶细胞中被下调的核酸分子的表达被上调。在第四方面，本发明涉及用于在一或多种哺乳动物靶细胞中预防和/或治疗肝细胞癌症的药物组合物，所述组合物包含一或多种核酸分子，每种核酸分子编码一序列，所述序列与本文限定的其表达在一或多种靶细胞中被上调的核酸分子编码的微RNA序列至少部分互补，和/或所述序列相应于本文限定的其表达在一或多种靶细胞中被下调的核酸分子编码的微RNA序列。最后，在第五方面，本发明涉及所述药物组合物在制备用于预防和/或治疗肝细胞癌症的药物中的应用。本发明的其它实施方案从以下详细描述中将变得明了。附图
简述图I示出包含在本发明的特别优选的表达特征中的人类miRNA，所述表达特征分别用于鉴定显示肝细胞癌症或具有发生肝细胞癌症(即肝细胞癌和癌栓)倾向的一或多种靶细胞以及区别肝细胞癌和癌栓。图中还示出与(健康)对照组织相比，在癌组织中这些miRNA的表达水平(REG为调控)(即上调或下调)。图2描绘了流程图，示意性示出用于确定本发明的表达特征的关键方法步骤，所述表达特征用于鉴定显示肝细胞癌症或具有发生肝细胞癌症倾向的一或多种靶细胞。图3图示鉴定的miRNA在肝细胞肝癌(HCC)和癌栓(CE)发展过程中的表达水平。图4示出无监督差异表达miRNA的聚类分析并显示聚类将31/31个正常-硬化样本置于一组，将29/32个肝细胞肝癌-癌栓置于另一组。图5显示各个miRNA在芯片分析中的PAM分数，分数对应于各自的预测能力。最少2种miRNA (hsa-miR-139-5p和hsa-miR-101)可以区分正常_硬化和肝细胞肝癌_癌检，准确率为89%。hsa-miR-139-5p是肝细胞肝癌中另一种鉴定的miRNA。发明详细描述本发明基于如下出乎意料的发现，即显示肝细胞癌症或具有发生肝细胞癌症(HCC)的倾向的细胞可以基于特定的miRNA表达特征以高准确度、灵敏度和特异性被可靠地鉴定并区别不同类型的HCC，其中所述表达特征如本文定义通常包括被上调和下调的人类miRNA。更具体地，所述miRNA表达特征一通过分析整体miRNA表达模式和/或各个miRNA表达水平一使得能检测早期疾病状态下的HCC以及评价良性癌前状态转化为恶性癌症的风险。以下例证的本发明可以合适地在不存在未在本文中具体揭示的任何一或多个元·件、一或多种限制的条件下实施。本发明将根据特定的实施方案并参照附图加以描述，但是本发明不受其限制，仅受权利要求书限制。所描述的附图仅是示意性的，被认为是非限制性的。当术语“包含”被用于本发明说明书和权利要求书中时，其不排除其它元件或步骤。为本发明目的，术语“由……组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中组被限定为包含至少一定数目的实施方案，这也被理解为揭示了优选地仅由这些实施方案组成的组。当指代单数形式名词使用不定冠词或定冠词例如“一(a)”或“一(an)”，“所述(the) ”时，包括该名词的复数形式，除非特别指出。术语“大约”在本发明中是指本领域技术人员理解仍能保证目的特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10%，优选±5%。另外，术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(C)等在说明书和权利要求书中用于区分类似的元件，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解如此应用的术语在合适情况下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本文所述或例证的其它顺序操作。术语的进一步定义在以下使用术语时给出。以下术语或定义仅为了理解本发明而提供。这些定义不应被认为具有小于本领域技术人员理解的范围。