专利名称：大突变分析(bma)的制作方法
技术领域：
从突变表型中克隆基因已成为遗传学和生物技术中的长期艰巨任务。特别是在 (作物)植物领域中，快速而经济的正向基因克隆方法是急需的。实际上目前正探寻提高正向基因分离速度降低其成本，特别是扩展可以进行基因克隆的物种范围的方法。
背景技术：
正向基因克隆的目的是鉴别仅从表型获知，而没有分子信息或序列信息的那些基因。正向遗传学的起点可以是天然存在的表型变体或人工诱导的突变体。本质上，已经认识了两组正向基因克隆的方法绘图策略和标签策略。它们是互补的，各自都存在固有局限。在绘图策略中，通过标记辅助减数分裂重组绘图将表型准确定点在染色体的最小片段上。基于绘图的克隆是非常繁杂的程序，特别可用在小组的模型物种上。理论上，基于绘图的克隆对于通过有性繁殖而复制的任何生物体都是普遍适用程序(Peters 等人 Q003) Trends in Plant Science Vol. 8No. IOpp 484-491)。然而在实践中，存在基本的生物学限制。最重要的是，这关键取决于在感兴趣基因区域内减数分裂重组的良好频率。其次，这在表征很少的大基因组例如在植物如莴苣，胡椒，洋葱，和许多其他基因组中变得越来越困难，因为在其中重复DNA阻碍了 DNA标记的非模糊绘图。在标签策略中，表征成熟的生物突变体(转座子或T-DNA插入片段)被用作有效突变体并作为克隆标签基因的工具。将可转座元件插入基因中会导致功能的丧失或获得， 表达模式的变化，或对基因功能没有任何影响，这取决于插入片段是否位于基因的编码或非编码区。负责任何新产生的表型的基因是通过沿着基因组DNA的侧翼片段克隆插入序列而找回的。在理论上，通过这种可转座元件帮助加标签是克隆基因的优选方法，因为这很快速，并独立于减数分裂重组，而且不要求事先的基因组资源例如基因绘图或大量的序列信息(参见 Maes 等人 Trends Plant Sci. 1999 三月；4 (3) :90-96.)。该标签方法在少数模型生物体中已经成功，在这些生物体中天然基因标签(转座子)体系是已知的，或大量个体可被随机整合DNA(T-DNA)而转化(参见例如Settles等人，BMC Genomics 2007,8 :116, using maize)。除了这小组的物种之外，标签不能或很难应用，原因是由于缺乏已知的插入元件，或者由于种群大小的逻辑限制。逻辑上，为了寻找出一个或几个特异突变体，标签要求几千个个体的种群，因为每个基因组中插入序列数量很低(1-200)。
发明内容
本发明的一个目标在于提供一种新方法，及其用途，其可以实现有效鉴别参与特定表型显现的核酸。该方法可以应用于任何可人工杂交和操作的(植物)物种，而无需该物种的大量序列知识。本发明的其他目标明显地体现在本发明的说明书，实施方式和权利要求中。定义在以下说明和实施例中使用几个术语。为了在说明书和权利要求中提供明确且一致的理解，包括这些术语给出的范围，提供以下定义。除非本文另有定义，所有使用的技术和科学术语具有发明所属领域普通技术人员所理解的普通含义。所有公开文献，专利申请， 专利和其他参考文献的整体内容都通过引用的方式并入本文。等位基因位于同源染色体相同位置上并负责可替换性状的至少两个可替换形式基因的其中一个。非限制性示例是花朵中的花簇颜色基因一单个基因可控制花瓣的颜色， 但是可能存在几个不同版本或基因的等位基因。一个版本可形成红色花瓣，而另一可形成白色花瓣。个体花朵的最终颜色取决于其拥有基因的哪两个等位基因及其这两者如何作用。特征与生物体的表型质量相关。特征可使自身显现成不同性状。例如，植物可以是以花朵颜色作为特征的植物，红色或白色花朵是该特征的性状A和B。在本发明内，特征 (或性状)可以是任意的，只要具有特征第一性状的生物体成员可以在表型上区别于具有特征第二性状的生物体成员。这不仅局限于那些可通过观测生物体直接观察到的区别，也包括那些通过进一步分析生物体而呈现出的特征/形状，例如基于对特定环境的抗性的分析，或基于对这些生物体中特定代谢产物的存在的分析。