高mast2亲和力多肽及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及含有胞质域的多肽，所述胞质域末端为MAST-2结合域，所述MAST-2结合域长11-13个残基，其头两个残基为S和W，而最后4个残基为Q、T、R和L，所述多肽展现对人MAST2蛋白PDZ结构域的高亲和力。本发明还涉及多核苷酸、包含其的载体、慢病毒粒子、细胞以及组合物。本发明还涉及所述多肽、多核苷酸、载体、慢病毒粒子、细胞和组合物在治疗和/或预防改变中枢神经系统(CNS)和/或周围神经系统(PNS)的疾病、病患或病症中的用途。本发明还涉及用于确定分子的神经生存和/或神经保护活性的细胞基因分子标签。
【专利说明】高MAST2亲和力多肽及其应用 发明领域
[0001] 本发明涉及含有胞质域的多肽，所述胞质域末端为MAST-2结合域，所述MAST-2结 合域的头两个残基为S和W，而最后4个残基为Q、T、R和L，所述多肽展现对人MAST2蛋白 PDZ结构域的高亲和力。本发明还涉及包含其的多核苷酸、载体、慢病毒粒子、细胞以及组合 物。本发明还涉及所述多肽、多核苷酸、载体、慢病毒粒子、细胞和组合物在治疗和/或预防 改变中枢神经系统（CNS)和/或周围神经系统（PNS)的疾病、病患或病症中的应用。本发 明还涉及用于确定分子的神经生存和/或神经保护活性的细胞基因的分子标签。
[0002] 发明背景
[0003] 在神经系统发育期间，为了以合适的方式支配它们的靶标，神经元在相当长的距 离上延伸轴突。这包括刺激细胞中能刺激生长锥活性的特定信号转导通路。
[0004] 虽然发育中的神经系统，尤其是发育中的中枢神经系统，是高度可塑的，但成熟的 神经系统，尤其是成熟的脑，具有较有限的修复潜能。因此，为了改善神经退行性疾病、病患 或病症如神经系统的急性损伤或慢性神经退行性病患的结果，神经突-轴突增生和针对退 化的保护是需要考虑的重要因素。能从此类神经元细胞诱导神经突增生的产品，将带来针 对此类疾病、病患或病症的非常有效的治疗和/或预防和/或减轻方案。
[0005] 在神经元发育过程的另一方面，不分化为成熟的神经元结构的神经元前体细胞的 增殖引起神经系统瘤。能从此类前体细胞诱导神经突增生的产品，将带来针对此类肿瘤的 治疗和/或预防和/或减轻方案。
[0006] 已有描述狂犬病毒株的致病性与其诱导细胞凋亡的能力呈负相关（W003/048198 ; Ugolinil995;Sarmento et al. 2005 ;Ugolini2008 ;Jackson et al. 2008)。因此，狂犬病 毒株毒力越强，细胞凋亡越少。该发现表明烈性狂犬病毒株如CVS病毒株不诱导神经元细 胞凋亡，并解释了为何烈性狂犬病毒株能够在出现疾病病症和症状前在CNS中如此广泛地 增殖。
[0007] 最近，Pr6haud et al. (2010)报导了狂犬病毒G蛋白胞质域的C端区涉及G蛋 白与人微管相关的丝氨酸苏氨酸激酶2--MAST2蛋白的PDZ结构域的结合。该C端区具 有称为H)Z-BS(PDZ结合位点）的4个氨基酸的基序，其在烈性狂犬病病毒株中具有序列 QTRL，而在减毒株中具有序列ETRL。因此，已表明烈性狂犬病毒株的G蛋白能以高亲和力与 MAST-1和MAST-2结合，而不能结合PTPN4、DLG2和MPDZ。相反，已表明减毒狂犬病毒株的 G蛋白能与MAST-1、MAST-2、PTPN4、DLG2和MPDZ结合。有关烈性和减毒狂犬病毒株G蛋白 结合方式的该差异似乎与这些病毒株毒力的差异有关（图2)。
[0008] 因此，如申请W02010/116258中所阐述，狂犬病毒G蛋白491(H/L)和521(Q/E)位 置处的氨基酸残基的性质对神经元生存和神经突增生的影响具有重要作用。烈性狂犬病毒 株的491位置处显示Η残基和521位置处显示Q残基的G蛋白，为非细胞凋亡性的，并有利 于神经突增生。相反，减毒狂犬病毒株的491位置处显示L残基和521位置处显示Ε残基 的G蛋白为细胞凋亡性的，并且不促进神经突增生。
[0009] 基于这些结果，本领域需要确定和设计具有促进神经突增生和神经生存的改善的 性能的方式。本发明提供了用于神经元再生和防护的方式，其源于狂犬病毒株的G蛋白，并 显示出乎意料的性能。本发明还涉及用于筛选适合神经元再生和防护分子的方式。
【专利附图】
【附图说明】
[0010] 图1.狂犬病毒（RABV)蛋白G在细胞中的加工：翻译后，蛋白G为I型跨?吴糖蛋 白，在内质网（ER)处合成，然后通过分泌途径处理以到达高尔基体，在高尔基体中其被在 其胞外结构域上糖基化。随后，该蛋白被递送至细胞质膜，在质膜中其通过其跨膜结构域被 锚定。G蛋白的胞质域总是与细胞质接触。
[0011] 图2. (Α)本发明多肽（Neurovita多肽）通过与其细胞伴侣--人MAST2蛋白（微 管相关的丝氨酸-苏氨酸激酶2)相互作用而产生作用的方式的图示；(B)PI3K/Akt信号通 路参与神经元生理机能的图示。
[0012] 图3. RABV介导的神经保护期间刺激的激酶的识别：有丝分裂后的人神经元NT2-N 中的激酶组（Kinome)图谱。（A)覆盖整个人激酶组的肽微阵列载片。（B)得到的以重组 rRABV(RABV-CVSHQ)感染45h的NT2-N细胞的激酶组图谱的图示。圆点表示NT2-N细胞中 在rRABV神经生存性感染后激活的激酶。
[0013] 图4. (A)G蛋白（第一条线）和Neurovital多肽（第二条线）的图示；SP :信号肽， EC :胞外结构域，TM :跨膜结构域，Cyto :胞质域，PDZ-BS :PDZ结合位点，还显示了每个结构 域的氨基酸残基（aa)的数目，（B)感染后48h(p. i.)通过蛋白质印迹法测得的，Neurovital 和他111'〇￥^&1八^)2-85通过慢病毒载体在呢细胞或人神经母细胞瘤细胞（5!1-5￥5￥)中的 表达（L Neurovital ;2· Neurovital Λ PDZ-BS ;3·阴性对照），（C)通过免疫荧光法在 48h P. i.测得的，Neurovital和NeurovitalAFOZ-BS通过慢病毒载体在NS细胞的表达。在 (B)和（C)中，采用RABV Cyto-G特异性的抗体进行检测。
[0014] 图5. Neurovital以H)Z-BS依赖性方式在NS和SH-SY5Y中引发神经突增生。（A) 慢病毒载体感染（30h，p. i.)后SH-SY-5Y人神经母细胞瘤细胞中的神经突增生检测。细胞 以db c-AMP(10 μ Μ)处理。（Β)慢病毒载体感染（72h p. i.)后NS细胞中的神经突增生检 测。细胞以NGF(200ng/ml)处理，Γ:ρ〈0·05,学生检验）。
[0015] 图6. (A)Neurovital介导的神经保护的遗传分子标签的确定；基因表达基于人神 经发生和神经干细胞PCR以及PI3K-Akt信号通路检测，在具有表达Neurovital的慢病毒 载体（24h p. i.)的NT2-N细胞中测得；(B)采用聚焦于该通路的基因表达图谱（qRT-PCR) 获得的Neurovital遗传分子标签的图示。基因簇代表Neurovital感染后被调节、但在未感 染培养物或感染了 Neurovital ΛH)Z-BS的培养物中未被调节的基因（圆点为Neurovital 特异性基因；方块为关联基因）。