在第一方面，本发明涉及鉴定显示肝细胞癌症或具有发生肝细胞癌症倾向的一或多种哺乳动物靶细胞的分子标记的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列，其中所述多种核酸分子的一或多种在靶细胞和在一或多种对照细胞中差异表达，并且其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表一种核酸表达特征，该核酸表达特征是存在肝细胞癌症或发生肝细胞癌症倾向的指征。本文所用术语“癌症”(也称为“癌(carcinoma) ”)通常指任何类型的恶性赘生物，即与未受影响的(健康)野生型对照细胞相比显示癌特征或具有发生癌特征倾向的靶细胞的任何形态学和/或生理学改变(基于遗传重编程(genetic re-programming))。这种改变的例子可涉及细胞大小和形状(变大或变小)、细胞增殖(细胞数增加)、细胞分化(生理学状态变化)、凋亡(程序性细胞死亡)或细胞存活。
本文所用术语“肝细胞(hepatocellular) ”(或肝的(hepatic))涉及肝脏。因此，术语“肝细胞癌症”是指在肝脏的癌性生长。本文所用术语“具有发生癌症倾向”是指任何是癌前状态即正常细胞转化为肿瘤细胞过程中的中间状态的指征的细胞表型。换句话说，该术语是指发生癌症的风险的状态。最常见类型的肝细胞(肝脏)癌症是肝细胞癌(也称作肝癌，通常缩写为HCC)。本文所用术语“肝细胞癌”是指原发的肝脏恶性肿瘤。大多数HCC继发于病毒性肝炎感染(乙型肝炎或丙型肝炎)或者肝硬化(酒精中毒是导致肝硬化的最常见因素)。在肝炎不是地方病的国家中，大多数肝脏恶性癌症不是原发HCC，而是从机体其它部位例如结肠的癌症转移(传播)。HCC的治疗选择和预后依赖于许多因素，但是特别依赖于肿瘤大小和分期。肿瘤级别(tumor grade)也是重要的。高级别(high-grade)肿瘤预后不佳,而低级别 (low-grade)肿瘤也许可被忽视很多年。通常结果不佳是因为仅10% -20%的肝细胞癌通过手术可完全切除。如果癌症不能被完全切除，则该疾病通常在3-6个月内是致命的。肝细胞癌与任何其它癌症一样，当存在引起细胞高速复制和/或导致细胞避免凋亡的分子机制突变时而发生。特别地，乙型肝炎和/或丙型肝炎的慢性病毒感染通过重复导致机体自身免疫系统攻击肝细胞(其中一些被病毒感染，其它的仅是旁观者)而可助于肝细胞癌的发生。而这种损伤之后修复的恒定循环可导致修复期间的错误，随之导致癌发生，但是目前这种假说更适用于丙型肝炎。然而，在乙型肝炎中，病毒基因组整合进感染的细胞中是恶性肿瘤中最一致相关的因素。另外，重复大量饮酒可具有相似作用。因此，在本发明范围中，乙型肝炎和/或丙型肝炎感染或者肝硬化不仅被认为是肿瘤病因学的危险因素，而且还是肿瘤发展的早期/中间期(即“癌前病变)，其与导致(通常为良性)非侵袭性赘生物的过度增殖性组织生长(随之可发展为恶性肿瘤如HCC)相关。这种恶性肿瘤侵袭其它组织并在时间足够时经常发生转移。恶性细胞通常特征在于进展性(progressive)和不受控制的生长。肉眼观察HCC看起来是结节性或侵润性肿瘤。结节型肿瘤可以是单发性(具有大团)或多发性(当发展为硬化并发症时)。肿瘤结节为圆形至椭圆形，边界清楚但无包膜。弥漫型边界不清，且侵润门静脉，很少侵润肝静脉。恶性肿瘤可以局部传播(以转移形式)或者通过血流和淋巴系统传播到机体其它部位。由于肝脏的双重血液供应(肝脏通过肝动脉和门静脉接受血液)，因此是转移的常见部位。因此，肿瘤组织(转移)可形成栓子，即从机体的一个部位迁移(通过循环)的物体并导致机体另一部位的血管阻塞(闭塞)。这种得自肿瘤栓塞的继发肝细胞肿瘤在本文称作“癌栓”。本发明中采用的哺乳动物靶细胞可以是人或非人类来源的。然而，本发明通常用人类细胞进行。本文所用术语“一或多种细胞”应被理解为不仅包括个体细胞，也包括组织、器官和生物体。本文所用术语“靶细胞”是指被至少认定是显示肝细胞癌症或具有发生肝细胞癌症倾向的细胞，而术语“对照细胞”典型地是指不具有这种癌表型特征的(健康)野生型细胞。