专利名称：抗pcsk9的高亲和力人抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及与人类前蛋白转化酶枯草溶菌素9 (PCSK9)特异性结合的人抗体和人抗体的抗原结合片段，以及使用这些抗体的治疗方法。
关于相关技术的陈述前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)是一种前蛋白转化酶，属于分泌的枯草杆菌酶家族的蛋白酶K亚族。该编码蛋白是作为可溶性酶原合成的，在内质网中经过自身催化分子内加工。证据显示，PCSK9促进LDL受体的降解从而增加血浆中LDL胆固醇含量，而 LDL受体介导肝内的LDL胞吞过程，后者是从循环系统清除LDL的主要途径。PCSK9蛋白的结构显示，它具有一个信号序列、接着是一个前结构域、一个含有保守三元残基(D186、H2^5 和S386)的催化结构域，以及一个C端结构域。它是作为可溶性74-kDa前体合成的，在内质网中经过自身催化裂解而产生一个14-kDa前结构域和60-kDa催化片段。业已显示该自身催化活性是分泌过程所需要的。裂解之后，上述前结构域保持与催化结构域紧密相连的状态。PCSK9 的抗体在例如 WO 2008/057457、WO 2008/057458、WO 2008/057459、WO 2008/063382、WO 2008/125623 以及 US2008/0008697 等专利中均有述及。
发明概要在第一个方面，本发明提供了一些与人PCSK9(hPCSK9)特异性结合且中和其活性的完全人单克隆抗体(mAbs)及其抗原结合片段。在一个实施方案中，本发明包括一种与hPCSK9特异性结合的抗体或抗体的抗原结合片段，并至少具有以下一个特征
(i)相对于给药前水平，能够使血清总胆固醇含量下降至少约25至35%并保持这种下降趋势达至少M天，较佳的是使血清总胆固醇含量下降至少约30至40% ；
(i)相对于给药前水平，能够使血清LDL胆固醇含量下降至少约65至80%并保持这种下降趋势达至少对天；
(iii)相对于给药前水平，能够使血清甘油三酯含量下降至少约25至40%；
(iv)不降低血清HDL胆固醇含量，或相对于给药前水平，降低血清HDL胆固醇含量不超过5%。在一个实施方案中，本发明包括一种与hPCSK9特异性结合的抗体或抗体的抗原结合片段，并至少具有以下一个特征
(i)相对于给药前水平，能够使血清LDL胆固醇含量下降至少约40至70%并保持这种下降趋势达至少60天或90天；
( )相对于给药前水平，能够使血清甘油三酯含量下降至少约25至40% ； (iii)不降低血清HDL胆固醇含量，或相对于给药前水平，降低血清HDL胆固醇含量不超过5%。在一个实施方案中，该抗体或其片段的特征是与包含hPCSK9(SEQ ID NO :755)的氨基酸残基238的表位结合。在一个较特殊的实施方案中，该抗体或其片段与包含 hPCSK9 (SEQ ID NO :755)的一个或一个以上氨基酸残基238、153、159和；343的表位结合。 在一个较特殊的实施方案中，该抗体或其片段的特征是与在SEQ ID NO :755的192、194、 197和/或237位置不含氨基酸残基的表位结合。在一个实施方案中，该抗体或其片段的特征是与包含hPCSK9 (SEQ ID NO :755)的氨基酸残基366的表位结合。在一个较特殊的实施方案中，该抗体或其片段与在SEQ ID NO 755的147、366和380位置包含一个或一个以上氨基酸残基的表位结合。在一个较特殊的实施方案中，该抗体或其片段的特征是，在SEQ ID NO :755的215和/或238位置与不含氨
基酸残基的表位结合。在一个实施方案中，该抗体或其片段的特征是，经表面等离子体共振技术测量，相对于PH 7. 4条件下的结合亲和力(Kd)，在pH 5. 5条件下显示与hPCSK9的结合亲和力Kd增强。在一个特殊的实施方案中，经表面等离子体共振技术测量，该抗体或其片段在酸性PH 条件下与PCSK9的结合亲和力比在中性pH条件下增强至少20倍、至少40倍或至少50倍。在一个实施方案中，该抗体或其片段的特征是，经表面等离子体共振技术测量，未显示在酸性pH条件下与PCSK9的结合亲和力比在中性PH条件下有所增强。在一个特殊的实施方案中，与中性PH条件相比，酸性pH条件下的结合力较小且T1/2较短。在另一个实施方案中，该抗体或抗原结合片段与人、人GOF突变D374Y、猕猴、恒河猴、小鼠、大鼠以及仓鼠的PCSK9结合。在一个实施方案中，该抗体或抗原结合片段与人和猴的PCSK9结合，但不与小鼠、 大鼠或仓鼠的PCSK9结合。这些mAbs抗体可以是全长的(例如IgGl或IgG4抗体)，或可仅包含一个抗原结合部分(例如Fab、F(ab’)2或scFv片段)，并可加以修饰以影响其功能，例如消除残余的效应子功能(Reddy et al. (2000) J. Immunol. 164 :1925-1933)。在一个实施方案中，本发明包括一种抗体或抗体的抗原结合片段，其包含一个选自下列一组序列的重链可变域(HCVR) =SEQ ID NO :2、18、22、26、42、46、50、66、70、74、90、 94、98、114、118、122、138、142、146、162、166、170、186、190、194、210、214、218、234、238、 242、258、262、266、282、286、290、306、310、314、330、334、338、354、358、362、378、382、386、 402、406、410、426、430、434、450、454、458、474、478、482、498、502、506、522、526、530、546、 550、554、570、574、578、594、598、602、618、622、626、642、646、650、666、670、674、690、694、 698、714、718、722、738和742，或一种与其实质上相似具有至少90%、至少95%、至少98% 或至少99 %序列同一性的序列。在一个实施方案中，该HCVR是一个选自下列一组序列的氨基酸序列:SEQ ID NO :50、66、70、74、90、94、122、138、142、218、234、238、M2、258J62、314、 330和334。在一个较特殊的实施方案中，该HCVR包含SEQ ID NO :90或218。在一个实施方案中，该抗体或其片段进一步包含一个选自下列一组序列的轻链可变域(LCVR) =SEQ ID NO :10、20、24、34、44、48、58、68、72、82、92、96、106、116、120、130、 140、144、154、164、168、178、188、192、202、212、216、226、236、240、250、260、264、274、284、 288、298、308、312、322、332、336、346、356、360、370、380、384、394、404、408、418、428、432、 442、452、456、466、476、480、490、500、504、514、524、528、538、548、552、562、572、576、586、 596、600、610、620、624、634、644、648、658、668、672、682、692、696、706、716、720、730、740 和744，或一种与其实质上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列。在一个实施方案中，该LCVR是一个选自下列一组序列的氨基酸序列SEQ ID NO :58、 68、72、82、92、96、130、140、144、226、236、240、250、260、264、322、332 和 336。在一个较特殊的实施方案中，该LCVR包含SEQ ID NO :92或226。 在一个特殊的实施方案中，该抗体或其片段包含一个选自下列一组序列的HCVR 和 LCVR(HCVR/LCVR)序列对SEQ ID NO :2/10、18/20、22/24、26/34、42/44、46/48、50/58、
66/68,70/'12,74/82>90/'92,94/96,.98/106、114/116、118/120、122/130、138/140,142/'144、146/'154,162；/164、166//168,170/'178,186/'188,190/'192,194/'202,210/'212、214/'216、218/'226、234,/236、238；/240,242/'250,258/,260、262/,264、266/''274,282/'284、286/'288、290/,298、306,/308、310,/312,314/'322,330//332,334//336,338//346,354/'356、358/'360、362/,370、378,/380、382,/384,386/,394、402//404,406；/408,410；/418,426/'428、430/'432、434；/442、450,/452、454,/456,458//466,474,/476,478,/480,482,/490,498/'500、,502/,504、506,/514、,522/524、526,/528,530；/538,546,/548,550/'552,554/'562,570/'572、574/'576、578/'586,594,/596、598；/600,602/'610,618/'620,622/,624、626/'634,642/'644、646/'648、650/,658、666,/668、670,/672,674/'682,690/,692、694//696,698//706,714/'716、718/'720、722/730,738/740 和 742/744。在-一个实施方案中，该HCVR和LCVR是一对选自下列一组