[0016] 图7.基于人神经发生和神经干细胞PCR以及PI3K_Akt信号通路检测确定的，缺 少MAST2的Neurovital的分子标签；通过表达Neurovital的慢病毒载体感染NT2-N细胞后 (24h p. i.)的遗传分子标签，其中通过在以慢病毒载体Neurovital感染前48h用Sh RNA MAST2特异性重组慢病毒感染，MAST2表达被敲除。
[0017] 图8.慢病毒载体Neurovital利于NT2-N轴突的创伤愈合。（A)刮伤检测的展示， (B)创伤6天后的再生的阐示，（C)慢病毒载体Neurovital或Neurovital AF>DZ-BS感染后 轴突再生的比较。
[0018] 图9. Neurovital介导的轴突再生的分子标签；聚焦于通路的基因表达图谱于创 伤后2天在NT2-N细胞培养物确立。（A)PI3K/Akt信号通路中涉及的基因（人PI3K-AKT信 号转导PCR检测）。（B)细胞增殖、粘附、分化、生长因子和突触功能中涉及的基因（人神经 发生和神经干细胞PCR检测）。（C)Neurovital介导的轴突再生中涉及的基因的簇图示（圆 点为neurovita特异性基因；方块为关联基因）。
[0019] 图10.结构/功能分析。（A)Neurovital序列的序列和三维组织。（B)本发明多 肽（Neurovita多肽）对MAST2-PDZ的亲和力与其神经生存性能间的关联。
[0020] 图11.㈧本发明多肽的图示；SP:信号肽，EC:胞外结构域，TM:跨膜结构域， Cyto:胞质域。还显示了每个结构域的氨基酸残基（aa)的数目，（B)本发明的2个具体多 肤（Neurovita2 和 Neurovita3)的蛋白序列，以及与 Neurovital 和 Neurovital AFOZ-BS 多肽序列的比较，（C)通过蛋白质印迹（48h p. i.)、使用RABV Cyto-G特异性抗体测得的， Neurovital、Neurovital Δ roZ-BS 和 Neurovita2 通过慢病毒载体（lentivector)在 NS 细 胞中的表达（lzNeurovitaZJzNeurovitalAroZ-BSdzNeurovital,和 4:阴性对照）。
[0021] 图12.慢病毒载体感染（72h p. i.)后在NS细胞中进行的神经突增生检测。细胞 以NGF(200ng/ml)处理（N. I.未处理的细胞）。
[0022] 图13. Neurovitas诱导NS细胞中的神经突枝。（A)以Neurovita2 (上图）或 Neurovital (下图）感染的代表性NS细胞的枝状结构的示意性重绘，（B)通过针对以 Neurovital (黑色方框）和Neur〇vita2 (黑色圆圈）慢病毒载体感染72h的NS培养物的 Shol 1分析测得的神经突树的复杂性。
[0023] 图14.Neurovita2的遗传分子标签的确定。（A)通过慢病毒载体在NT2-N细胞 (24h p. i.)中确定的P0U4F1、DRD2、F0S和BTK的下调。⑶采用聚焦通路的基因表达图谱 (qRT-PCR)获得的Neurovita2遗传分子标签的图示。基因簇表示Neurovita2感染后被调 节，但在未感染培养物或感染了 Neurovital ΛH)Z-BS的培养物中未被调节的基因（圆点为 neurovita特异性基因；方块为关联基因）。
[0024] 图 15. Neurovita 慢病毒载体感染后，NT2-N 细胞中（A)rRABV 在 24h(p. i.)和（B) 慢病毒载体在48h(p. i.)的转录。转录通过RT-QPCR测得。
[0025] 图16.先天免疫基因的激活。㈧以rRABV CVS HQ和rRABV CVSHA4感染后 (Ν· I.:未感染的）或（B)以 Neurovital、Neurovital AFOZ-BS 和 Neurovita2 慢病毒载体 (neg:阴性对照）感染后，（A) -组代表性免疫基因（NT2-N细胞中的）的转录。
[0026] 图17.创伤后NT2-N细胞中的轴突再生。（A)NT2_N细胞中酪氨酸羟化酶（TH)-- 一种多巴胺能神经元标志物的表达，（B)NT2-N培养物中的TH mRNA转录，以18S作为标 准，（C)在针对MAST-2的SHRNA(si MAST2)存在或不存在下，以Neurovital进行慢病毒 载体感染后的轴突再生；N.I.:未感染的，结果表示为再生的刮伤神经元的百分比，（D)以 Neurovital或Neurovita2慢病毒载体感染后的轴突再生；N. I.:未感染的。
[0027] 图18.在KC1不存在（圆圈）或存在（方块）下（A)以阴性对照进行慢病毒感染 后27h，或（B)在KC1存在下以Neur〇vita2慢病毒载体感染（星形）后，通过针对NS培养 物的Sholl分析测得的神经突树的复杂性。
[0028] 图19. (A)在LiCl不存在或存在下于未感染的（N. I.)NS细胞中，和⑶在LiCl 处理的 NS 细胞、未感染的（Ν· I.)或者以 Neurovital (NV1)、Neurovital ΛPDZ-BS(NV1 Λ) 或Neurovita2 (NV2)慢病毒载体感染后的细胞中进行的神经突增生检测。
[0029] 图20.由G全长、NV1和NVlcyto引发的神经突增生的比较。⑷RABV G全长、 Neurovital和胞质形式的Neurovital (NVlcyto)的图示；SP :信号肽，EC :胞外结构域，TM : 跨膜结构域，Cyto :胞质域，PDZ-BS :PDZ结合位点，还显示了每个结构域的若干氨基酸残基 Neurovital-cyto 和 Neurovital-cytoAFOZ-BS 感染后（Ν· I.:未感染的）NS 中的神经突增 生检测。
[0030] 图21.NS细胞中来自双顺反子慢病毒载体的Neurovita分子的表达。（A) pLenti7. 3Neurovita 双顺反子慢病毒载体的图不，（B) Neurovital Δ roZ-BS (NV1 Δ )、 Neurovital(NVl)、Neurovita2(NV2)或 Neurovita3(NV3)的 mRNA 相对倍数增加，以 18S 作 为标准，（C)通过流式细胞术测得的以表达NV1 Λ -、NV1-、NV2-或NV3的慢病毒载体感染NS 细胞后的GFP表达；结果表示为培养物中表达GFP的细胞的百分比；Neg为未感染的细胞， (D)通过蛋白质印迹测得的NS细胞中NV1 Λ、NV1、NV2或NV3的表达，（E)在相应的溶解产 物中以微管蛋白的表达作为内在蛋白载荷对照。
[0031] 图22. NS培养物中由NV3引发的神经突增生。⑷未感染的（左图）或以 Neur〇vita3感染的（右图）代表性NS细胞的枝状结构的示意性重绘；⑶以NV1 Λ、NV1、 NV2或NV3慢病毒载体感染后NS细胞中的神经突增生检测；（C)学生t检验（ρ〈0. 05)。
[0032] 图23. NS培养物中由NV3引发的树状分枝（arborisation)。（Α)通过针对未感 染的相对感染了 Neurovital的、感染了 Neurovital相对感染了 Neurovita3的，或感染了 Neurovita2相对感染了 Neurovita3的NS细胞的Sholl分析测得的神经突树的复杂性；(B) 双因素 AN0VA(p〈0. 05)。