但是在一些应用中，例如当比较显示不同癌或癌前状态的细胞时，具有不太严重的疾病特征的细胞典型地被认为是“对照细胞”。通常，所用的靶细胞和对照细胞衍生自从待诊断是否存在肝细胞癌症或发生肝细胞癌症倾向的对象中收集的生物学样品。另外，为了确证获得的数据，“比较样品”也可以从患有给定已知疾病状态的对象中收集。生物学样品可包括机体组织和液体，如血液、痰和尿。另外，生物学样品可含有衍生自肝细胞的细胞提取物或包括肝细胞的细胞群，所述肝细胞优选是癌性肝细胞或衍生自怀疑是癌性的组织的肝细胞。还更优选地，生物学样品包含衍生自肝组织的细胞群。另外，如果需要，细胞可以从获得的机体组织和液体中纯化，然后用作生物学样品。根据本发明，本发明的核酸标记的表达水平在对象衍生的生物学样品中确定。在本发明的体外方法中用于检测的样品通常应以临床可接受的方式收集，优选以保护核酸(特别是RNA)或蛋白质的方式收集。待分析的样品通常是肝活组织检查样品或切除物。另外，肝细胞癌细胞可迁移进其它组织。因此，血液及其它类型样品也可以使用。活组织检查样品或切除物可含有仅少部分的癌(前)细胞。为增加信号/背景比，切除物可以在分析之前分成不同的亚样品(例如，通过激光捕获显微切割)。即使活组织检查样品或切除物中的癌细胞总数有限，至少一个亚样品可含有增加的癌(前)对非癌细胞比率。样品特别在最初加工之后可以合并。但是也可以使用未合并的样品。 本文所用术语“微RNA”(或“miRNA”)是其在本领域的普通含义(综述参见例如Bartel, D. P. (2004)Cell 23, 281-292 ；He, L. and Hannon, G. J. (2004)Nat. Rev. Genet. 5,522-531)。因此，“微RNA”是指衍生自基因组基因座的RNA分子，其从可以形成局部RNA前体miRNA结构的转录物加工而来。成熟miRNA通常长度为20、21、22、23、24或25个核苷酸，其它数目的核苷酸也可存在，例如18、19、26或27个核苷酸。miRNA编码序列具有与侧翼基因组序列配对的潜力，使成熟miRNA放置在非完全配对的RNA双链体之内(本文也称作茎-环或发夹结构或pre-miRNA)，所述双链体作为从更长的前体转录物进行miRNA加工的中间体。这一加工典型地通过分别称为Drosha和Dicer的两种特异的内切核酸酶的连续作用而发生。Drosha从初级转录物(本文也称作“pri-miRNA”)产生通常折叠成发夹或茎-环结构的miRNA前体(本文也称作“pre-miRNA”)。从这个miRNA前体，通过Dicer切割miRNA双链体，其在发夹或茎-环结构的一条臂包含成熟miRNA，在另一条臂包含类似大小的节段(通常称为miRNA*)。miRNA然后被导向其祀mRNA以发挥其功能,而miRNA*被降解。另外，miRNA通常衍生自与预测的蛋白质编码区不同的基因组节段。本文所用术语“miRNA前体”(或“前体miRNA”或“pre-miRNA” )是指从其加工出成熟miRNA的miRNA初级转录物的部分。通常,pre-miRNA折叠成稳定的发夹(即双链体)或茎-环结构。发夹结构典型地长度为50-80个核苷酸，优选60-70个核苷酸(计数miRNA残基，与miRNA配对的残基，及任何间插节段，但排除更远端的序列)。本文所用术语“编码微RNA序列的核酸分子”是指编码微RNA (miRNA)的任何核酸分子。因此，该术语不仅指成熟miRNA,也指相应的如上所述的前体miRNA及初级miRNA转录物。另外，本发明不限于RNA分子，也包括相应的编码微RNA的DNA分子，例如通过逆转录miRNA序列产生的DNA分子。编码本发明的微RNA序列的核酸分子通常编码单个miRNA序列(即个体miRNA)。但是，也可能这种核酸分子编码两个或多个miRNA序列(即两个或多个miRNA)，例如一个转录单位包含在常用调节序列如启动子或转录终止子控制下的两个或多个miRNA序列。