序列对的氨基酸序列对:SEQ ID NO 50/58、66/68、70/72、74/82、90/92、94/96、122/130、 138/140、142/144、218/226、234/236、238/240、242/250、258/260、262/264、314/322、 330/332和334/336。在一个较特殊的实施方案中、该HCVR/LCVR序列对包含SEQ ID NO: 90/92 或 218/226o在第二个方面，本发明的特点是有一种抗体或抗体的抗原结合片段，其包含一个选自下列一组序列的重链 CDR3(HCDR3)域SEQID NO :8、32、56、80、104、128、152、176、200、 224、248、272、296、320、344、368、392、416、440、464、488、512、536、560、584、608、632、656、 680,704和728，或一种与其实质上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99% 序列同一性的序列；以及一个选自下列一组序列的轻链⑶R30XDR3)域SEQ ID NO 16, 40、64、88、112、136、160、184、208、232、256、280、304、328、352、376、400、424、448、472、496、 520、544、568、592、616、640、664、688、712和736，或一种与其实质上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列。在一个实施方案中，该HCDR3/IXDR3序列对是 SEQ ID NO :56/64、80/88、128/136、2M/232、248/256 或 320/3沘。在一个较特殊的实施方案中，该 HCDR3/LCDR3 包含 SEQ ID NO :80/88 或 224/232。在一个进一步的实施方案中，本发明包括一种抗体或抗体的抗原结合片段，其包含一个选自下列一组序列的重链 CDRl (HCDRl)域SEQ ID NO :4、28、52、76、100、124、148、 172、196、220、244、268、292、316、340、364、388、412、436、460、484、508、532、556、580、604、 628,652,676,700和724，或一种与其实质上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列；一个选自下列一组序列的重链⑶R2(HCDR2)域SEQ ID NO 6、30、54、78、102、126、150、174、198、222、246、270、294、318、342、366、390、414、438、462、 486、510、534、558、582、606、630、654、678、702 和 726、或一种与其实质上相似具有至少 90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列；一个选自下列一组序列的轻链 CDRl (LCDRl)域SEQ ID NO 12、36、60、84、108、132、156、180、204、228、252、276、300、324、348、372、396、420、444、468、492、516、540、564、588、612、636、660、684、708 和 732，或一种与其实质上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列；以及一个选自下列一组序列的轻链 CDR2(LCDR2)域SEQ ID NO :14、38、62、86、110、1；34、158、 182、206、230、254、278、302、326、350、374、398、422、446、470、494、518、542、566、590、614、 638、662、686、710和734、或一种与其实质上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列。在一个实施方案中，该重链和轻链⑶R序列是SEQ ID NO 52、54、56、60、62、64 ；76、78、80、84、86、88 ； 124、126、128、132、134、136 ；220、222、224、228、 230,232 ；244、246、248、252、254、256 ；以及 316、318、320、324、326、328。在一个较特殊的实施方案中，该重链和轻链CDR序列是SEQ ID NO :76、78、80、84、86、88 ；或220、222、224、228、 230、232。在一个相关的实施方案中，本发明包括一种与hPCSK9特异性结合的抗体或抗体的抗原结合片段，其中该抗体或抗体片段包含位于选自下列一组序列的重链和轻链序列对内的重链和轻链 CDR 域SEQ IDNO :2/10,18/20,22/24,26/34,42/44,46/48,50/58, 66/68、70/72、74/82、90/92、94/96、98/106、114/116、118/120、122/130、138/140、142/144、 146/154、162/164、166/168、170/178、186/188、190/192、194/202、210/212、214/216、 218/226,234/236,238/240,242/250,258/260,262/264,266/274,282/284,286/288, 290/298,306/308,310/312,314/322,330/332,334/336,338/346,354/356,358/360, 362/370,378/380,382/384,386/394,402/404,406/408,410/418,426/428,430/432, 434/442,450/452,454/456,458/466,474/476,478/480,482/490,498/500,502/504, 506/514,522/524,526/528,530/538,546/548,550/552,554/562,570/572,574/576, 578/586,594/596,598/600,602/610,618/620,622/624,626/634,642/644,646/648, 650/658,666/668,670/672,674/682,690/692,694/696,698/706,714/716,718/720, 722/730、738/740和742/744。在一个实施方案中，该CDR序列位于选自下列一组氨基酸序列对的 HCVR 和 LCVR 域内SEQ ID NO :50/58、66/68、70/72、74/82、90/92、94/96、122/130、 138/140、142/144、218/226、234/236、238/240、242/250、258/260、262/264、314/322、 330/332和334/336。在一个较特殊的实施方案中，该CDR序列位于选自下列一组氨基酸序列对的 HCVR 和 LCVR 域内=SEQ ID NO :90/92 或 218/226。在一个实施方案中，本发明提供了一些与hPCSK9特异性结合且中和其活性的完全人单克隆抗体(mAbs)或其抗原结合片段，其中该抗体或其片段显示了一个或多个如下特征
(i)相对于给药前水平，能够使血清总胆固醇含量下降至少约25至35%并保持这种下降趋势达至少M天，较佳的是使血清总胆固醇含量下降至少约30至40% ；
(ii)相对于给药前水平，能够使血清LDL胆固醇含量下降至少约65至80%并保持这种下降趋势达至少对天；
(iii)相对于给药前水平，能够使血清甘油三酯含量下降至少约25至40%；
(iv)不降低血清HDL胆固醇含量，或相对于给药前水平降低血清HDL胆固醇含量不超过5% ；
(ν)与包含hPCSK9 (SEQ ID NO :755)的氨基酸残基238的表位结合；
(vi)相对于pH 7. 4条件下，在pH 53时，表面等离子体共振测量显示hPCSK9的结合亲和力(KD)增强，亲和力增加至少约20倍至50倍；
(vii)与人、人GOF突变D374Y、猕猴、恒河猴、小鼠、大鼠以及仓鼠的PCSK9结合；
(viii)包含含有SEQID NO 80和88的重链和轻链CDR3序列；
(ix)包含选自SEQID NO 90和92的CDR序列。在一个实施方案中，本发明提供了一种与hPCSK9特异性结合及中和其活性的完全人单克隆抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其片段显示了一个或多个如下特征
(i)相对于给药前水平，能够使血清LDL胆固醇含量下降至少约40至70%并保持这种下降趋势达至少60天或90天；
( )相对于给药前水平，能够使血清甘油三酯含量下降至少约25至40% ；
(iii)不降低血清HDL胆固醇含量，或相对于给药前水平降低血清HDL胆固醇含量不超过5%。
(iv)与包含hPCSK9(SEQ ID NO :755)的氨基酸残基366的表位结合；
(ν)经表面等离子体共振技术测量，未显示在酸性PH条件下与PCSK9的结合亲和力比在中性PH条件下有所增强；
(vi)与人和猴的PCSK9结合，但不与小鼠、大鼠或仓鼠的PCSK9结合；
(vii)包含含有SEQID NO 224和232的重链和轻链CDR3序列；
(viii)包含选自SEQID NO :218和226的CDR序列。在第三方面，本发明提供了编码抗PCSK9抗体或其片段的核酸分子。本发明还包括运载本发明核酸的重组表达载体，以及引入这类载体的宿主细胞，并包括一些在允许产生抗体和收集所产生抗体的条件下通过培养宿主细胞而生产抗体的方法。在一个实施方案中，本发明提供了一种抗体或其片段，其包含一个由选自下列序列的核酸序列编码的 HCVR =SEQ ID NO :1、17、21、25、41、45、49、65、69、73、89、93、97、113、 117、121、137、141、145、161、165、169、185、189、193、209、213、217、233、237、241、257、261、 265、281、285、289、305、309、313、329、333、337、353、357、361、377、381、385、401、405、409、 425、429、433、449、453、457、473、477、481、497、501、505、521、525、529、545、549、553、569、 573、577、593、597、601、617、621、625、641、645、649、665、669、673、689、693、697、713、717、 721,737和741，或一种与其实质上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同源性的序列。在一个实施方案中，该HCVR是由选自下列序列的核酸序列编码的SEQ ID NO :49、65、69、73、89、93、121、137、141、217、233、237、241、257、261、313、329 和 333。在一个较特殊的实施方案中，该HCVR是由选自下列序列的核酸序列编码的SEQ ID N0:89和 217。在一个实施方案中，该抗体或其片段进一步包含一个由选自下列一组序列的核酸序列编码的 LCVR =SEQ ID NO :9、19、23、33、43、47、57、67、71、81、91、95、105、115、119、129、 139、143、153、163、167、177、187、191、201、211、215、225、235、239、249、259、263、273、283、 287、297、307、311、321、331、335、345、355、359、369、379、383、393、403、407、417、427、431、 441、451、455、465、475、479、489、499、503、513、523、527、537、547、551、561、571、575、585、 595、599、609、619、623、633、643、647、657、667、671、681、691、695、705、715、719、729、739 和 743，或一种与其实质上相似具有至少90 %、至少95 %、至少98 %或至少99 %序列同源性的序列。在一个实施方案中，该LCVR是由选自下列一组序列的核酸序列编码的SEQ ID NO57、67、71、81、91、95、129、139、143、225、235、239、249、259、263、321、331 和 335。在一个较特殊的实施方案中，该LCVR是由选自下列序列的核酸序列编码的SEQ ID NO :91和225。