[0033] 图24.NV3胞质（NV3cyto)慢病毒载体的构建。（A)Neurovita3和胞质形式的 Neurovita3(NV3cyto)的图示；SP :信号肽，EC :胞外结构域，TM :跨膜结构域，Cyto :胞质 域，PDZ-BS :PDZ结合位点。还显示了每个结构域的氨基酸残基（aa)的数目；(B)表达NV3 或NV3_cyto的pLenti7. 3Neurovita双顺反子慢病毒载体的图示；（C)NV3和NV3cyto的相 对增加倍数，以18S作为标准；(D)通过细胞荧光测定法测得的以表达NV3或NV3cyto的慢 病毒载体感染后的GFP表达；结果表示为培养物中GFP阳性细胞的百分比；neg为未感染的 细胞。
[0034] 图25. NV3_cyto诱导的神经突增生与NV1和NV3的那些的比较。（A)感染了 NV1、NV3或NV3-cyto的代表性NS细胞的枝状结构的示意性重绘；⑶以NV1、NV2、NV3或 NV3-cyto慢病毒载体感染后NS细胞中的神经突增生检测；（C)学生t检验（p〈0. 05)。
[0035] 图26. NV3_cyto诱导的神经突树与NV1和NV3的那些的比较。（A)通过针对感染 了 NV1相对感染了 NV3cyto的，或感染了 NV3相对感染了 NV3cyto的NS培养物的Sholl分 析测得的神经突树的复杂性；(B)双因素 AN0VA(p〈0. 05)。
[0036] 图27.在培养E16小鼠胎儿皮质神经元中通过NV1和NV1 Λ诱导的神经突生成。 3天体外㈧未感染的或通过NV1 (Β)或NV1 Λ (C)慢病毒载体感染3天，β III微管蛋白 (神经元形式）染色的Ε16小鼠皮质神经元的代表性图；(D)以NV1或NV1 Λ慢病毒载体感 染后皮质神经元中的神经突增生检测。
[0037] 图28.在通过脑内途径以NV1或NV1 Λ慢病毒载体感染的新生小鼠中进行的毒性 检测。（A)确定的未注射小鼠或注射了 NV1或NV1 △慢病毒载体的小鼠的体重；(B)慢病毒 感染3个月后脑中NV1或NV1 Λ转录物的表达，以18S作为标准。
[0038] 图29.被以NV1或NV1 Λ慢病毒载体注射至脑中的小鼠的表型。（A)NV1，注射（pi) 后第4天；(B)注射了 NV1的小鼠（pi)，第20天；（C)注射了 NV1A的小鼠（pi)，第4天； ⑶注射了 NV1 Λ的小鼠（pi)，第20天；箭头表示未注射的（N.I.)小鼠（切除了尾巴）。
[0039] 图30.以NV1慢病毒载体通过脑内途径注射的小鼠的脑（纹状体）的免疫染色。 (A)采用GFP荧光（绿色）、Map2染色（红色）和GFAP染色（紫色）进行的纹状体的免疫 染色。（B)采用GFP荧光（绿色）、Map2染色（红色）和GFAP染色（紫色）进行的树状轴 突树的免疫染色。
[0040] 图31.以NV1 Λ慢病毒载体注射至脑中的小鼠的纹状体免疫染色；GFP荧光（绿 色）、Map2染色（红色）和GFAP染色（紫色）。
[0041] 发明详述
[0042] 在本申请中，发明人出乎意料地表明序列包含残基SW和残基QTRL、具有针对人 MAST2蛋白PDZ结构域的高亲和力的多肽，对增加神经突增生和神经生存性能具有特别有 趣的效果。因此，由本发明多肽与人MAST2蛋白PDZ结构域形成的复合物的解离常数（K D) 越低，本发明多肽的神经生存性能越高。
[0043] 本发明涉及本文所定义的多肽，其展现针对人MAST2蛋白PDZ结构域的高亲和力 (SEQIDN0:6为全长人MAST2蛋白，而SEQIDN0:7为其PDZ结构域）。
[0044] 换言之，如本文所定义的本发明的多肽以这样的方式设计，其与人MAST2蛋白Η)Ζ 结构域形成的复合物的解离常数（KD)非常低，且因此其对人MAST2蛋白PDZ结构域的亲和 力非常高（亲和力与K D成反比）。
[0045] 因此，在第一个实施方案中，本发明的多肽展现针对人MAST2蛋白PDZ结构域的结 合亲和力，其大于针对包含SWESHKSGGQTRL序列（SEQ ID NO: 1)的狂犬病毒G蛋白MAST2 蛋白的roz结构域的结合亲和力。
[0046] 在具体的实施方案中，本发明多肽相比具有由SWESHKSGGQTRL组成的MAST-2结合 域的多肽的亲和力的增加（例如，K D比）范围为2. 5-20,且特别是5-20、5-15或5-10。
[0047] 在具体的实施方案中，由本发明多肽与人MAST2蛋白PDZ结构域形成的复合物的 解离常数（K D)小于ΙμΜ、小于0. 8μΜ、小于0. 5μΜ、小于0. 4μΜ或小于0. 3μΜ。在优选 的实施方案中，由本发明多肽与人MAST2蛋白PDA结构域形成的复合物的解离常数小于 〇· 2 μ M，优选小于0· 15 μ M，更优选小于0· 1 μ M。
[0048] 在具体的实施方案中，由本发明多肽与人MAST2蛋白PDA结构域（MAST2-PDZ)形 成的复合物的解离常数（K D)通过等温滴定量热法（ITC)测定。
[0049] 作为ITC的具体实施方案，确定了多肽浓度范围为250 μ Μ-350 μ Μ(优选在含有 50mM Tris-HCl、150mM NaCl，pH7. 5的缓冲液中进行），且MAST2-PDZ结构域的初始浓度为 30μΜ的，由本发明多肽与人MAST2蛋白PDA结构域（MAST2-PDZ)形成的复合物的解离常 数。
[0050] 作为ITC的具体实施方案，按如下确定由本发明多肽与人MAST2蛋白PDA结构 域形成的复合物的解离常数：在含有50mM Tris-HCl、150mM NaCl，pH7. 5的缓冲液中，以 250 μ Μ-350 μ Μ的初始浓度范围制备本发明多肽。ITC(等温滴定量热法）测量的进行使用 来自 Microcal(Northampton，MA)的 Microcal VP ITC200 等温滴定热量计，通过在 298K 注 射按上述制备的本发明多肽来滴定MAST2-PDZ (以30 μ Μ的初始浓度）（具体多肽的每次滴 定包括以6分钟间隔进行的25-45次连续输注5-7 μ L的整份）。将原始数据针对多肽的稀 释热进行标准化和校正。平衡解离常数的确定使用0rigin7. 0软件（OriginLab)进行，经 非线性曲线将校正数据拟合为具有一组点的模型。
[0051] 本发明多肽针对人PTPN4蛋白PDZ结构域的亲和力较低，即由本发明多肽与人 PTPN4蛋白PDZ结构域形成的复合物的解离常数（KD)较高，具体而言大于500μΜ(例如通 过ITC测得的，尤其是在相同的病症中，且具有关于上述MAST2-PDZ的相同的浓度）。已表 明K D (针对人ΡΤΡΝ4蛋白PDZ结构域的）的该较高值达到了本发明的最后4个残基为Q、T、 R和L多肽的值。
[0052] 因此，本文通过以下结构特征描述了多肽，其针对人MAST2蛋白PDA结构域具有高 亲和力，和/或以这样的方式设计，其与人MAST2蛋白PDA结构域形成的复合物的解离常数 (Kd)在上述范围内。