本文所用术语“编码微RNA序列的核酸分子”也被理解为包括“有义核酸分子”(即核酸序列(5' —3')匹配或相应于所编码的miRNA(5' —3')序列的分子)及“反义核酸分子”(即核酸序列互补于所编码的miRNA(5' —3')序列或者换句话说匹配所编码的miRNA序列的反向互补序列(3' —5,)的分子)。本文所用术语“互补”是指“反义”核酸分子序列与相应的“有义”核酸分子序列(具有互补于反义序列的序列)形成碱基对、优选Watson-Crick碱基对的能力。在本发明范围内，两种核酸分子(即“有义”和“反义”分子)可以完全互补，即它们不含有任何碱基错配和/或额外的或缺失的核苷酸。或者，两种分子包含一或多个碱基错配或者在它们的核苷酸总数上不同(由于添加或缺失)。优选地，“互补”核酸分子包含与包含在相应的“有义”核酸分子中的序列显示完全互补性的至少10个连续核苷酸。因此，包含在本发明的 诊断试剂盒中的编码miRNA序列的多种核酸分子可包括一或多种“有义核酸分子”和/或一或多种“反义核酸分子”。当诊断试剂盒包括一或多种“有义核酸分子”(即miRNA序列本身)时，所述分子被认为组成了差异表达的miRNA(即分子标记)的全体或至少亚组，所述差异表达的miRNA是存在或发生特定病症倾向的指征，本文是肝细胞癌症。另一方面，当诊断试剂盒包括一或多种“反义核酸分子”(即与miRNA序列互补的序列)时，所述分子可包含适合用于检测和/或定量给定样品中的一或多种特定(互补)miRNA序列的探针分子(用于进行杂交测定)和/或寡核苷酸引物(例如用于逆转录或PCR应用)。在本发明中定义的多种核酸分子可以包含至少2种、至少10种、至少50种、至少100种、至少200种、至少500种、至少1000种、至少10000种或至少100000种核酸分子，每种分子编码miRNA序列。本文所用术语“差异表达”是指特定miRNA在靶细胞中的表达水平相比于健康对照细胞是改变的，其可以是上调(即在靶细胞中miRNA浓度增加)或下调(即在靶细胞中miRNA浓度降低或消失)。换句话说，核酸分子在靶细胞中被激活至比在对照细胞中更高或更低的水平。在本发明范围内，核酸分子被认为是差异表达的，如果该核酸分子在靶细胞和对照细胞中的相应表达水平典型地相差至少5%或至少10%，优选地至少20%或至少25%，最优选地至少30%或至少50%。因此，后者的值相应于给定核酸分子在靶细胞中的表达水平相比于野生型对照细胞分别上调至少I. 3倍或至少I. 5倍，或者反之在靶细胞中的表达水平下调至少O. 7倍或至少O. 5倍。本文所用术语“表达水平”是指特定的miRNA序列从其基因组基因座被转录的程度，即miRNA在一或多种被分析细胞中的浓度。如上所述，术语“对照细胞”典型地是指不具有HCC表型特征的(健康)野生型细胞。但是，在一些应用中，例如当比较显示不同的癌或癌前状态的细胞时，具有较不严重疾病特征的细胞通常被认为是“对照细胞”。表达水平的确定通常遵循本领域熟知的已建立的标准程序(参见例如Sambrook，J. et al. (1989)Molecular Cloning A Laboratory Manual. 2nd Ed., Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, NY ；AusubeI, F. M. et al. (2001)CurrentProtocols in Molecular Biology. Wiley & Sons, Hoboken, NJ)。确定可以在 RNA 水平进行，例如使用miRNA特异性探针进行Northern印迹分析,或者在逆转录(及克隆)RNA群后例如通过定量PCR或实时PCR技术在DNA水平进行。本文所用术语“确定”包括分析编码上述微RNA序列的任何核酸分子。但是，由于pri-miRNA及re-mRNA半衰期短，通常仅测量成熟miRNA的浓度。