在一个实施方案中，本发明的特点是一种抗体或抗体的抗原结合片段，其包含一个由选自下列序列的核苷酸序列编码的HCDR3域=SEQ ID NO :7、31、55、79、103、127、151、 175、199、223、247、271、295、319、343、367、391、415、439、463、487、511、535、559、583、607、 631、655、679、703和727，或一种与其实质上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同源性的序列；以及一个由选自下列序列的核苷酸序列编码的LCDR3域SEQ ID NO :15、39、63、87、111、135、159、183、207、231、255、279、303、327、351、375、399、423、 447、471、495、519、543、567、591、615、639、663、687、711 和 735，或一种与其实质上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同源性的序列。在一个实施方案中， 该HCDR3和LCDR3序列是由下列核酸序列分别编码的:SEQ ID NO :55/63、79/87、127/135、 223/231,247/255和319/327。在一个较特殊的实施方案中，该HCDR3和LCDR3序列对是由下列核酸序列编码的:SEQ ID NO :79/87和223/231。在一个进一步的实施方案中，该抗体或其片段进一步包含一个由选自下列一组序列的核苷酸序列编码的 HCDRl 域=SEQ ID NO :3、27、51、75、99、123、147、171、195、219、对3、 267、291、315、339、363、387、411、435、459、483、507、531、555、579、603、627、651、675、699 和 723，或一种与其实质上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同一性的序列；一个由选自下列一组序列的核苷酸序列编码的HCDR2域SEQ ID NO :5、29、53、77、 101、125、149、173、197、221、245、269、293、317、341、365、389、413、437、461、485、509、533、 557、581、605、629、653、677、701和725，或一种与其实质上相似具有至少90%、至少95%, 至少98%或至少99%序列同源性的序列；一个由选自下列一组序列的核苷酸序列编码的 LCDRl 域SEQ ID NO 11、35、59、83、107、131、155、179、203、227、251、275、299、323、347、 371、395、419、443、467、491、515、539、563、587、611、635、659、683、707 和 731，或一种与其实质上相似具有至少90%、至少95%、至少98%或至少99%序列同源性的序列；以及一个由选自下列一组序列的核苷酸序列编码的LCDR2域=SEQ ID NO :13、37、61、85、109、133、 157、181、205、229、253、277、301、325、349、373、397、421、445、469、493、517、541、565、589、 613、637、661、685、709和733，或一种与其实质上相似具有至少90%、至少95%、至少98% 或至少99%序列同源性的序列。在一个实施方案中，该重链和轻链CDR序列是由下列核酸序列编码的:SEQ ID NO :51、53、55、59、61、63 ；75、77、79、83、85、87 ；123、125、127、131、 133,135 ；219、221、223、227、229、231 ；243、245、247、251、253、255 ；以及 315、317、319、323、 325、327。在一个较特殊的实施方案中，该重链和轻链CDR序列是由下列核酸序列编码的 SEQ ID NO :75、77、79、83、85、87 ；以及 219、221、223、227、229、231。在第四个方面，本发明的特点是一种与hPCSK9特异性结合的分离的抗体或抗体的抗原结合片段，其包含一个HCDR3和一个IXDR3，其中HCDR3包含一个结构式为X1-X2-X3-X LX5-X6-X7-X8-X9-Xici-Xii-Xi2-Xi3-X14-X15-XW-X17-X18-X19-X2 的氨基酸序列(SEQ ID NO :747)， 其中 X1 是 Ala ；X2 是 Arg 或 Lys ；X3 是 Asp ；X4 是 Ser 或 Ile ；X5 是 Asn 或 Val ；X6 是 Leu 或 Trp ；X7 是 Gly 或 Met ；X8 是 Asn 或 Val ；X9 是 Phe 或 Tyr ；X10 是 Asp ；X11 是 Leu 或 Met ；X12 是 Asp或缺位；X13是Tyr或缺位；X14是Tyr或缺位；X15是Tyr或缺位乂6是Tyr或缺位；X17 是Gly或缺位；XW是Met或缺位；X19是Asp或缺位，以及X2°是Val或缺位；IXDR3包含一个结构式为X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9的氨基酸序列(SEQ ID NO :750)，其中X1是Gln或 Met ；X2 是 Gln ；X3 是 Tyr 或 Thr ；X4 是 Tyr 或 Leu ；X5 是 Thr 或 Gln ；X6 是 Thr ；X7 是 Pro ；X8 是Tyr或Leu，以及X9是Thr。在一个进一步的实施方案中，该抗体或其片段进一步包含一个结构式为 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 的 HCDRl 序列(SEQ ID NO :745)，其中 X1 是Gly ；X2 是Phe ；X3 是Thr ； X4 是 Phe ；X5 是 Ser 或 Asn ；X6 是 Ser 或 Asn ；X7 是 Tyr 或 His ；以及 X8 是 Ala 或 Trp ；一个结构式为 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 的 HCDR2 序列(SEQ ID NO :746)；其中 X1 是 Ile ；X2 是 Ser 或 Asn ；X3 是 Gly 或 Gln ；X4 是 Asp 或 kr ；X5 是 Gly ；X6 是 Ser 或 Gly ；X7 是 Thr 或 Glu ；以及 X8 是 Thr 或 Lys ；—个结构式为 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xiq-X11-X12 的 LCDRl 序列(SEQ ID NO 748)，其中 X1 是 Gln ；X2 是 Ser ；X3 是 Val 或 Leu ；X4 是 Leu ；X5 是 His 或 Tyr ；X6 是 Arg 或 Ser ；X7 是 Ser 或 Asn ；X8 是 Asn 或 Gly ；X9 是 Asn ；X10 是 Arg 或 Asn ；X11 是 Asn 或 Tyr ；以及 X12是Phe或缺位；一个结构式为X1-X2-X3的LCDR2序列(SEQ ID NO :749)，其中X1是Trp 或Leu ;X2是Ala或Gly ；以及乂3是％1·。
图1显示了 316P和300N mAbs的重链和轻链可变域的序列比对。在第五个方面，本发明的特点是一种人抗PCSK9抗体或抗体的抗原结合片段，其包含一个由衍生自VH、Dh和Jh种系序列的核苷酸序列片段编码的重链可变区(HCVR)，以及一个由衍生自Vk和Jk种系序列的核苷酸序列片段编码的轻链可变区(LCVR)，其中该种系序列是(a) Vh基因片段3-23、Dh基因片段7_27、Jh基因片段2、Vk基因片段4_1以及Jk基因片段2 ；或(b) Vh基因片段3-7、 基因片段2-8、Jh基因片段6、Vk基因片段2- 以及Jk 基因片段4。在第六个方面，本发明的特点是一种与PCSK9蛋白(SEQ IDNO :755)结合的抗体或其抗原结合片段，其中该抗体或其片段与一种变异PCSK9蛋白的结合比抗体或其片段与 SEQ ID NO :755的PCSK9蛋白之间的结合低50%。在一个特殊的实施方案中，该抗体或其抗原结合片段与该变异PCSK9蛋白的结合亲和力(Kd)比与PCSK9(SEQ IDNO :755)的结合力低约50%、低约60%、低约70%、低约80%、低约90%或低约95%。在一个实施方案中，该变异PCSK9蛋白在SEQ ID NO :755的238位包含至少一个突变。在一个较特殊的实施方案中，该突变为D238R。在一个实施方案中，相对于野生型蛋白SEQ ID NO :755，该抗体或抗体片段与变异PCSK9蛋白的结合亲和力至少低90%，其中该变异蛋白在残基238处包含一个突变。在一个实施方案中，相对于野生型蛋白SEQ ID NO 755，该抗体或抗体片段与变异PCSK9蛋白的结合亲和力至少低80%，其中该变异蛋白在一个或一个以上残基153、159、238和343处包含一个突变。在一个较特殊的实施方案中，该突变是 S153R、E159R、D238R 和 D!343R 之一。在一个实施方案中，该变异PCSK9蛋白在SEQ ID NO :755的366位包含至少一个突变。在一个较特殊的实施方案中，该突变为E366K。在一个实施方案中，相对于野生型蛋白SEQ ID NO :755，该抗体或抗体片段与变异PCSK9蛋白的结合亲和力至少低95%，其中该变异蛋白在残基366处包含一个突变。在一个实施方案中，相对于野生型蛋白SEQ ID NO 755，该抗体或抗体片段与变异PCSK9蛋白的结合亲和力至少低70%、80%或90%，其中该变异蛋白在一个或一个以上残基147、366和/或380处包含一个突变。在一个较特殊的实施方案中，该突变是S147F、E366K和V380M之一。