[0053] 因此，本发明涉及多肽，其为至多350个氨基酸残基长，包含或由胞质域组成。表 述"胞质域"是指末端为本文定义的MAST-2结合域的蛋白结构域，并且其暴露于细胞胞质 中，优选所述多肽具有结构或序列以允许其被锚定在细胞膜中的情形。根据本发明，所述多 肽可包含或不包含允许本发明多肽被锚定在膜中的结构或序列。当所述多肽不具有允许锚 定在膜中的结构或序列时，例如当所述多肽由本文定义的胞质域组成时，本发明多肽为胞 质性的。
[0054] 在具体的实施方案中，在人MAST2蛋白PDA结构域与不具有允许其被锚定在膜中 的结构或序列的本发明多肽，尤其是由本文定义的胞质域组成的多肽间形成的复合物的解 离常数（K D)小于1 μ M、小于0. 5 μ M、小于0. 4μ Μ或小于0. 3 μ M，优选小于0. 2 μ M、小于 0. 15 μ Μ，且更优选小于0. 1 μ Μ。
[0055] 在具体的实施方案中，本发明涉及多肽，其为至多350个氨基酸残基长，包含（1) 信号肽、（2)用于将所述多肽锚定在网状膜和/或高尔基体膜中的结构域（也称为锚定结 构域），和（3)当所述多肽被锚定在膜中时暴露于胞质中的结构域（也称为胞质域）。这些 结构域在结构上以这样的方式组织，所述信号肽Ν端朝向锚定结构域，所述锚定结构域自 身的Ν端朝向胞质域。根据该实施方案，本发明多肽从Ν端至C端包含（1)信号肽、（2)锚 定结构域和（3)胞质域。
[0056] 本发明多肽的胞质域末端为MAST-2结合域，所述结合域为11-13个氨基酸残基 长。通过"末端为"，其指MAST-2结合域的11-13个连续残基为胞质域的最末C端残基，且 在具体的实施方案中，为本发明多肽的最末C端残基。
[0057] 本发明多肽的MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为11-13个残基，头2个 残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L (这4个最末氨基酸残基表示所谓的H)Z-BS)。 根据以下组中的一个定义MAST-2结合域，应当了解，不管是哪一个组，MAST-2结合域的头 两个氨基酸残基均为S和W，且MAST-2结合域的最后4个氨基酸残基为Q、T、R和L。
[0058] (A)在第一组中，MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为11个残基，头2个残 基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由SWXAXJAQTRL组成，其中XpX 2、X3、X4和 乂5中的每一个为任意氨基酸残基（SEQ ID N0:19)。
[0059] 在具体的实施方案中，Xi为E或A，更优选E，以便MAST-2结合域由这样的序列 组成，其大小为11个残基，头2个残基为S、W和E，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由 SWEX2X3X4X5QTRL(SEQ ID N0:20)或 SWAX2X3X4X5QTRL(SEQ ID N0:21)组成，其中 X2、X3、X4 和 X5中的每个为任意氨基酸残基。
[0060] 在另一个实施方案中，X2为S、E或V，更优选V，以便MAST-2结合域由这样的序 列组成，其大小为11个残基，头2个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由 SWXJX3X4X5QTRL(SEQ ID N0:22), SffX1EX3X4X5QTRL(SEQ ID NO:23) ^ SWX1SX3X4X5QTRL(SEQ ID N0:24)组成，其中乂1、\、\和&中的每个为任意氨基酸残基。
[0061] 在具体的实施方案中，X3为H、A或Y，以便MAST-2结合域由这样的序列组成，其大 小为11个残基，头2个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由SWXAHXJATRL (SEQ ID NOJShSWXAAXAQTRUSEQ ID N0:26)或 SWXAYXJsQTRUSEQ ID N0:27)组成，其中 中的每个为任意氨基酸残基。
[0062] 在具体的实施方案中，X4为G或T，以便MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小 为11个残基，头两个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由SWXAXfXATRL (SEQ ID N0:28)或SWXAXJXATRUSEQ ID N0:29)组成，其中父1、乂2、乂3和乂5中的每个为任意氨 基酸残基。
[0063] 在具体的实施方案中，X5为G或Q，以便MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小 为11个残基，头2个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由SWXiX 2X3X4GQTRL(SEQ ID N0:30)或SWXAXAQQTRUSEQ ID N0:31)组成，其中乂1、\、&和乂4中的每个为任意氨 基酸残基。
[0064] 在具体的实施方案中，Xi为E且X2为S、E或V，更优选V，以便MAST-2结合域由这 样的序列组成，其大小为11哥残基，头3个残基为S、W和E，且最后4个残基为Q、T、R和L， 其由 SWEVX3X4X5QTRL(SEQ ID N0:32)、SWESX3X4X5QTRL(SEQ ID N0:33)*SWEEX3X4X5QTRL(SEQ ID NO:34)组成，其中\、\和&中的每个为任意氨基酸残基。
[0065] 在具体的实施方案中，Xi为E且X3为Η、A或Y，以便MAST-2结合域由这样的序 列组成，其大小为11个残基，头3个残基为S、W和E，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由 SWEX2HX4X5QTRL(SEQ ID N0:35)、SWEX2AX4X5QTRL(SEQ ID N0:36)或 SWEX2YX4X5QTRL(SEQ ID NO:37)组成，其中&、\和&中的每个为任意氨基酸残基。
[0066] 在具体的实施方案中，Xi为E且X4为G或T，以便MAST-2结合域由这样的序列 组成，其大小为11个残基，头3个残基为S、W和E，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由 SWEX2X3GX5QTRL(SEQ ID N0:38)或 SWEX2X3TX5QTRL(SEQ ID N0:39)组成，其中 X2、X3 和父5中 的每个为任意氨基酸残基。
[0067] 在具体的实施方案中，Xi为E且X5为G或Q，以便MAST-2结合域由这样的序列 组成，其大小为11个残基，头3个残基为S、W和E，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由 SWEX2X3X4GQTRL(SEQ ID N0:40)和 SWEX2X3X4QQTRL(SEQ ID N0:41)组成，其中 X2、X3 和父4中 的每个为任意氨基酸残基。