在特异的实施方案中，在给定样品的若干独立测量(例如两个、三个、五个或十个测量)和/或在一群靶细胞或对照细胞内的若干测量中获得的表达水平的标准值被用于分析。标准值可以用本领域已知的任何方法获得。例如，平均值±2SD(标准差)或平均值±3SD的范围可被用作标准值。所获得的一或多种靶细胞和一或多种对照细胞的表达水平之间的差异可以归一化至进一步的对照核酸例如管家基因的表达水平，管家基因的表达水平已知不根据细胞的疾病状态而不同。举例的管家基因包括肌动蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和核糖体蛋白Pl等。在优选的实施方案中，对照核酸是已知在细胞的不同非癌和癌(前)状态中稳定表达的另一种miRNA。但是，也可以基于实验证据和/或现有技术数据定义针对特定细胞表型(即疾病状态)的一或多个截断(CUt-OfT)值，代替在任何实验中确定一或多种对照细胞的表达水 平。在这种情况中，一或多种靶细胞的相应表达水平可以用用于归一化的稳定表达的对照miRNA确定。如果计算的“归一化”的表达水平高于相应定义的截断值，则这一发现是基因表达上调的指征。反之，如果计算的“归一化”的表达水平低于相应定义的截断值，则这一发现是基因表达下调的指征。在本发明中，术语“鉴定显示肝细胞癌症或具有发生肝细胞癌症倾向的一或多种哺乳动物靶细胞”也包括预测和可能性分析(“诊断”意义上)。本文公开的组合物和方法意在临床应用，以决定治疗形式，包括治疗性干预，诊断标准如疾病阶段，和疾病监控和疾病监视。根据本发明，可提供用于检查对象状态的中间结果。这种中间结果可与额外信息组合以帮助医生、护士或其它从业人员诊断出该对象患有该疾病。或者，本发明可用于检测对象衍生组织中的癌细胞，并提供有用信息给医生以进行诊断。另外，本发明还用于区别不同类型的肝细胞肿瘤。在本发明中，所鉴定的一或多种差异表达的核酸分子一起代表一种核酸表达特征，该核酸表达特征是在靶细胞中存在肝细胞癌症或发生肝细胞癌症倾向的指征。本文所用术语“表达特征”是指一组核酸分子(例如miRNA)，其中各个核酸分子的表达水平在(癌性)靶细胞和(非癌性)对照细胞之间不同。本文中，核酸表达特征也指一组标记并代表最低数目的(不同)核酸分子，每种核酸分子编码能鉴定靶细胞的表型状态的miRNA序列。在具体的实施方案中，核酸表达特征包含至少五种核酸分子，每种编码(不同的)miRNA序列。优选地，核酸表达特征包含至少八种或至少十种(不同的)核酸分子。特别优选地，核酸特征包含至少十二种或至少十五种(不同的)核酸分子。通常，包含在核酸表达特征中的核酸分子是人类序列(以后称为“hsa”(Homosapiens))。在进一步优选的实施方案中，核酸表达特征包含至少一种编码其表达在一或多种靶细胞中与一或多种对照细胞相比被上调(即其浓度增加)的miRNA序列的核酸分子；以及包含至少一种编码其表达在一或多种靶细胞中与一或多种对照细胞相比被下调(即其浓度降低)的miRNA序列的核酸分子。在本发明的优选的实施方案中，诊断试剂盒的核酸表达特征包含任何一或多种编码选自如下一组的微RNA序列的人类靶细胞衍生的核酸分子，所述的组由hsa-mir-221(SEQ ID NO :1)、hsa-mir-324_5p(SEQ ID NO :2)、hsa-mir-96(SEQ ID NO :3)、hsa-mir-18a(SEQ ID NO :4)、hsa-mir_18b (SEQ ID NO :5)、hsa-mir_30d (SEQ ID NO :6)、hsa-mir-331-3p(SEQ ID NO 7), hsa-mir-183 (SEQ ID NO 8), hsa-mir-55 Ib (SEQ ID NO:9)、hsa-mir-139-5p(SEQ ID NO 10) ,hsa-mir-144 (SEQ ID NO 11) ,hsa-mir-144* (SEQ IDNO 12)和 hsa-mir-450a(SEQ ID NO :13)组成。上述miRNA的核酸序列列于表I。表I