本发明包括具有一种经修饰的糖基化模式的抗PCSK9抗体。在某些应用中，进行修饰以除去某些不希望的糖基化位点也许是有益的，或例如除去岩藻糖基以提高抗体依赖性细胞毒性(ADCC)功能(参阅Shield et al. (2002) JBC 277 :26733)。在其它一些应用中，为了改变补体依赖性细胞毒性(CDC)，可进行半乳糖基化的修饰。在第七个方面，本发明之特点是一种含有与hPCSK9特异性结合的重组人抗体或其片段以及一种药学上可接受载体的药物组合物。在一个实施方案中，本发明之特点是一种组合物，它是本发明之抗体或抗体的抗原结合片段和第二种治疗剂的结合。第二种治疗剂可为与本发明之抗体或其片段有利地结合的任何药剂，例如，一种通过抑制3-羟基-3-甲基戊二酰(HMG)-辅酶A(CoA)还原酶能够诱导胆固醇合成的细胞清除的药剂，例如西利维司汀(cerovastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、辛伐他汀(simvastatin)、匹伐他汀(pitavastin)、瑞舒伐它汀(rosuvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀 (lovastatin)、普伐他汀(pravastatin)等；能够抑制胆固醇吸收和/或胆汁酸再吸收的药剂；能够增加脂蛋白分解代谢的药剂(如烟酸)；和/或在胆固醇如22-羟基胆固醇的清除过程中起作用的L)(R转录因子的活化剂。在第八个方面，本发明的特点是一些用本发明之抗PCSK9抗体或抗体的抗原结合片段抑制hPCSK9活性的方法，其中该治疗方法包括施用一种疗效量的含有本发明之抗体或抗体的抗原结合片段的药物组合物。所治疗的疾病是通过除去、抑制或降低PCSK9的活性而得到改善、减轻、抑制或预防的任何疾病或症状。可以本发明之方法治疗的具体人群包括需要LDL血浆置换的患者、PCSK9激活突变(获得功能的突变，即G0F)的患者、杂合家族性高胆固醇血症患者(heFH)；不耐受抑制素或抑制素无法控制的原发性高胆固醇血症患者；以及具有患高胆固醇血症的危险但可进行预防性治疗的患者。其它症状包括与次要原因如II型糖尿病相关的血脂异常、胆汁郁积型肝病(原发性胆汁性肝硬变化)、肾病综合征、甲状腺机能减退、肥胖症；以及动脉粥样硬化和心血管疾病的预防和治疗。在本发明之方法的一些特殊的实施方案中，本发明之抗hPCSK9抗体或抗体片段可用于降低偏高的总胆固醇、非HDL胆固醇、LDL胆固醇、和/或载脂蛋白B (载脂蛋白B100) 的含量。本发明之抗体或抗体片段可单独使用或与第二种药剂如一种HMG-CoA还原酶的抑制剂和/或其它降低脂质的药物结合使用。其它的实施方案包括将如上所定义的抗体或抗体的抗原结合片段用于减轻或抑制PCSK9介导的疾病或病症。本发明包括在用于减轻或抑制PCSK9介导的疾病或病症的药剂的制造过程中，使用如上所定义的抗体或抗体的抗原结合片段。在一些特殊的实施方案中，其中PCSK9介导的疾病或症状是高胆固醇血症、高血脂症、需要LDL血浆置换、杂合家族性高胆固醇血症、 抑制素不耐受症、抑制素无法控制、具有患高胆固醇血症的危险、血脂异常、胆汁郁积型肝病、肾病综合征、甲状腺机能减退、肥胖症、动脉粥样硬化以及心血管疾病。在阅读以下详细叙述的过程中，其它的实施方案将变得很明显。 附图的简要说明图1 重链(A)和轻链(B)可变区和抗体H1H316P和H1M300N的⑶R序列比较表。图2 血清中抗体浓度随时间的变化。316P 5mg/kg(D) ；300N 5mg/kg(〇)；316P15mg/kg(v) ；300N 15mg/kg(·)。图3 以緩種 液对照變化百分比表示的血清總膽固醇水平。对照⑴；316P 5mg/ kg(ν) ；300Ν 5mg/kg(σ) ；316Ρ 15mg/kg( □ ) ；300N15mg/kg( Δ )。图4 以緩衝液对照變化百分比表示的血清LDL膽固醇水平。对照⑴；316P 5mg/kg ( ν ) ；300N 5mg/kg ( σ ) ；316P 15mg/kg( □ ) ；300N 15mg/kg(A)。图5 相对于缓冲液对照归一化的血清LDL胆固醇水平。緩衝液对照(T) ；316P 5mg/kg ( ν ) ；300N 5mg/kg ( σ ) ；316P 15mg/kg( □ ) ；300N 15mg/kg(A)。图6 以緩衝液对照變化百分比表示的血清HDL膽固醇水平。对照⑴；316P 5mg/kg ( ν ) ；300N 5mg/kg ( σ ) ；316P 15mg/kg( □ ) ；300N 15mg/kg(A)。图7 以緩衝液对照變化百分比表示的血清甘油三酯水平。緩衝液对照(T)； 316P 5mg/kg(v) ；300N 5mg/kg ( σ ) ；316P 15mg/kg( □ ) ；300N 15mg/kg(A)。图8 单剂量皮下注射后，以从基線的變化百分比表示的血清LDL膽固醇水平。 316P 5mg/kg(v) ；300N 5mg/kg(參)。图9 单剂量皮下注射后血清抗体浓度随时间的变化。316P 5mg/kg( · ) ；300N 5mg/kg (σ)。图10 小鼠总肝勻浆LDL受体的西方印迹试验。于注射PBS(l-3行)、5mg/ kg 316P (4-6 行)或 5mg/kg 非 hPCSK9 特异性 mAb (7-8 行)后 M 小时，以及 1. 2mg/kg hPCSK9-mmh(所有行)注射后4小时取样。 图11 :316P对PCSK9Whu小鼠体内血清LDL胆固醇水平的胃响。缓冲液对照(0 ； 316P lmg/kg(·); 316P 5mg/kg (画);316P 10mg/kg(||)o图12 :C57BL/6小鼠的抗hPCSK9mAb血清药代动力学特性。单剂量注射对照I mAb(X)为 10mg/kg ;316Ρ(σ )为 10mg/kg 以及 300N(v)为 10mg/kg。图13 :hPCSK9杂合小鼠的抗hPCSK9 mAb血清药代动力学特性单剂量10mg/kg 对照 I mAb(X) ；316Ρ(σ)禾口 300Ν(ν)。图14 :316P对喂以正常饲料的叙利亚仓鼠体内血清LDL胆固醇水平的影响。缓冲液对照(·)；316P lmg/kg(v) ；316P 3mg/kg(o ) ；316P 5mg/kg(T)。
本发明的详细说明在描述本发明的方法之前，应该理解，本发明并非局限于所描述的具体方法和实验条件，因为这些方法和条件是可以改变的。还应理解，本文所用的术语仅出于描述具体实施方案的目的，并非意在限制本发明，因为本发明之范围仅受所附权利要求书的限制。除非另有定义，本文所用的所有技术和科学术语将具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管与本文所述的方法和材料类似或相当的任何方法和材料都可用于本发明之实施或试验，但现将描述的是首选的方法和材料。
定义本文所用的术语“人类前蛋白转化酶枯草溶菌素9”或“hPCSK9”是指具有SEQ ID NO :7 所示核酸序列和SEQ ID NO :755所示氨基酸序列或其生物活性片段的hPCSK9。本文所用的术语“抗体”意指由四条多肽链即两条重链(H)和两条轻链(L)以二硫键相互连接而组成的免疫球蛋白分子。每条重链均由一个重链可变区(HCVR或VH)和一个重链恒定区组成(由CH1、CH2和CH3域组成)。每条轻链均由一个轻链可变区(LCVR或 VL)和一个轻链恒定区(CL)组成。VH和VL区可进一步分成被称为互补决定区(CDR)的高变区，其中散布着保存性更好的被称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL均由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。一个或多个CDR残基的取代或一个或多个CDR的删除也是可能的。在科学文献中已经叙述了其中一个或两个⑶R被删除以用于结合的抗体。Indian et al. (1995 FASEB J. 9 :133-139)基于已发表的晶体结构，分析了抗体及其抗原之间的接触域，并得出结论， 只有约五分之一至三分之一的⑶R残基与抗原实际接触。Indian还发现了许多抗体，其中一个或两个CDR不含与抗原接触的氨基酸(还可参阅Vajdos et al. 2002 J Mol Biol 320 415-428)。不接触抗原的CDR残基可基于先前的研究利用分子模拟和/或根据经验从位于 Chothia⑶R域外的Kabat⑶R域识别(例如⑶RH2中的H60-H65残基往往是不需要的)。 如果一个CDR或其残基被删除，通常它会被另一人抗体序列或这类序列共有区内占据相应位置的氨基酸取代。CDR和氨基酸内的取代位置也可根据经验选择。经验取代可以是保守的或不保守的取代。本文所用的术语“人抗体”意在包括含有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明之人HlAbs抗体可包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机诱变或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变而引入的突变)，例如可在CDR中尤其是在CDR3中包括这样的氨基酸残基。但是，本文所用的术语“人抗体”并不意在包括其中衍生自另一哺乳动物物种如小鼠的CDR序列被嫁接到人构架序列上的mAbs抗体。“特异性结合”或类似术语意为一个抗体或抗原结合片段与一个在生理条件下相对稳定的抗原形成复合体。特异性结合可以一个至少约IxlO-fiM或更小的平衡离解常数来描述(例如一个较小的Kd就意味着较紧密的结合)。确定两个分子是否特异性结合的方法是本领域内众所周知的，包括例如平衡透析、表面等离子体共振等方法。但是，特异性结合 hPCSK9的分离抗体对于其它抗原如来自其它物种的PCSK9分子可显示交叉反应性。然而， 与hPCSK9及一个或一个以上其它抗原结合的多特异性抗体(例如双特异性抗体)依然被认为是“特异性结合” hPCSK9的抗体，如本文所用。术语“高亲和力”抗体是指经表面等离子共振技术例如BIAC0RE 或溶液亲和 ELISA法测定，与hPCSK9的结合亲和力为至少10_1(IM、较佳的是ΙΟ—^Μ、更佳的是10 Μ的 mAbs抗体。术语“慢离解速率(slow off rate) ”、“Koff”或“kd”是指经表面等离子共振技术例如BIAC0RE 测定，以IxlO-3S-1或更低、较佳的是以lxlO—Y1或更低的速率常数从hPCSK9 离解的抗体。本文所用的抗体的“抗原结合部分”(或简称“抗体片段”)这一术语是指抗体中一个或多个保持了与hPCSK9特异性结合能力的片段。抗体片段可包括一个Fab片段、一个 F(ab' )2片段、一个Fv片段、一个dAb片段、一个含有⑶R的片段，或一个分离的⑶R。本发明的具体实施方案、抗体或抗体片段可与一种治疗基团(“免疫偶联物”)如细胞毒素、化疗药物、免疫抑制剂或放射性同位素等偶联。本文所用的“分离抗体”意指实质上不含其它具有不同抗原特异性的mAbs的抗体(例如特异性结合hPCSK9的分离抗体就在实质上不含能特异性结合hPCSK9之外抗原的 mAbs)。但是，特异性结合hPCSK9的分离抗体对于其它抗原如来自其它物种的PCSK9分子可具有交叉反应性。本文所用的“中和抗体”(或“中和PCSK9活性的抗体”)意指其与hPCSK9的结合将导致PCSK9的至少一种生物活性被抑制的抗体。PCSK9生物活性的这种抑制可通过以本领域内众所周知的若干标准体外或体内测定法中一种或多种方法测定PCSK9生物活性的一个或多个指标进行评估(参阅下文的实施例)。本文所用的术语“表面等离子共振”是指一种光学现象。基于这种光学现象可利用例如 BIAC0RE 系统(Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ) 来检测生物传感器基质中蛋白质浓度的变化，从而对实时生物特异性相互作用进行分析。本文所用的术语“KD”意指特定的抗体-抗原相互作用的平衡离解常数。术语“表位”是指抗原中与抗体结合的区域。表位可定义为结构性表位或功能性表位。功能性表位通常是结构性表位的一个亚型，并具有直接影响相互作用亲和力的残基。 表位可以是构象表位，即由非线性氨基酸组成。在某些实施方案中，表位可包括决定簇，后者是分子的化学活性表面基团，如氨基酸、糖侧链、磷酰基类或磺酰基类；在某些实施方案中，表位可具有特定的三维结构特征和/或特定的电荷特征。术语“本质上同一性”或“本质上相同”当指核酸或其碎片时，表示当以适当的核苷酸插入或删除与另一个核酸(或其互补链)最佳比对时，用下述任何著名的算法如FASTA、 BLAST或GAP测量，至少具有90%的核苷酸碱基序列相同性，更首选的是至少具有95%、 96 %、97 %、98 %或99 %的核苷酸碱基序列相同性。当应用于多肽时，术语本质上相似”指两个肽序列用诸如GAP或BESTFIT等程序的预设间隙重量达排列到最佳比对时，两者至少有90%的序列相同性，更首选的是至少有 95%、98%或99%的序列相同性。首选的是，不相同的残基位置的差别仅在于保守的氨基酸取代。“保守的氨基酸取代”是指这样一种取代，即一个氨基酸残基被另一个含有化学性质 (例如电荷或疏水性)相似侧链(R基团)的氨基酸残基所取代。一般来说，保守的氨基酸取代不会在实质上改变蛋白质的功能性质。在两个或更多的氨基酸序列相互之间的差别仅在于某些保守取代的情况中，可将序列相似性程度向上调整，以针对取代的保守特性作出校正。进行这种调整的方法是本领域技术人员所熟知的。参阅例如Pearson (1994)Methods Mol. Biol. 24 :307-331.含有化学性质相似侧链的氨基酸类别的实例包括1)脂族侧链甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；幻脂族羟基侧链丝氨酸和苏氨酸；幻含酰胺侧链天冬氨酸和谷氨酰胺；4)芳族侧链苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸力)碱性侧链赖氨酸、 精氨酸和组氨酸；和6)含硫侧链天冬氨酸盐和谷氨酸盐，以及7)含硫侧链半胱氨酸和甲硫氨酸。首选的保守氨基酸取代基是缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、 赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。或者，保守的取代是Gonnet et al. (1992) Science 256 :144；345中所公开的PAM250 对数似然矩阵(PAM2501Og-likelihOOd matrix)中任何正值的变化。“中度保守的”取代是 PAM250对数似然矩阵中非负值的任何变化。