[0068] 在具体的实施方案中，XiSE，X2sv，且X3SH、A或Y，以便MAST-2结合域由这 样的序列组成，其大小为11个残基，头4个残基为S、W、E和V，且最后4个残基为Q、T、R和 L，其由 SWEVHX4X5QTRL(SEQ ID N0:42)、SWEVAX4X5QTRL(SEQ ID N0:43)*SWEVYX4X5QTRL(SEQ ID NO:44)组成，其中\和&中的每个为任意氨基酸残基。
[0069] 在具体的实施方案中，XiSE，X2SV，且X4SG或T，以便MAST-2结合域由这样 的序列组成，其大小为11个残基，头4个残基为S、W、E和V，且最后4个残基为Q、T、R和 L，其由 SWEVX3GX5QTRL(SEQ ID N0:45)或 SWEVX3TX5QTRL(SEQ ID N0:46)组成，其中父3和父5 中的每个为任意氨基酸残基。
[0070] 在具体的实施方案中，Xi为E，X2为V且X5为G或Q，以便MAST-2结合域由这样的 序列组成，其大小为11个残基，头4个残基为S、W、E和V，且最后4个残基为Q、T、R和L， 其由 SWEVX3X4GQTRL(SEQ ID N0:47)或 SWEVX3X4QQTRL(SEQ ID N0:48)组成，其中 XjPX4 中 的每个为任意氨基酸残基。
[0071] 在具体的实施方案中，XiSE，X2sv，X3SH、A或Y且X 4SG或T，以便MAST-2 结合域由这样的序列组成，其大小为11个残基，头4个残基为S、W、E和V，且最后4个 残基为 Q、T、R 和 L，其由 SWEVHGX5QTRL(SEQ ID N0:49)、SWEVHTX5QTRL(SEQ ID N0:50)、 SWEVAGX5QTRL (SEQ ID NO: 51), SWEVATX5QTRL (SEQ ID NO: 52), SWEVYGX5QTRL (SEQ ID N0:53)或SWEVYTX5QTRL(SEQ ID N0:54)组成，其中X5为任意氨基酸残基。
[0072] 在具体的实施方案中，Xi为E，X2为V，X3为Η、A或Y，且X 5为G或Q，以便MAST-2 结合域由这样的序列组成，其大小为11个残基，头4个残基为S、W、E和V，且最后4个 残基为 Q、T、R 和 L，其由 SWEVHX4GQTRL(SEQ ID N0:55)、SWEVHX4QQTRL(SEQ ID N0:56)、 SWEVAX4GQTRL (SEQ ID NO: 57), SWEVAX4QQTRL (SEQ ID NO: 58), SWEVYX4GQTRL (SEQ ID N0:59)或SWEVYX4QQTRL(SEQ ID N0:60)组成，其中X4为任意氨基酸残基。
[0073] 在具体的实施方案中，MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为11个残基，头 2个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由SWX&XAXATRL组成，其中Xi为E 或A，X2SS、E 或 V，X3SH、A或 Y，X4SG 或T 且X5SG 或Q(SEQ ID N0:61)。在该实施 方案中，MAST-2 结合域由 S-W-E/A-S/E/V-H/A/Y-G/T-G/Q-Q-T-R-L 组成。
[0074] 在具体的实施方案中，MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为11个残基，头2 个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由SWXAXJAQTRL组成，其中Xi为E，X 2 为S、E或V，X3SH、A或Y，X4SG或T且\为6或Q(SEQ ID N0:62)。在该实施方案中， MAST-2 结合域由 S-W-E-S/E/V-H/A/Y-G/T-G/Q-Q-T-R-L 组成。
[0075] 在具体的实施方案中，MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为11个残基，头2 个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由SWXAXJAQTRL组成，其中Xi为E，X 2 为 V，X3SH、A 或 Y，X4SG或 T 且X5SG 或Q(SEQ ID N0:63)。在该实施方案中，MAST-2 结合域由S-W-E-V-H/A/Y-G/T-G/Q-Q-T-R-L组成。在更具体的实施方案中，MAST-2结合域 由这样的序列组成，其大小为11个残基，头4个残基为S、W、E和V，且最后4个残基为Q、T、 R 和 L，其由 SWEVHGGQTRL(SEQ ID N0:64)、SWEVHGQQTRL(SEQ ID N0:65)、SWEVHTGQTRL(SEQ ID NO:66)、SWEVHTQQTRL(SEQ ID NO:67)、SWEVAGGQTRL(SEQ ID NO:68)、SWEVAGQQTRL(SEQ ID N0:69) ,SWEVATGQTRL(SEQ ID NO:70),SWEVATQQTRL(SEQ ID NO:71),SWEVYGGQTRL(SEQ ID N0:72)、SWEVYGQQTRL(SEQ ID N0:73)、SWEVYTGQTRL(SEQ ID N0:74)*SWEVYTQQTRL(SEQ ID NO :75)组成。
[0076] 满足该组中描述的定义中的一个的多肽是优选地，尤其是当由该组的多肽与人 MAST2蛋白PDA结构域形成的复合物的解离常数小于0. 3 μ Μ时，优选小于0. 25 μ M，优选 小于0. 2 μ M，优选小于0. 15 μ M，更优选小于0. 1 μ M，所述解离常数通过以上定义的方法测 得。在更优选的实施方案中，满足该组中描述的定义中的一个的多肽具有由本发明多肽与 人MAST2蛋白PDA结构域形成的复合物的解离常数，其小于0. 09 μ M、小于0. 08 μ M、小于 0. 07 μ Μ、小于0. 06 μ Μ或小于0. 05 μ Μ，所述解离常数通过以上定义的方法测得。