权利要求
1.用于鉴别显示肝细胞癌症或具有发生肝细胞癌症倾向的一或多种哺乳动物靶细胞的分子标记的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码微RNA序列， 其中所述多种核酸分子的一或多种在所述靶细胞和在一或多种对照细胞中差异表达，及 其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达特征，所述核酸表达特征是存在肝细胞癌症或倾向发生肝细胞癌症的指征。
2.权利要求I的试剂盒，其中所述核酸表达特征包含至少六种核酸分子，优选至少十二种核酸分子，以及特别优选至少二十种核酸分子。
3.权利要求I或2的试剂盒，其中所述核酸表达特征包含至少一种编码其表达在一或多种靶细胞中与在一或多种对照细胞中相比被上调的微RNA序列的核酸分子；及包含至少一种编码其表达在一或多种靶细胞中与一或多种对照细胞中相比被下调的微RNA序列的核酸分子。
4.权利要求1-3任一项的试剂盒，其中所述核酸表达特征包含编码hsa-miR-505、hsa-miR-139_5p、hsa-miR-122*、hsa_miR-30a*、hsa_miR-30e*、hsa-miR-378* 的任一或多种核酸分子。
5.权利要求1-3任一项的试剂盒，其中所述核酸表达特征包含编码hsa-miR-505、hsa-miR-139_5p、 hsa-miR-122*、 hsa_miR-30a*、 hsa_miR-30e' hsa-miR-378*、hsa-miR-144*、hsa-miR-378、hsa-miR-100、hsa-miR-10a、hsa-miR-192*、hsa-miR-29c* 的任一或多种核酸分子。
6.权利要求1-3任一项的试剂盒，其中所述核酸表达特征包含编码hsa-miR-505、hsa-miR-139_5p、 hsa-miR-122*、 hsa_miR-30a*、 hsa_miR-30e' hsa-miR-378*、hsa-miR-144' hsa-miR-378、hsa-miR-lOO、hsa-miR-lOa、hsa-miR-192' hsa_miR-29c'hsa-miR-194*、 hsa-miR-215、 hsa-miR-33l_3p、 hsa-miR-335、 hsa-miR-451、hsa-miR-486-5p、hsa-miR-505*、hsa-miR-542_5p和 hsa_miR-551b 的任一或多种核酸分子。
7.权利要求6的试剂盒，其中与在一或多种对照细胞中相比，在所述一或多种靶细胞中编码hsa-miR-33l_3p和hsa_miR-551b的任一或多种核酸分子的表达被上调，而hsa-miR-505、hsa-miR-139_5p、hsa-miR-122'hsa-miR-30a'hsa_miR-30e'hsa-miR-378'hsa-miR-144' hsa-miR-378、hsa-miR-100、hsa-miR-lOa、hsa-miR-192' hsa_miR-29c'hsa-miR-194' hsa-miR-215、hsa-miR-335、hsa-miR-451 Λ hsa-miR-486_5p、hsa-miR-505*和hsa-miR-542_5p的任一或多种核酸分子的表达被下调。
8.权利要求1-7的试剂盒，其进一步用于区别选自肝细胞癌和癌栓的肝细胞癌症。
9.权利要求1-8的试剂盒，其中所述肝细胞癌症是癌栓，并且 其中所述核酸表达特征包含编码hsa-miR-505、hsa-miR-139_5p、hsa-miR-122'hsa_miR-30a' hsa_miR-30e' hsa-miR-378' hsa-miR-144' hsa-miR-378、hsa-miR-100、hsa-miR-10a、hsa-miR-192'hsa-miR-29c'hsa_miR-194'hsa-miR-215、hsa-miR-331_3p、hsa-miR-335、 hsa-miR-451、 hsa-miR-486_5p、 hsa-miR-505' hsa-miR-542_5p 和hsa-miR-551b的任一或多种核酸分子。