多肽的序列相似性通常用序列分析软件来测量。蛋白质分析软件是用指定给各种取代(包括保守氨基酸取代)、缺失和其它修饰的相似性程度对相似的序列进行比对。例如，GCG软件含有诸如“GAP”和“BESTFIT”的程序，可以默认参数使用这些程序，以确定紧密相关的多肽例如来自不同生物物种的同源多肽之间的序列同源性或序列同一性，或者野生型蛋白质及其突变蛋白之间的序列同源性或序列同一性。参阅例如GCG Version 6. 1。还可以用GCG Version 6. 1中的FASTA程序以默认参数或推荐参数来比较多肽序列。FASTA (例如FASTA2和FASTAiB)能提供被查询序列和被搜索序列之间的最佳重迭区域的比对和序列同一性百分数(Pearson(2000)，出处同上)。当将本发明之序列与含有大量的源自不同生物的序列的数据库进行比较时，另一首选的算法是BLAST计算机程序，尤其是BLASTP 或 TBLASTN，使用默认参数。参阅如 Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215 :403410 及 (1997)NucleicAcids Res. 25 :3389402.在一些特殊的实施方案中，本发明之方法所使用的抗体或抗体片段可为单特异性、双特异性或多特异性。多特异性抗体可以针对同一目标多肽的不同表位，或可含有针对一个以上目标多肽之表位的抗原结合域。可用于本发明的代表性双特异性抗体形式涉及使用第一个免疫球蛋白(Ig)CH3结构域和第二个Ig CH3结构域，其中第一个和第二个IgCH3 结构域相互之间相差至少一个氨基酸，且与无氨基酸差别的双特异性抗体相比，其中至少一个氨基酸的差别降低了双特异性抗体与蛋白A的结合力。在一个实施方案中，第一个Ig CH3结构域与蛋白A结合，第二个Ig CH3结构域包含一个降低或消除与蛋白A结合的突变， 例如一个H95R修饰(按照IMGT表现序列编号法；按照欧盟编号法则为H435R)。第二个CH3 结构域可进一步包含一个Y96F修饰(按照IMGT编号法；按照欧盟编号法则为W36F)。可在第二个CH3域内找到的其它修饰包括在IgGl mAbs的情况下为D16E、L18M、N44S、K52N、 V57M和V82I (按照IMGT编号法；按照欧盟编号法则为D356E、L358M、N384S、K392N、V397M 和V422I)；在IgG2 mAbs的情况下为N44S、K52N和V82I (按照IMGT编号法；按照欧盟编号法则为 N384S、K392N 和 V422I)；以及在 IgG4 mAbs 情况下为 Q15R、N44S、K52N、V57M、R69K、 E79Q和V82I (按照IMGT编号法；按照欧盟编号法则为Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、 E419Q和V422I)。上述双特异性抗体的各种变化形式均被认为是在本发明的范围之内。“有效治疗量”这一短语意为对受药对象能产生所需作用的量。确切的剂量将取决于治疗的目的，并可由本领域专业人员使用已知技术确定(例如参阅Lloyd(1999)The Art，Science and Technology ofPharmaceutical Compounding)0
人抗体的制备在转基因小鼠体内产生人抗体的方法是众所周知的(例如参阅美国第6，596，541 号专利，Regeneron Pharmaceuticals, VEL0CIMMUNE )。VELOCIMMUNE 技术涉及到这样一种转基因小鼠的产生该小鼠的基因组包含一些与内源小鼠恒定区基因座有效地连接 (operably linked)的人重链和轻链可变区，使得该小鼠能响应抗原刺激而产生一种包含人可变区和小鼠恒定区的抗体。将编码该抗体的重链和轻链的可变区的DNA分离出来，并与编码人重链和轻链恒定区的DNA有效地连接。然后在能够表达完全人抗体的细胞中表达该DNA。在具体的实施方案中，该细胞是一种CHO细胞。抗体可在治疗过程中用于阻断配体-受体之间的相互作用或抑制受体组分之间的相互作用，而不是通过固定补体和参与补体依赖性细胞毒性(CDC)来杀灭细胞，或通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ACDC)来杀灭细胞。因此，抗体的恒定区对于抗体固定补体和介导细胞依赖性细胞毒性的能力是重要的。因此，可根据是否需要抗体介导细胞毒性来选择抗体的同型。人抗体可以两种与铰链异质性有关的形式存在。在一种形式中，抗体分子包含一种约150-160kDa的稳定的四链构建物，其中两个二聚体通过一个重链间的二硫键连接在一起。在第二种形式中，该二聚体不是通过重链间的二硫键连接在一起，而是形成了一种由共价偶联的轻链和重链(半抗体)组成的约75-80kDa的分子。这两种形式的分离一直极为困难，甚至在亲和纯化之后也是如此。第二种形式在各种完整IgG同型中的出现频率，是由于但不限于与抗体的铰链区同型相关的结构差异。人IgG4铰链的铰链区之单个氨基酸取代可将第二种形式(Angal et al. (1993)Molecular Immunology30 105)的出现频度显著地降低到利用人IgGl铰链所观察到的水平。本发明包括在铰链区、CH2区或CH3区中含有一个或多个突变的抗体。所述的突变可能是合乎需要的，例如在生产中用于提高所需抗体形式的产率。 通常，用所研究抗原冲击致敏VEL0CIMMUNE 小鼠，并从表达抗体的小鼠回收淋巴细胞(如B细胞)。淋巴细胞可与一个骨髓瘤细胞系融合来制备永生杂交瘤细胞系，然后对这种杂交瘤细胞系进行筛选，以识别能产生对相关抗原具有特异性之抗体的杂交瘤细胞系。可将编码重链和轻链可变区的DNA分离出来，并与合乎需要的重链和轻链的同型恒定区连接。这种抗体蛋白可在一种细胞如CHO细胞中产生。另外，编码抗原特异的嵌合抗体或轻链和重链可变域的DNA可直接从抗原特异的淋巴细胞中分离出来。首先，分离包含一个人可变区和一个小鼠恒定区的抗体的高亲和力嵌合抗体。如下所述，根据所需的特点，包括亲和力、选择性、表位等鉴定和选择抗体。用合乎需要的人恒定区取代小鼠恒定区，以产生本发明之完全人抗体，例如野生型的或经修饰的IgGl或 IgG4(例如SEQ ID NO :751,752,753) 0所选择的恒定区可根据特定的用途而改变，而高亲和力抗原结合特性和靶标特异性特性则存在于可变区中。
表位作图和相关技术为筛选能与特定表位结合的抗体(例如能阻断IgE与其高亲和力受体结合的抗体)，可进行常规的交联-阻断分析，如 Antibodies，Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb.，NY)中所述。其它方法包括丙氨酸扫描突变体分析、肽印迹分析(Reineke (2004)Methods Mol Biol 248 :443-63)或肽切割分析。另外，还可采用诸如抗原的表位切除、表位提取和化学修饰的方法(TomerQOOOWrotein Science9 :487-496)。术语“表位”是指抗原上B细胞和/或T细胞对其作出响应的位点。B细胞表位可由毗连的氨基酸形成，或者由通过蛋白质的三级折迭而并列在一起的非毗连氨基酸形成。 由毗连氨基酸形成的表位在接触变性溶剂时通常可得以保留，而通过三级折迭形成的表位在用变性溶剂处理时通常会失去。表位通常包括至少3个、更经常是至少5个或8-10个以独特空间构象出现的氨基酸。修饰辅助概况分析(Modification-Assisted Profiling，MAP)，也被称为基于抗原结构的抗体谱分析(Antigen Structure-basedAntibody Profiling，ASAP)，是一种根据每种抗体与经化学或酶学修饰的抗原表面的结合状况的相似性对大量的抗同一抗原的单克隆抗体(mAbs)进行分类的方法(美国专利2004/0101920号)。每一类均可反映与另一类所代表的表位截然不同或部分重迭的独特表位。这种技术可以快速过滤遗传上相同的 mAbs，从而可使鉴定工作集中在遗传上不同的mAbs上。当应用于杂交瘤筛选时，MAP有助于鉴定某些罕见杂交瘤克隆，后者能产生具有所需特性的mAbs。MAP可用来将本发明的抗 PCSK9mAbs抗体分类成结合不同表位的mAbs抗体组。在各种各样的实施方案中，抗hPCSK9抗体或抗体的抗原结合片段与催化域(SEQ ID NO 755的约153至425)内的一个表位结合；更具体的是，与从约153至约250或从约 250至约425的片段内的一个表位结合；更具体的是，本发明之抗体或抗体片段与从约153 至约208、从约200至约260、从约250至约300、从约275至约325、从约300至约360、从约 350至约400，和/或从约375至约425的片段内一个表位结合。在各种各样的实施方案中，抗hPCSK9抗体或抗体的抗原结合片段与前肽域(SEQ ID NO 755的31至152残基)内的一个表位结合；更具体的是，与从约31残基至约90残基或从约90残基至约152残基内一个表位结合；更具体的是，本发明之抗体或抗体片段与从约31残基至约60残基、从约60残基至约90残基、从约85残基至约110残基、从约100 残基至约130残基、从约125残基至约150残基、从约135残基至约152残基，和/或从约 140残基至约152残基的片段内的一个表位结合。在某些实施方案中，抗hPCSK9抗体或抗体的抗原结合片段与C端域(SEQ ID NO 755的4 至692残基)内的一个表位结合；更具体的是，与从约4 残基至约570残基或从约570残基至约692残基内一个表位结合；更具体的是，本发明之抗体或抗体片段与从约 450残基至约500残基、从约500残基至约550残基、从约550残基至约600残基，和/或从约600残基至约692残基的片段内的一个表位结合。