[0077] (Β)在第二组中，MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为11个残基，头2 个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L，所述结构域选自：SWX^SGGQTRL (SEQ ID N0:76), SWX1SSGGQTRL(SEQ ID NO:77), SWXiSHGGQTRL(SEQ ID NO:78), SWXiSHKGQTRL(SEQ ID NO:79) , SWXiSHKSQTRL(SEQ ID NO :80) , SWXiHSGGQTRL(SEQ ID N0:86), SWXiHKGGQTRL (SEQ ID NO: 87), SWXiHKSGQTRL (SEQ ID NO: 88), SWXiSKGGQTRL (SEQ ID N0:89), SWX1SKSGQTRL(SEQ ID NO:90), SWXiSHSGQTRL(SEQ ID NO:91), SWXiSHKGQTRL(SEQ ID N0:92)和SWXjKGGQTRUSEQ ID N0:93)，其中X1为任意氨基酸，优选E或A，更优选E。 因此，在具体的实施方案中，MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为11个残基，头3 个残基为S、W和E，且最后4个残基为Q、T、R和L，所述结构域选自：SWEKSGGQTRL (SEQ ID N0:81),SWESSGGQTRL(SEQ ID NO:82),SWESHGGQTRL(SEQ ID NO:83),SWESHKGQTRL(SEQ ID NO:84)、SWESHKSQTRL(SEQ ID NO:85)、SWEHSGGQTRL(SEQ ID NO:94)、SWEHKGGQTRL(SEQ ID NO:95)、SWEHKSGQTRL(SEQ ID NO:96)、SWESKGGQTRL(SEQ ID NO:97)、SWESKSGQTRL(SEQ ID N0:98)、SWESHSGQTRL(SEQ ID N0:99)、SWESHKGQTRL(SEQ ID N0:100)和 SWESKGGQTRL(SEQ ID N0:101)。在具体的实施方案中，胞质域的MAST-2结合域为SWESHGGQTRL(SEQ ID N0:83)。
[0078] 该第二组的MAST-2结合域可通过从SWESHKSGGQTRL序列（SEQ ID N0:1)缺失两 个连续或不连续的氨基酸残基获得。
[0079] (C)在第三组中，MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为12个残基，头2个残 基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L，其由SWXAXAXAQTRL组成，其中XpX 2、X3、X4、 父5和&中的每个为任意氨基酸残基（SEQ ID NO: 112)。
[0080] 在具体的实施方案中，Xi为E、A、V或S，以便MAST-2结合域由这样的序 列组成，其大小为12个残基，头2个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L， 其由 SWEX2X3X4X5X6QTRL(SEQ ID NO: 113)、SWAX2X3X4X5X6QTRL(SEQ ID NO: 114)、 SWVX2X3X4X5X6QTRL(SEQ ID N0:115)或 SWSX2X3X4X5X6QTRL(SEQ ID N0:116)组成，其中 X2、X3、 X4、X5和X6中的每个为任意氨基酸残基。
[0081] 在具体的实施方案中，X2为S、V、Η、A或Y，以便MAST-2结合域由这样的 序列组成，其大小为12个残基，头2个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和 L，其由 SWXjXAXAQTRUSEQ ID NOzinhSWXJXAXAQTRUSEQ ID N0:118)、 SWX1HX3X4X5X6QTRL (SEQ ID NO : 119) , SWX1AX3X4X5X6QTRL (SEQ ID NO: 120)或 SWXJXAXAQTRUSEQ ID N0:121)组成，其中Χ"Χ3、Χ4、Χ5^ΡΧ6中的每个为任意氨基酸。
[0082] 在具体的实施方案中，Χ3为H、A、Υ、Κ或Q，以便MAST-2结合域由这样的 序列组成，其大小为12个残基，头2个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和 L，其由 SWXAHXJsXeQTRUSEQ ID NOzWShSWXAAXJsXeQTRUSEQ ID Ν0:123)、 SWXiXJX^gXeQTRL (SEQ ID NO: 124) , SWX1X2KX4X5X6QTRL (SEQ ID NO: 125)或 SWXAQXJAQTRUSEQ ID N0:126)组成，其中Χ"Χ2、Χ4、Χ5^ΡΧ6中的每个为任意氨基酸。
[0083] 在具体的实施方案中，X4为K、A、Q、S或H，以便MAST-2结合域由这样的 序列组成，其大小为12个残基，头2个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和 L，其由 SWXAXJXsXeQTRUSEQ ID NOzWThSWXAXsAXsXeQTRUSEQ ID N0:128)、 SWX1X2X3QX5X6QTRL (SEQ ID NO: 129) , SWX1X2X3SX5X6QTRL (SEQ ID NO: 130)或 SWXJAHXAQTRUSEQ ID N0:131)组成，其中Χ"Χ2、Χ3、Χ5^ΡΧ6中的每个为任意氨基酸。
[0084] 在具体的实施方案中，Χ5为S、H、G或Τ，以便MAST-2结合域由这样的序 列组成，其大小为12个残基，头2个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L， 其由 SWXJJJJXeQTRUSEQ ID NO: 132) , SWX1X2X3X4HX6QTRL (SEQ ID NO: 133)、 SWXAXAGXeQTRUSEQ ID N0:134)或 SWXAXATXeQTRUSEQ ID N0:135)组成，其中 X"X2、 X3、X4和X6中的每个为任意氨基酸。
[0085] 在具体的实施方案中，X6为G、T或Q，以便MAST-2结合域由这样的序列 组成，其大小为12个残基，头2个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L， 其由 SWXiXJJJsGQTRUSEQ ID N0:136)、SWXiXJsXJJQTRUSEQ ID N0:137)或 SWXAXJAQQTRUSEQ ID N0:138)组成，其中X"X2、X3、X4^PX5中的每个为任意氨基酸。
[0086] 在具体的实施方案中，关于如上定义的SEQ ID NO: 112和SEQ ID NO: 122至SEQ ID NO: 138的多肽，Xi为E，并且/或者X2为V，如表1 (下一页）中所揭示。
[0087] 在具体的实施方案中，MAST-2结合域由12个残基组成，其头2个残基为S和W，且 其最后4个残基为Q、T、R和L，其由序列SWXAXAXAQTRL组成，其中Xi为E、A、V或S，X2 为 S、V、Η、A 或 Y，X3 为 H、A、Y、K 或 Q，X4 为 K、A、Q、S 或 H，X5 为 S、H、G 或 T，且 X6 为 G、T 或 Q(SEQ ID N0:191)。在该实施方案中，MAST-2 结合域由序列 S-W-E/A/V/S-S/V/H/A/Y-H/A/ Y/K/Q-K/A/Q/S/H-S/H/G/T-G/T/Q-QTRL 组成。