10.权利要求9的试剂盒，其中与在一或多种对照细胞中相比，在所述一或多种靶细胞中编码hsa-miR-331-3p和hsa-miR-551b的任一或多种核酸分子的表达被上调，而hsa-miR-505、hsa-miR-139-5p、hsa-miR-122*、hsa-miR-30a*、hsa-miR-30e*、hsa-miR-378*、hsa-miR-144*、hsa-miR-378、hsa-miR-100、hsa-miR-lOa、hsa-miR-192*、hsa_miR-29c*、hsa-miR-194*、hsa-miR-215、hsa-miR-335、hsa-miR-451、hsa-miR-486_5p、hsa-miR-505*和hsa-miR-542_5p的任一或多种核酸分子的表达被下调。
11.用于鉴别显示肝细胞癌症或具有发生肝细胞癌症倾向的一或多种哺乳动物靶细胞的方法，所述方法包括 (a)在所述一或多种靶细胞中确定多种核酸分子的表达水平，每种核酸分子编码微RNA序列； (b)在一或多种对照细胞中确定所述多种核酸分子的表达水平；及 (c)通过对比在步骤(a)和(b)中获得的各自的表达水平，从所述多种核酸分子中鉴别在所述靶细胞和对照细胞中差异表达的一或多种核酸分子， 其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表如权利要求1-10任一项定义的核酸表达特征，所述核酸表达特征是存在肝细胞癌症或倾向发生肝细胞癌症的指征。
12.权利要求11的方法，其进一步用于区别选自由肝细胞癌和癌栓的肝细胞癌症。
13.用于在一或多种哺乳动物靶细胞中预防或治疗肝细胞癌症的方法，所述方法包括 (a)通过使用权利要求11或12的方法在一或多种靶细胞中鉴别核酸表达特征'及 (b)修饰所述一或多种细胞中包含在核酸表达特征中的编码微RNA序列的一或多种核酸分子的表达，由此其表达在所述一或多种靶细胞中被上调的核酸分子的表达被下调，而其表达在所述一或多种靶细胞中被下调的核酸分子的表达被上调。
14.用于预防和/或治疗一或多种哺乳动物靶细胞中的肝细胞癌症的药物组合物，所述组合物包含一或多种核酸分子，每种核酸分子编码一序列，所述序列与如权利要求1-10任一项所定义的其表达在所述一或多种靶细胞中被上调的核酸分子编码的微RNA序列至少部分互补，和/或所述序列相应于如权利要求1-10任一项所定义的其表达在所述一或多种靶细胞中被下调的核酸分子编码的微RNA序列。
15.权利要求14的药物组合物在制备预防和/或治疗肝细胞癌症的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及肝细胞癌症的微RNA(miRNA)表达谱分析的组合物和方法。特别地，本发明涉及用于鉴别显示肝细胞癌症或具有发生肝细胞癌症倾向的一或多种哺乳动物靶细胞的分子标记的诊断试剂盒，所述试剂盒包含多种核酸分子，每种核酸分子编码miRNA序列，其中所述多种核酸分子的一或多种在靶细胞中及在一或多种对照细胞中差异表达，且其中所述一或多种差异表达的核酸分子一起代表核酸表达特征，所述核酸表达特征是存在肝细胞癌症或倾向发生肝细胞癌症的指征。本发明进一步涉及使用这种核酸表达特征鉴别显示肝细胞癌症或具有发生肝细胞癌症倾向的一或多种哺乳动物靶细胞以及预防或治疗这种病症的相应方法。最后，本发明涉及预防和/或治疗肝细胞癌症的药物组合物。
文档编号C12Q1/68GK102985558SQ200980150551
公开日2013年3月20日 申请日期2009年11月13日 优先权日2008年11月13日
发明者吴莹, 朱虹光, 王磊, 王漱阳 申请人:复旦大学