在某些实施方案中，抗体或抗体片段与一个表位结合，该表位包括催化域、前肽域或C端域内和/或两个或三个不同域内的一个以上所列举表位(例如催化域和C端域内， 或前肽域和催化域内，或前肽域、催化域和C端域内的表位)。在某些实施方案中，该抗体或抗原结合片段与包含hPCSK9 (SEQ ID NO :755)的氨基酸残基238的hPCSK9上的一个表位结合。实验结果(表27)显示，当D238发生突变时， mAb 316P的Kd显示结合亲和力下降> 400倍( IxlO^9M至 4IOxIO^9M)且T172下降> 30倍(从 37至 lmin)。在一个特殊的实施方案中，该突变是D238R。在某些实施方案中，本发明之抗体或抗原结合片段与在153、159、238和343位置上含有两个或两个以上氨基酸残基的hPCSK9的一个表位结合。如下所示，氨基酸残基153、159或343的突变导致了亲和力下降约5至10倍或T172 类似的缩短。在一些特殊的实施方案中，突变为S153R、E159R和/或D343R。在某些实施方案中，该抗体或抗原结合片段与包含hPCSK9 (SEQ ID NO :755)的氨基酸残基366的hPCSK9上的一个表位结合。实验结果(表27)显示，当E366发生突变时， mAb 300N的亲和力显示约50倍的下降( · 7x10-^9M至 36Χ1(Γ9Μ)且Τ1/2也类似地缩短 (从 120至 2min)。在一个特殊的实施方案中，该突变是E366K。本发明包括与本文所述的任何特殊代表性抗体一样与表位结合的抗PCSK9抗体。 类似地，本发明还包括与本文所述的任何特殊代表性抗体在与PCSK9或PCSK9片段结合过程中竞争的抗PCSK9抗体。使用本领域内已知的常规方法，可以容易地确定一种抗体是否与本发明之对照抗PCSK9抗体一样与同样的表位结合，或在结合过程中竞争。例如，为了确定一种试验抗体是否与本发明之对照抗PCSK9抗体一样与同样的表位结合，让该对照抗体与PCSK9蛋白或肽在饱和条件下结合。然后，评估试验抗体与该PCSK9分子结合的能力。如果该试验抗体在与对照抗PCSK9抗体饱和结合之后能够与PCSK9结合，就可得出结论，该试验抗体和对照抗 PCSK9抗体与不同的表位结合。在另一方面，如果该试验抗体在与对照抗PCSK9抗体饱和结合之后不能与PCSK9分子结合，那么该试验抗体就可与本发明之对照抗PCSK9抗体所结合的同一表位结合。为了确定一种抗体是否与对照抗PCSK9抗体在结合过程中竞争，在两个方向实施上述结合方法在第一个方向，让对照抗体与PCSK9分子在饱和条件下结合，然后评估试验抗体与该PCSK9分子的结合。在第二个方向，让试验抗体与PCSK9分子在饱和条件下结合， 然后评估对照抗体与该PCSK9分子的结合。如果在这两个方向只有第一个(饱和)抗体能够与PCSK9分子结合，那就可以得出结论，该试验抗体与对照抗体在与PCSK9结合的过程中竞争。如同本领域专业人员所能理解的，与对照抗体在结合过程中竞争的抗体未必与对照抗体所结合的同一表位结合，但可与一个重迭或邻近的表位结合而在空间上阻断该对照抗体。如果每个抗体竞争性地抑制(阻断)另一抗体与抗原的结合，两个抗体就会与同一或重迭的表位结合。换言之，一种1倍、5倍、10倍、20倍或100倍过量的抗体将抑制另一抗体的结合达至少50%，但较佳的是75%，90%或甚至99%，如竞争结合分析所测量(参阅例如 Junghans et al. ,Cancer Res. 199050:1495-1502)。或者，如果抗原中降低或消除一种抗体结合的几乎所有的氨基酸突变能降低或消除另一种抗体的结合，则两种抗体具有相同的表位。如果降低或消除一种抗体结合的某些氨基酸突变也能降低或消除另一种抗体的结合，则两种抗体具有重迭的表位。然后可进行其它常规实验(例如肽突变和结合分析)以确定是否观察到的试验抗体的结合不足实际上是由于与对照抗体所结合的同一表位结合，或是否空间阻断(或另一现象)是观察到的结合不足的原因。这类实验可采用ELISA、RIA、表面等离子体共振技术、 流式细胞计量法或本领域内所具备的任何其它定量或定性的抗体结合分析。在一个特殊的实施方案中，本发明包括一种抗PCSK9抗体或抗体的抗原结合片段，它与序列号为SEQ ID N0:755的PCSK9蛋白结合，其中该抗体或其片段与PCSK9和 PCSK9蛋白变体之间的结合低于该抗体或片段与序列号为SEQ ID NO :755的PCSK9蛋白之间的结合的50%。在一个特殊的实施方案中，该PCSK9蛋白变体在153、159、238和343位置包含至少一个残基突变。在一个更特殊的实施方案中，至少一个突变是S153R、E159R、 D238R和D343R。在另一个特殊的实施方案中，该PCSK9蛋白变体包含至少一个位于366的突变。在一个特殊的实施方案中，该PCSK9蛋白变体在147、366和380位置包含至少一个残基突变。在一个更特殊的实施方案中，该突变是S147F、E366K和/或V380M。
免疫偶联物本发明包括一种与治疗基团(“免疫偶联物”)如细胞毒素、化疗药物、免疫抑制剂或放射性同位素等偶联的人抗PCSK9单克隆抗体。细胞毒素包括任何损害细胞的试剂。 适宜于形成免疫偶联物的细胞毒素和化疗剂的例子是本领域内众所周知的。参阅如WO 05/103081。双特异性本发明之抗体可以是单特异性的、双特异性的，或多特异性的。多特异性mAbs抗体可以针对同一目标多肽的不同表位，或可含有针对一个以上目标多肽的抗原结合域。参阅，如 Tutt et al. (1991) J. Immunol. 147 :60-69。人抗 PCSK9 mAbs 抗体可连接到另一个功能分子，如另一个肽或蛋白质上，或与之共同表达。例如，一种抗体或其片段可与一种或多种其它分子实体如另一种抗体或抗体片段实现功能性(例如以化学偶联、基因融合、非共价键连接或其它方式)连接，以产生具有第二种结合特异性的双特异性或多特异性抗体。可用于本发明的代表性双特异性抗体形式涉及使用第一个免疫球蛋白(Ig)CH3 结构域和第二个Ig CH3结构域，其中第一个和第二个Ig CH3结构域相互之间相差至少一个氨基酸，且与无氨基酸差别的双特异性抗体相比，其中至少一个氨基酸的差别降低了双特异性抗体与蛋白A的结合力。在一个实施方案中，第一个Ig CH3结构域与蛋白A结合， 第二个Ig CH3结构域含有一个降低或消除与蛋白A结合的突变，例如一个H95R修饰(按照IMGT表现序列编号法；按照欧盟编号法则为H435R)。第二个CH3结构域可进一步包含一个Y96F修饰(按照IMGT编号法；按照欧盟编号法则为W36F)。可在第二个CH3域内找到的其它修饰包括在IgGl抗体的情况下为D16E、L18M、N44S、K52N、V57M和V82I (按照 IMGT 编号法；按照欧盟编号法则为 D356E、L358M、N384S、K392N、V397M 和 V422I)；在 IgG2 抗体的情况下为N44S、K52N和V82I (按照IMGT编号法；按照欧盟编号法则为N384S、K392N 和 V422I)；以及在 IgG4 抗体的情况下为 Q15R、N44S、K52N、V57M、R6I、E79Q 和 V82I (按照 IMGT 编号法；按照欧盟编号法则为 Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q 和 V422I)。 上述双特异性抗体的各种变化形式均被认为是在本发明的范围之内。
生物等效物本发明之抗PCSK9抗体和抗体片段包括某些蛋白，这些蛋白含有不同于所述mAbs 抗体的氨基酸序列的氨基酸序列，但保留了与人PCSK9结合的能力。当与母体序列比较时， 这类变异的mAbs抗体和抗体片段包含一个或多个氨基酸的添加、缺失或取代，但显示了与所述mAbs抗体的生物活性基本上相当的生物活性。类似地，当与所披露序列比较时，本发明之编码抗PCSK9抗体的DNA序列含有的序列包含一个或多个核苷酸的添加、缺失或取代， 但可编码与本发明之抗PCSK9抗体或抗体片段基本上生物等效的抗PCSK9抗体或抗体片段。这类变异氨基酸和DNA序列的实例已在上面讨论。如果两种抗原结合蛋白或抗体是医药等效物或医药替代物，当在相似实验条件下无论以单剂或以多剂方式以相同摩尔剂量给药时，其吸收速率和程度均未显示显著差别， 则它们被认为是生物等效的。某些抗体如果它们的吸收程度相当但吸收速率不相当，它们将被认为是等效物或药物替代物，并仍可被认为是生物等效的，因为这种吸收速率的差别是有意设计的并反映在标签上，这种差别对于达到有效的体内药物浓度是非关键性的(例如对于慢性用途)，并被认为对于所研究的特定医药产品在医学上是无关重要的。在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白在安全性、纯度和药效方面没有临床意义上的差别，则它们是生物等效的。在一个实施方案中，如果一名患者可以在对照产品和生物产品之间转换一次或多次而不良副作用的风险并未如预期那样增加，包括与无这种转换的连续治疗相比在免疫原性方面无显著的临床变化或效率降低，则两种抗原结合蛋白就是生物等效的。
在一个实施方案中，如果两种抗原结合蛋白在使用条件下都以一种或多种共同的作用机制起作用，且这类机制是众所周知的，则它们就是生物等效的。生物等效性可以体内和体外的方法演示。生物等效性的测量包括，例如，(a) 一种在人类或其它哺乳类动物体内的试验，其中血液、血浆、血清或其它生物体液中抗体或其代谢物的浓度是作为时间的函数测定的；(b) —种体外试验，该试验已与人的体内试验生物利用率数据建立相关联系并可根据人的体内试验生物利用率数据合理预测；(c) 一种人类或其它哺乳类动物的体内试验，其中抗体(或其目标)适当的急性药理作用是作为时间的函数测定的；以及(d) —种控制良好的临床试验，该试验确定抗体的安全性、有效性，或生物利用率或生物等效性。本发明抗PCSK9抗体的生物等效变体可通过例如取代生物活性不需要的各种残基或序列或删除生物活性不需要的端部或内部残基或序列而构建。例如，对于生物活性并非必需的半胱氨酸残基可被删除或被其它氨基酸取代，以防在复原时形成不必要或不正确的分子内二硫化物桥。
治疗群体本发明提供了一些治疗方法以治疗需要使用本发明组合物的人类患者。尽管改变生活方式和常规药物治疗往往能成功地降低胆固醇水平，但并非所有患者都能用这些手段达到推荐的目标胆固醇水平。尽管积极地采用常规治疗，但各种各样的症状，如家族性高胆固醇血症(FH)，似乎会抵制降低LDL-C水平的措施。纯合和杂合家族性高胆固醇血症患者(hora、heFH)是与过早出现的动脉粥样硬化血管疾病相关的症状。但是，诊断为 hoFH的患者在很大程度上对常规的药物治疗无反应且只有有限的治疗选择。具体来说，采用抑制胆固醇合成和上调肝脏LDL受体而降低LDL-C的抑制素进行治疗，对LDL受体不存在或有缺陷的患者效果甚小。据最近报道，在用最高剂量抑制素治疗的基因型确定的hoFH 患者中，平均LDL-C下降还不到20%。在此治疗方案基础上增加IOmg/日的依泽替米贝 (ezetimibe)导致LDL-C水平总共下降了 27 %，但离最佳效果仍然相距甚远。类似地，许多患者对抑制素无反应、用抑制素治疗对病情的控制较差，或不能耐受抑制素治疗；一般来说，这些患者用其它治疗方式不能达到对胆固醇的控制。对于能克服现有治疗措施之缺点的新治疗方法有着很大的尚未满足的需要。可以本发明之方法治疗的具体人群包括需要LDL血浆置换的患者、PCSK9激活 (GOF)突变的患者、杂合家族性高胆固醇血症患者(heFH)；不耐受抑制素或抑制素无法控制的原发性高胆固醇血症患者；以及具有患高胆固醇血症的危险但可进行预防性治疗的患