[0088] (D)在第四组中，MAST-2结合域由这样的序列组成，其大小为12个残基，头2 个残基为S和W，且最后4个残基为Q、T、R和L，所述结构域选自：SWXfKSGGQTRUSEQ ID NO: 102) , SWX1SKSGGQTRL(SEQ ID NO: 103) , SWXiSHSGGQTRL (SEQ ID N0:104), SWXfHKGGQTRUSEQ ID N0:105)和 SWXfHKSGQTRUSEQ ID 勵：106)，其中乂1为任意氨基 酸，优选E或A，更优选E。因此，在具体的实施方案中，MAST-2结合域由这样的序列组成， 其大小为12个残基，头3个残基为S、W和E，且最后4个残基为Q、T、R和L，所述结构域选 自：SWEHKSGGQTRL(SEQ ID N0:107)、SWESKSGGQTRL(SEQ ID N0:108)、SWESHSGGQTRL(SEQ ID N0:109)、SWESHKGGQTRL(SEQ ID N0:110)和 SWESHKSGQTRL(SEQ ID N0:111)。
[0089] 该第四组的MAST-2结合域可通过从SWESHKSGGQTRL序列（SEQ ID NO: 1)缺失1 个氨基酸残基获得。
[0090] 表 1
[0091]
[0092]
【权利要求】
1. 多肽，其为至多350个氨基酸长，包含胞质域或由胞质域组成，其中所述胞质域以 MAST-2结合域结束，其中所述MAST-2结合域的大小为11-13个氨基酸残基，所述MAST-2结 合域的头两个残基为S和W，并且所述MAST-2结合域的最后4个残基为Q、T、R和L，所述 MAST-2结合域选自： ㈧序列，其大小为11个残基，由SWXiX2X3X4X5QTRL组成，其中Xi、X 2、X3、X4和X5中的 每一个均为任意氨基酸残基（SEQIDNO:19)，其中X1为任意氨基酸，优选为E或A(SEQID N0:20和21)，更优选为E，并且/或者X 2SS、E或V，更优选为V(SEQ ID NO:22-24); (B) 序列，其大小为 11 个残基，选自 AWX^SGGQTRUSEQ ID NOiehSWXfSGGQTRUSEQ ID N0:77) , SWX1SHGGQTRL(SEQ ID NO:78) , SWXiSHKGQTRL(SEQ ID N0:79), SWX1SHKSQTRL(SEQ ID NO: 80), SWXiHSGGQTRL (SEQ ID NO: 86), SWXiHKGGQTRL (SEQ ID N0:87), SWX1HKSGQTRL(SEQ ID NO:88), SWXiSKGGQTRL(SEQ ID NO:89), SWXiSKSGQTRL(SEQ ID NOJOhSWXiSHSGQTRUSEQ ID NOAD'SWXiSHKGQTRUSEQ ID N0:92)和 SWXfKGGQTRUSEQ ID N0:93)，其中Xi为任意氨基酸，优选为E或A，更优选为E(SEQ ID N0:81-85 及 94-101); (C) 序列，其大小为12个残基，由SWX^XAXAQTRL组成，其中Xi、X2、X3、X 4、X5和X6中 的每一个均为任意氨基酸残基（SEQ ID NO: 112)，其中Xi优选为E或A，更优选为E，并且/ 或者X2为S、E或V，更优选为V ;和 (D) 序列，其大小为12个残基，选自JWXfKSGGQTRUSEQ ID N0:102)、 SWXiSKSGGQTRL(SEQ ID NO:103), SWXiSHSGGQTRL(SEQ ID NO:104), SWXiSHKGGQTRL(SEQ ID N0:105)和SWXjHKSGQTRUSEQ ID N0:106)，其中Xi为任意氨基酸，优选为E或A，更优选 为 E(SEQ ID N0:107-lll); (E) 序列，其大小为13个残基，由SWXAXAXJAQTRL组成，其中 中的每一个均为任意氨基酸残基（SEQ ID N0:192)，其中所述序列不由SWESHKSGGQTRL(SEQ ID NO: 1)组成， 其中所述多肽展现的对人MAST2蛋白PDZ结构域的结合亲和力高于包含WESHKSGGQTRL 序列的狂犬病毒G蛋白对所述MAST2蛋白PDZ结构域的结合亲和力。
2. 如权利要求1所述的多肽，其中所述MAST-2结合域由11个残基的序列 SWXAXJAQTRL组成，其中Xi为E或A，并且/或者X2为S、E或V，并且/或者X3为H、A或 Y，并且/或者X4为G或T，并且/或者X5为G或Q，且优选具有SEQIDN0:61中定义的序 列 S-W-E/A-S/E/V-H/A/Y-G/T-G/Q-Q-T-R-L。
3. 如权利要求1或2所述的多肽，其中所述MAST-2结合域由SEQ ID NO:63中定义的 11 个残基的序列 S-W-E-V-H/A/Y-G/T-G/Q-Q-T-R-L 组成，且优选选自 SWEVHGGQTRL (SEQ ID NO:64)、SWEVHGQQTRL(SEQ ID NO:65)、SWEVHTGQTRL(SEQ ID NO:66)、SWEVHTQQTRL(SEQ ID NO:67)、SWEVAGGQTRL(SEQ ID NO:68)、SWEVAGQQTRL(SEQ ID NO:69)、SWEVATGQTRL(SEQ ID N0:70) ,SWEVATQQTRL(SEQ ID NO:71),SWEVYGGQTRL(SEQ ID NO:72),SWEVYGQQTRL(SEQ ID N0:73)、SWEVYTGQTRL(SEQ ID N0:74)或 SWEVYTQQTRL(SEQ ID N0:75)。
4. 如权利要求1所述的多肽，其中所述MAST-2结合域由12个残基的序列 SWXAXAXAQTRL 组成，其中如 SEQ ID N0:191 中所定义，XiSEa'V 或 S，X2SS、V、H、A 或 Y，X3 为 H、A、Y、K 或 Q，X4 为 K、A、Q、S 或 H，X5 为 S、H、G 或 T，且 X6 为 G、T 或 Q。
5. 如权利要求1所述的多肽，其中所述MAST-2结合域由13个残基的序列 SWXAXAXJAQTRL组成，其中X!为E或A，并且/或者X2为S、V或E，并且/或者X3为H、 A或Y,并且/或者X4为K、A或Q,并且/或者X5为S或H,并且/或者X6为G或T,并且/ 或者 X7 为 G 或 Q，优选具有 SEQ ID N0:206 中定义的序列 S-W-E/A-S/V/E-H/A/Y-K/A/Q-S/ H-G/T-G/Q-QTRL，并且更优选由SWAEAQHTQQTRL(SEQIDN0:208)或SWEVHASGGQTRL(SEQID NO:209)组成。
6. 如权利要求1-5中任一项所述的多肽，其中所述MAST-2结合域上游的胞质域的序列 为： -多肽，其含有20-40个氨基酸残基，优选含有31个残基；或 -狂犬病毒G蛋白的胞质域片段，其由SEQ ID N0:2中定义的序列组成，或与SEQ ID N0:2 具有至少 80% 同一性的变体如 RRVNRSEPTQLNLRGTGREVSVTPQSGKIIS(SEQ ID N0:5)。
7. 如权利要求1-6中任一项所述的多肽，还包含信号肽和用于将所述多肽锚定在网状 膜和/或高尔基体膜中的结构域（即，锚定结构域），其中所述多肽从N端至C端包含（1) 所述信号肽、（2)所述锚定结构域和（3)所述胞质域，或由其组成。