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治疗给药和配方本发明提供了一些含有本发明之抗PCSK9抗体或其抗原结合片段的治疗组合物。 本发明之治疗组合物将与适宜的载体、赋形剂以及其它加入配方中改善转移、递送、耐受性等的制剂一起施用。在药剂化学师所熟知的处方集里可以找到大量的适宜配方。雷氏药学大全 -Remington' s Pharmaceutical SciencesiMack Publishing Company,Easton,PA. 0 这些配方包括，如粉剂、糊剂、油膏、凝胶、蜡剂、油剂、脂类、含有脂(阳离子或阴离子)的泡囊(如LIP0FECTIN )、DNA偶联物、无水吸收性糊剂、水包油或油包水乳剂、乳胶状碳蜡 (各种分子量的聚乙二醇)、半固体状凝胶以及含有聚乙二醇的半固体状混合物。还可参阅Powell et al. Compendium of Excipients for ParenteralFormulations (非肠道用配方赋形剂概论)，PDA (1998) J Pharm SciTechnol 52:238-311。其剂量可根据即将受药的受试者的年龄和体形大小、目标疾病、病症、给药途径等因素而改变。当本发明之抗体用于治疗与PCSK9相关的各种病症和疾病，包括高胆固醇血症、与LDL和载脂蛋白B相关的疾病，以及脂质代谢疾病等时，对于一名成年患者来说以静脉输入本发明之抗体是有利的。通常是按照约0. 01至约20mg/kg体重，较佳的是按照约 0. 02至7、约0. 03至约5，或约0. 05至约;3mg/kg体重的单一剂量输入。取决于病症的严重程度，治疗的频率和持续时间可以调节。各种给药系统是众所周知的并可用于本发明之医药组合物的给药，例如封装于脂质体、微粒、微胶囊中、能表达突变体病毒的重组细胞、受体介导的胞吞作用(参阅例如mi et al. (1987) J. Biol. Chem. 262 =4429-4432) 0给药方法包括但不限于皮内、肌内、腹腔内、 静脉、皮下、经鼻、硬膜外以及经口给药。该组合物可以任何方便的途径给药，例如，输注或快速注射，经上皮或粘膜(例如口腔黏膜、直肠和肠黏膜等)吸收，并可与其它生物活性剂一起给药。给药方式可以是全身性或局部性的。该医药组合物也可以微囊尤其是脂质体形式给药(参阅Langer (1990) Science 249 :1527-1533 ；Treat et al. (1989)in Liposomes inthe Therapy of Infectious Disease and Cancer (月旨质体用于传染病禾口癌症治疗)，Lopez-Berestein and Fidler (eds. ), Liss, New York, pp.353-365 ；Lopez-Berestein, ibid. , pp.317-327 ；一般参阅同上)。在某些情况下，该医药组合物可以一种控制性释放系统给药。在一个实施方案中， 可使用一个泵(参阅 Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14 :201)。在另一个实施方案中，可采用聚合物材料；参阅 Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRCPres.，Boca Raton, Florida (1974)。在又一个实施方案中，可将一种控制释放系统置于该组合物目标的附件，从而只需要全身性剂量的一部分(参阅例如， Goodson, in Medical Applications of Controlled Release (控制释放的医学应用)，出处同上，vol. 2，pp. 115-138，1984)。可注射制剂可包括静脉注射、皮下、皮内和肌内注射、滴注输液等剂型。这些可注射制剂可以公知的方法制备。例如，可以将上述抗体或其盐溶解、悬浮或乳化在无菌水介质或通常用于注射的油性介质中，以此方式制备该可注射制剂。作为注射用的水介质有例如生理盐水、含葡萄糖和其它助剂的等渗溶液等，可结合使用适当的增溶剂，如醇(如乙醇)、 多元醇(如丙二醇、聚乙二醇)，非离子型表面活性剂[例如聚山梨醇酯80、HC0_50(氢化蓖麻油的聚氧乙烯(50摩尔)加合物)]等。作为油性介质，可采用例如芝麻油、豆油等，可结合使用增溶剂，如苯甲酸苯甲酯、苯甲醇等。如此制备的注射液最好是装入一种适当的安瓿瓶中。本发明之医药组合物可用标准的针头和针筒经皮下或静脉注射。此外，对于皮下给药，一种笔型给药装置可方便地用于本发明之医药组合物的给药。这种笔型给药装置可以重复使用或一次性使用。可重复使用的笔型给药装置一般采用一种可更换的含医药组合物的药筒。一旦药筒内所有医药组合物均已输出、药筒变空，则可方便地丢弃空药筒，并用一个含医药组合物的新药筒取代。该笔型给药装置就可重复使用。在一次性使用的笔型给药装置中，没有可更换的药筒。而是，该一次性使用的笔型给药装置有一个预先充满医药组合物的贮液器。一旦该贮液器内药物组合物用完，整个装置则被丢弃。许多可重复使用的笔型和自动注射给药装置已用于本发明之医药组合物的皮下给药。其例子包括但当然不限于AUT0PENTM(0wenMumford，Inc.，Woodstock，英国)、 DISETR0NIC 笔(DisetronicMedical Systems，Burghdorf，瑞士)、HUMALOG MIX 75/25 笔、HUMAL0G 笔、HUMALIN 70/30 笔(Eli Lilly and Co.，印第安纳州印第安纳波利斯)、N0V0PEN I、II 禾Π III 型(Novo Nordisk，哥本哈根，丹麦)、N0V0PEN JUNIOR (Novo Nordisk，哥本哈根，丹麦)、BD 笔(Becton Dickinson，新泽西州富兰克林湖)、0ΡΤΙΡΕΝ 、 0ΡΤΙΡΕΝ PRO 、OPTIPEN STARLET ，以及 0PTICLIK (sanofi-aventis，德国法兰克福)，此处仅列举几个品牌。用于本发明之医药组合物皮下给药的一次性使用的笔型给药装置的例子包括但当然不限于 S0L0STAR 笔(sanofi-aventis)，FLEXPEN (Novo Nordisk)，以及 KWIKPEN (Eli Lilly)。有利的是，上述口服或注射用医药组合物是制备成单位剂量的剂型，以包含一定剂量的活性成分。这种单位剂量的剂型包括例如片剂、丸剂、胶囊、注射液(安瓿)、栓剂等。 单位剂量的上述抗体含量一般为每剂约5至约500mg ；尤其是注射剂型，首选的是上述抗体含量为约5至约lOOmg，其它剂型中抗体含量为约10至约250mg。本发明提供了一些治疗方法，其中将本发明之抗体或抗体片段用于治疗各种涉及hPCSK9的高胆固醇血症。本发明之抗PCSK9抗体或抗体片段对于高胆固醇血症及类似病症的治疗是尤其有用的。复合疗法可包括本发明之抗PCSK9抗体与例如一种或多种药剂结合，该药剂(1)通过抑制3-羟基-3-甲基戊二酰(HMG)-辅酶A(CoA)还原酶能够诱导胆固醇合成的细胞清除，如西利维司汀(cerivastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、 辛伐他汀(simvastatin)、匹伐他汀(pitavastatin)、瑞舒伐它汀(rosuvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(Iovastatin)、普伐他汀(pravastatin) ； (2)能够抑制胆固醇吸收和/或胆汁酸再吸收；C3)能够增加脂蛋白分解代谢(如烟酸)；以及在胆固醇如22-羟基胆固醇的清除过程中起作用的LXR转录因子的活化剂，或一种固定的结合如依泽替米贝(ezetimibe)加辛伐他汀(simvastatin)；—种抑制素加胆汁树脂(如消胆胺 (cholestyramine)、降脂树脂 II (colestipol)、考来维仑(colesevelam)，烟酸与一种抑制素的固定结合(如烟酸加洛伐他汀)；或与其它降脂质药剂如欧米加-3-脂肪酸乙酯(如 omacor)的固定结合。
实施例举出以下实施例是为了向本领域一般技术人员就如何利用本发明之方法和组合物提供一个完整的披露和说明，并非是为了限制被发明者视为其发明的范围。已作出许多努力以确保所用数字的准确性，但也应考虑到某些实验误差和偏差。除非另有说明，分子量是指平均分子量，温度是指摄氏度，压力是指大气压或接近大气压。
实施例1 抗人PCSK9的人抗体的产生将VEL0CIMMUNE 小鼠用人PCSK9免疫，并以抗原特异免疫测定法用这些小鼠的血清以监测抗原免疫反应。从显示较高抗hPCSK9抗体效价的免疫小鼠的脾脏收获表达B细胞的抗hPCSK9，并与小鼠骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤。使用如下所述的分析法筛选该杂交瘤以鉴定表达hPCSK9特异性抗体的细胞系。该分析法鉴定了几种产生嵌合的抗hPCSK9抗体的细胞系，这些抗体分别以 H1M300、H1M504、H1M505、H1M500、H1M497、H1M498、H1M494、 H1M309、H1M312、H1M499、H1M493、H1M496、H1M503、H1M502、H1M508、H1M495 以及 H1M492 表不。如美国专利2007/(^80945Α1中所述，人PCSK9特异性抗体还可从经抗原免疫的B 细胞直接分离而不与骨髓瘤细胞融合。克隆重链和轻链可变域以产生完全人抗hPCSK9抗体，分别 H1H313、H1H314、H1H315、H1H316、H1H317、H1H318、H1H320、H1H321 以及 H1H334 表示。表达这些抗体的稳定的重组CHO细胞系得以确定。
实施例2 基因利用分析为了分析所产生mAbs的结构，对编码抗体可变区的核酸进行了克隆和测序。经 N-端氨基酸测序证实了预测的可变区氨基酸序列。从mAbs的核酸序列和预测的氨基酸序列出发，为每种抗体链鉴定了基因的用途。
表1抗体重链可变区轻链可变区VHDJHVKJKH1H3133-131-2643-153H1H3143-333-341-52H1H3153-333-344-11H1H3163-237-2724-12H1H3173-131-2641-61H1H3184-593-1061-91H1H3201-182-262-301H1H3212-51-762-284H1H3342-56-662-284H1M3003-72-862-284H1M5043-302-862-284H1M5053-302-862-284H1M5002-55-562-284H1M4971-182-262-302H1M4983-212-241-52H1M4943-115-1263-204H1M3093-216-1341-51H1M3123-216-1341-51H1M4993-216-1341-51H1M4933-216-1341-51H1M4963-136-1943-153H1M5031-182-262-281H1M5023-136-1343-153H1M5083-136-1343-153H1M4953-94-1761-93H1M4923-233-323-204
实施方案3 抗原结合亲和力测定