8. 如权利要求7所述的多肽，其中所述锚定结构域为： -肽，大小为18-26个残基，其将所述多肽锚定在细胞内质网膜和/或高尔基体膜中，优 选为跨膜结构域；或 -狂犬病毒G蛋白的跨膜结构域，其由SEQ ID N0:4中定义的序列组成，或与所述SEQ ID N0:4具有至少81%同一性的、保留了将所述多肽锚定在细胞内质网膜和/或高尔基体 膜中的能力的变体。
9. 如权利要求7或8所述的多肽，其所包含的信号肽为： -肽，大小为3-60个残基，其将所述多肽靶向内质网中，并且任选地通过分泌途径进 行；或 -狂犬病毒G蛋白的信号肽，其由SEQ ID N0:3所定义的序列组成，或与所述SEQ ID N0:3具有至少68%同一性的、保留了将所述多肽靶向内质网中的能力并且任选通过分泌 途径进行的变体。
10. 如权利要求7-9中任一项所述的多肽，其在所述信号肽与所述锚定结构域之间包 含接头，所述接头由1-4个氨基酸残基组成，优选由狂犬病毒G蛋白胞外结构域C末端的 1-4个氨基酸残基组成，优选由狂犬病毒G蛋白胞外结构域的最后两个C端残基组成。
11. 如权利要求1-10中任一项所述的多肽，其从N端至C端包含以下或由以下组成： (1) 如SEQ ID NO: 3中定义的信号肽，或与所述SEQ ID NO: 3具有至少68%同一性的、 保留了将所述多肽靶向内质网中的能力并且任选通过分泌途径进行的变体； (2) 任选地，狂犬病毒G蛋白胞外结构域的最后两个C端残基； (3) 如SEQ ID NO: 4中定义的锚定结构域，或与所述SEQ ID NO: 4具有至少81 %同一 性的、保留了将所述多肤铺定在细胞内质网I吴和/或商尔基体I吴中的能力的变体；和 (4) 胞质域，包含以下或由以下组成：（a)如SEQ ID NO: 2中定义的肽或与SEQ ID NO: 2 具有至少80%同一性的变体，和（b)如SEQ ID NO: 19至SEQ ID NO: 209中定义的MAST-2 结合域，优选选自 SEQ ID NO: 19 至 SEQ ID NO: 101、SEQ ID NO: 102 至 SEQ ID NO: 191，及 SEQ ID NO:192 至 SEQ ID NO: 209,更优选如 SEQ ID NO: 64-68、71、74和 208-209 中所定义。
12. 如权利要求1-10中任一项所述的多肽，其中通过等温滴定量热法（ITC)测得的所 述多肽与人MAST2蛋白PDZ结构域间形成的复合物的解离常数（K D)小于0. 5 μ M，优选小于 0. 2μΜ，更优选小于0. ΙμΜ。
13. 如权利要求1-12中任一项所述的多肽，其序列选自SEQ ID Ν0:210至SEQ ID NO:218。
14. 编码权利要求1-13中任一项定义的多肽的多核苷酸，其序列为至多1050个核苷酸 长。
15. 如权利要求14所述的多核苷酸，其选自SEQ ID NO:219至SEQ ID NO:227。
16. 包含权利要求14或15中定义的多核苷酸的载体。
17. 如权利要求16所述的载体，其为表达载体，其中所述多核苷酸处于一个或多个转 录调控元件的控制下，诸如启动子，例如CMV启动子。
18. 来源于慢病毒的表达载体，特别是质粒，其包含权利要求14或15中定义的多核苷 酸、所述多核苷酸的表达控制元件、慢病毒来源的顺式作用中心起始区（cPPT)和慢病毒来 源的顺式作用终止区（CTS)，以及逆转录病毒来源的用于逆转录、表达和包装的调控信号。
19. 慢病毒载体假型粒子，其包含GAG结构蛋白和病毒核心，所述核心由（a)POL蛋白和 (b)慢病毒载体基因组组成，所述粒子包含权利要求14或15中定义的多核苷酸、所述多核 苷酸的表达控制元件、慢病毒来源的顺式作用中心起始区（cPPT)和慢病毒来源的顺式作 用终止区（CTS)，以及逆转录病毒来源的用于逆转录、表达和包装的调控信号，其中所述粒 子为用VSV病毒的G蛋白或狂犬病毒的G蛋白假型化的粒子。
20. 如权利要求19所述的慢病毒粒子，其中所述POL蛋白的整合酶蛋白为缺陷型的。
21. 细胞或细胞培养物，其以权利要求15-17中任一项定义的载体转染，或通过权利要 求19或20中定义的慢病毒粒子转导。
22. 组合物，其包含权利要求1-13中任一项定义的多肽、权利要求14或15中定义的多 核苷酸、权利要求16-18中任一项定义的载体、权利要求19或20中定义的慢病毒粒子，或 权利要求21中定义的细胞，以及任选地药学可接受的媒介物、赋形剂或载体。
23. 权利要求1至13中任一项定义的多肽、权利要求14或15中定义的多核苷酸、权 利要求16-18中任一项定义的载体、权利要求19或20中定义的慢病毒粒子，或权利要求21 中定义的细胞或细胞培养物，或权利要求22中定义的组合物，其用作药物。
24. 权利要求1至13中任一项定义的多肽、权利要求14或15中定义的多核苷酸、权利 要求16-18中任一项定义的载体、权利要求19或20中定义的慢病毒粒子，或权利要求21中 定义的细胞或细胞培养物，或权利要求22中定义的组合物，其用于治疗和/或减轻和/或 预防改变中枢神经系统（CNS)和/或周围神经系统（PNS)的疾病、病患或病症。
25. 用于确定细胞中分子，尤其是权利要求1-13中任一项定义的多肽的神经生存和/ 或神经保护活性的方法，包括： (a) 加入待分析的分子，使其与细胞或细胞培养物接触； (b) 测量步骤a)的细胞或细胞培养物中的一组基因的表达，所述基因由5个细胞基因 以及任选地至少一个其他的基因组成，或包含5个细胞基因以及任选地至少一个其他的基 因，所述5个细胞基因为R0B01、P0U4F1、PTN、PARD6B和PAFAH1B1，所述至少一个其他的基 因选自以下12个细胞基因屮11(3〇6、81^2、01?1、？六父5、510(^6、01?2、冊六〇7、冊￥2、1順8八、 SHH、BTK 和 FOS ;和 (c)基于未与所述分子接触的相同细胞类型的细胞或细胞培养物中测量的相同基因的 表达，将步骤b)中测量的每个基因的表达标准化， 其中所述组基因表达的统计学显著的调节揭示所述分子具有神经生存和/或神经保 护活性。
26.试剂盒，其适于执行权利要求25中定义的方法，包含 a. 对一组基因具有特异性的多对引物，所述基因由5个细胞基因以及任选地至少一个 其他的基因组成，或包含5个细胞基因以及任选地至少一个其他的基因，所述5个细胞基因 为R0B01、P0U4F1、PTN、PARD6B和PAFAH1B1，所述至少一个其他的基因选自以下的12个细 胞基因：PIK3CG、BMP2、DRD1、PAX5、S100A6、DRD2、HDAC7、HEY2、INHBA、SHH、BTK 和 F0S ;和 b. 任选地通过所述引物扩增这些基因的核苷酸靶标所需的试剂，以及任选地用于检测 扩增产物的试剂。
【文档编号】C07K14/435GK104114573SQ201280065616
【公开日】2014年10月22日 申请日期:2012年11月7日 优先权日:2011年11月8日
【发明者】克里斯托夫·佩奥德, 莫尼克·拉冯, 尼古拉斯·沃夫, 扎克·克翰, 伊鲁安·特里恩, 桑德林·维特利 申请人:巴斯德研究所, 国家科研中心, 皮埃尔与玛丽·居里大学(巴黎第六大学)