hPCSK9与上述杂交瘤细胞系所产生的mAbs结合的平衡离解常数(Kd)是根据实时生物传感器表面等离子体共振分析(BIAC0RE T100)的表面动力学测定的。通过与 BIAC0RE 芯片直接化学偶联而产生山羊抗小鼠IgG多克隆抗体，以4μ Ι/min的流量将每种抗体捕获在其表面上达90秒钟，以形成捕获抗体表面。将浓度为50nM或12. 5nM的 hPCSK9-myc-myc-his(hPCSK9-mmh)注射在该捕获抗体的表面上,流量为50 μ 1/min，注射 300秒钟，并于25°C或37°C监测抗原-抗体离解过程达15分钟(KD = pM ；T1/2 = min)。 表权利要求
1.一种与人类前蛋白转化酶枯草溶菌素9(hPCSK9)特异性结合的人抗体或人抗体的抗原结合片段，它具有以下一种或多种特征(i)相对于给药前水平，能够使血清总胆固醇含量下降至少约25至35%，并保持这种下降趋势达至少对天；(ii)相对于给药前水平，能够使血清LDL胆固醇含量下降至少约65至80%，并保持这种下降趋势达至少M天，或能够使血清LDL胆固醇含量下降至少约40至70%，并保持这种下降趋势达至少60至90天；(iii)相对于给药前水平，能够使血清甘油三酯含量下降至少约25至40%；(iv)达到(i)至(iii)中的一项或多项而不降低血清HDL胆固醇含量，或相对于给药前水平降低血清HDL胆固醇含量不超过5% ；(ν)达到(i)至(iii)中的一项或多项但根据ALT和AST测量确定，对肝功能影响很小或没有可测量的影响。
2.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，它包括一个选自下列一组序列的重链 CDR3(HCDR3)域SEQ ID NO :8、32、56、80、104、128、 152、176、200、224、248、272、296、320、344、368、392、416、440、464、488、512、536、560、584、 608、632、656、680、704 和 728 ；以及一个选自下列一组序列的轻链 CDR3(LCDR3)域SEQ ID NO :16、40、64、88、112、136、 160、184、208、232、256、280、304、328、352、376、400、424、448、472、496、520、544、568、592、 616、639、664、688、712 以及 736。
3.如权利要求2所述的抗体或抗原结合片段，其中HCDR3/IXDR3是SEQID NO :80/88 或 224/232。
4.如权利要求2所述的抗体或抗原结合片段，它进一步包括一个选自下列一组序列的重链 CDRl (HCDRl)域SEQ ID NO :4、28、52、76、100、124、 148、172、196、220、244、268、292、316、340、364、388、412、436、460、484、508、532、556、580、 604、628、652、676、7000 以及 724 ；一个选自下列一组序列的重链 CDR2(HCDR2)域SEQ ID NO :6、30、M、78、102、126、 150、174、198、222、246、270、294、318、342、366、390、414、438、462、486、510、534、558、582、 606、630、654、678、702 以及 726 ；一个选自下列一组序列的轻链 CDRl (LCDRl)域SEQ ID NO 12、36、60、84、108、132、 156、180、204、228、252、276、300、324、348、372、396、420、444、468、492、516、540、564、588、 612、636、660、684、708 和 732 ；以及一个选自下列一组序列的轻链 CDR2(LCDR2)域SEQ ID NO :14、38、62、86、110、134、 158、182、206、230、254、278、302、326、350、374、398、422、446、470、494、518、542、566、590、 614、638、662、686、710 和 734。
5.如权利要求4所述的抗体或抗原结合片段，其中的轻链和重链CDR序列是选自以下一组序列SEQ ID NO :76、78、80、84、86、88 ；SEQ ID NO :220、222、224、228、230、232。
6.如以上任何一项申请专利范围所述的抗体或抗原结合片段，其中HCVR是SEQIDNO 90 或 218，LCVR 是 SEQ ID NO 90 或 218。
7.如权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其包含一个HCDR3序列和一个LCDR3序列，其中该 HCDR3 包含一个结构式为 Xi-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xici-Xii-X12-X13-X14-X15-X16-X17-X18-X19-X20 的氨基酸序列(SEQID NO :747)，其中 X1 是 Ala ；X2 是 Arg 或 Lys ；X3 是 Asp ；X4 是 Ser 或 Ile ；X5 是 Asn 或 Val ；X6 是 Leu 或 Trp ；X7 是 Gly 或 Met ；X8 是 Asn 或 Val ；X9 是 Phe 或Tyr ；X10是Asp ；X11是Leu或Met ；X12是Asp或缺位；X13是Tyr或缺位；X14是Tyr或缺位；X15是Tyr或缺位；X16是Tyr或缺位；X17是Gly或缺位；X18是Met或缺位；X19是Asp或缺位；以及X2°是Val或缺位；以及该LCDR3包含一个结构式为X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9的氨基酸序列(SEQ ID NO: 750)，其中 X1 是 Gln 或 Met ；X2 是 Gln ；X3 是 Tyr 或 Thr ；X4 是 Tyr 或 Leu ；X5 是 Thr 或 Gln ； X6 是 Thr ；X7 是 Pro ；X8 是 Tyr 或 Leu ；以及 X9 是 Thr。
8.如权利要求7所述之抗体或抗原结合片段，其进一步包含HCDRl、HCDR2、IXDRl和 LCDR2，其中该 HCDRl 包含一个结构式为 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 的氨基酸序列(SEQ ID NO :745)， 其中 X1 是 Gly ；X2 是 Phe ；X3 是 Thr ；X4 是 Phe ；X5 是 Ser 或 Asn ；X6 是 Ser 或 Asn ；X7 是 Tyr 或His ；以及X8是Ala或Trp ；该 HCDR2 包含一个结构式为 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8 的氨基酸序列(SEQ ID NO :746)， 其中 X1 是 lie ;X2 是 Ser 或 Asn ；X3 是 Gly 或 Gln ；X4 是 Asp 或 Ser ；X5 是 Gly ；X6 是 Ser 或 Gly ；X7 是 Thr 或 Glu ；以及 X8 是 Thr 或 Lys ；该 LCDRl 包含一个结构式为 X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-Xici-X11-X12 的氨基酸序列(SEQ ID NO :748)，其中 X1 是 Gln ；父2是^^ ；X3 是 Val 或 Leu ；X4 是 Leu ；X5 是 His 或 Tyr ；X6 是 Arg 或 kr ；X7 是 Ser 或 Asn ；X8 是 Asn 或 Gly ；X9 是 Asn ；X10 是 Arg 或 Asn ；X11 是 Asn 或 Tyr ；以及X12是Phe或缺位；该LCDR2包含一个结构式为X1-X2-X3的氨基酸序列(SEQ IDNO :749)，其中X1是Trp或 Leu ；X2 是 Ala 或 Gly,以及 X3 是 Ser。
9.如以上任何一项申请专利范围所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体或其片段与一种变异PCSK9蛋白的结合与该抗体或其片段与SEQID NO :755的PCSK9蛋白之间的结合相比低于50%。
10.如权利要求9所述的抗体或抗原结合片段，其中的变异PCSK9蛋白在选自下列一组的位置上含有至少一个残基突变S153、E159、D238 和 D343 ；或S147、E366 和 V380。
11.如以上任何一项权利要求所述的抗体或抗原结合片段，其包括一个由衍生自VH、 和Jh种系基因片段的核苷酸序列片段编码的重链可变区(HCVR)，一个由衍生自Vk和Jk种系基因片段的核苷酸序列片段编码的轻链可变区(LCVR)，其中该种系序列为a)Vh基因3-23、Dh基因7_27、Jh基因2、Vk基因4_1、Jk基因2，或b)VH基因3-7、Dh基因2-8、Jh基因6、Vk基因2_28、Jk基因4。
12.—种编码上述任何一项权利要求所述抗体或抗原结合片段的分离的核酸分子。
13.一种包含如权利要求11所述核酸分子的表达载体。
14.一种产生抗人PCSK9抗体或抗体的抗原结合片段的方法，其步骤包括将权利要求 13所述之表达载体引入一个分离的宿主细胞，在允许抗体或其片段产生和收集所产生抗体或其片段的条件下培养该细胞。
15.一种含有如权利要求1至11所述之抗体或抗原结合片段以及一种药学上可接受载体的药物组合物。
16.如权利要求15所述之药物组合物，其进一步包含第二种治疗剂，该第二种治疗剂选自一种3-羟基-3-甲基戊二酰(HMG)-辅酶A (CoA)还原酶的抑制剂、一种抑制素、一种胆固醇吸收和/或胆汁酸再吸收的抑制剂、一种增加脂蛋白分解代谢的药剂，或一种L)(R转录因子活化剂。
17.一种治疗可用PCSK9拮抗剂减轻、改善、抑制或预防的疾病或症状的方法，其包括给需要治疗的患者施用一种治疗剂量的如权利要求15或16所述之药物组合物。
18.如权利要求17所述之方法，其中所述患者是人类患者，患有高胆固醇血症、高血脂症、需要LDL血浆置换、被诊断为杂合家族性高胆固醇血症、抑制素不耐受症、抑制素无法控制、具有患高胆固醇血症的危险、血脂异常、胆汁郁积型肝病、肾病综合征、甲状腺机能减退、肥胖症、动脉粥样硬化以及心血管疾病。
19.一种如权利要求1至11项中任何一所述之抗体或抗体的抗原结合片段，用于减轻或抑制PCSK9介导的疾病或病症。
20.在用于减轻或抑制PCSK9介导的疾病或病症的药剂制造过程中，应用如权利要求1 至7项中任何一所述之抗体或抗体的抗原结合片段。
21.如权利要求20所述之应用，其中PCSK9介导的疾病或症状是高胆固醇血症、高血脂症、需要LDL血浆置换、杂合家族性高胆固醇血症、抑制素不耐受症、抑制素无法控制、具有患高胆固醇血症的危险、血脂异常、胆汁郁积型肝病、肾病综合征、甲状腺机能减退、肥胖症、动脉粥样硬化以及心血管疾病。
全文摘要
一种与人类前蛋白转化酶枯草溶菌素9(hPCSK9)特异性结合并抑制其活性的人抗体或人抗体的抗原结合片段，其特征为，相对于给药前水平，能使血清LDL胆固醇含量下降40至80％达24天、60天或90天，而血清HDL胆固醇含量则下降很少或不下降，且经ALT和AST测量确定对肝功能影响很小或没有可测量的影响。
文档编号C12N9/64GK102245641SQ200980150206
公开日2011年11月16日 申请日期2009年12月15日 优先权日2008年12月15日
发明者D·麦克唐纳, J·H·马丁, M·W·斯利曼, T·T·黄 申请人:瑞泽恩制药公司