“基因表达”或“表达核酸”:与适当的调控区特别是启动子操作连接的DNA区被转录成具有生物活性的RNA的过程，即，该RNA能够被翻译成生物活性蛋白或肽或其自身就有活性。基因含有与适宜转录调控区(如启动子)操作连接的区域(转录区)的DNA序列，在细胞中该区域被转录成RNA分子(如mRNA)。因而基因可含有几个操作连接序列，例如启动子，含有例如参与翻译起始的序列的5’非翻译前导序列(也称为5’ UTR，其与翻译起始密码子上游的转录mRNA序列对应)，(蛋白)编码区(cDNA或基因组DNA)和含有如转录终止位点和聚腺苷酸化位点的3’非翻译序列(也称为3’非翻译区，或3’ UTR)。同基因基因相同。同基因种群内的个体细胞通常是具有相同基因组成的单一祖先的后代。本发明中，“同基因”被解释为在cDNA水平上，个体成员100%相同，除了由于自然变异所造成的，或在本发明优选实施方式中，由致突变处理所造成的任何点突变之外。致突变或致突变处理在本文该术语涉及导致在核酸，基因或基因组中引入变化的处理，例如导致引入点突变和/或插入或删除长达10个连续核苷酸。核酸本发明所述的核酸可包括嘧啶和嘌呤碱基分别优选胞嘧啶，胸腺嘧啶，和尿嘧啶，和腺嘌呤和鸟嘌呤的任何多聚体或低聚体(参见Albert L. Lehninger, Principles of Biochemistry，在793-800 (Worth Pub. 1982，该文献所有目的的全部内容被引入本文作为参考)。核酸可以是DNA，包括cDNA，或RNA，或其混合物，其可以是稳定或暂时存在的单链或双链形式，包括同质双螺旋，杂质双螺旋和杂交状态。测序该术语测序是指测定核酸样品如DNA或RNA中核苷酸(碱基序列)顺序。性状在生物学中，性状涉及生物体的个体成员与相同生物体的(任何)其他个体成员相比时任何表型上可区别的特征。在本发明的上下文，性状可以是遗传的，即通过生物体的遗传信息方式被传代至生物体的下一世代。
“相同特征的性状”或“所述特征的性状”一个特征所存在(或呈现)的一组至少两种性状的任一。例如，对于特征“花朵颜色”，在表型上的显现可包括蓝色，红色，白色等等。在以上示例中，蓝色，红色和白色都是相同特征的所有不同性状。发明详述令人惊奇的是，以上所述的目标可通过所附权利要求描述的方法解决。具体而言，提供了鉴别，和任选分离与生物体特征相关的表达核酸序列的方法，其特征在于该方法包括以下步骤a.提供具有所述特征的性状A的所述生物体的至少两个成员和具有所述特征的性状B的所述生物体的至少两个成员，其中性状A和性状B不同，其中具有性状A或B的所述成员都源自所述生物体的同基因成员；b.从步骤a)的具有性状A每个成员和步骤a)的具有性状B每个成员中获得总 cDNA ；c.测定从具有性状A成员和具有性状B成员所获得的每个个体cDNA序列；d.通过与具有性状B成员的相应cDNA对比，测定具有性状A的每个个体cDNA中单个核苷酸的多态性频率；e.通过对比具有性状A每个成员的cDNA和具有性状B每个成员的cDNA中单个核苷酸多态性频率，鉴别具有性状A并具有增加的单个核苷酸多态性频率的成员cDNA ；和f.鉴别步骤(e)的cDNA所源自的表达核酸序列，和任选地克隆含有表达核酸序列的基因。本发明是基于以下而实现的，目前正向克隆策略的上述问题可通过在概念上与用生物致突变标记类似的方法解决，但是仍通过使用可应用于任何生物体的非生物致突变克服其局限性，该致突变可以在每个基因组中产生几千个易于检测的突变体从而尽可能地消除了逻辑种群限制，结合对从显示所需表型的突变体池所获得整体转录物组(cDNA)测序， 并在此基础上鉴别在所述突变体池的每个成员中携带非中性单核苷酸多态性的基因。此外，可由自然变异获得突变体池。对于用插入致突变标记的基因，已经实现任何生物体的基因都可以用化学诱导突变如点突变加标签(并显现差别表型)。然而，主要问题在于如何在整体基因组中检测这些小而随机突变(标签)，因为这些突变不能进行任何形式的特定PCR扩增。而且，化学诱导突变以高频率随机出现在基因组中。因此，与原始物种的基因对比，许多基因可能同时含有突变，从而使得正确鉴别负责所观察到表型的基因复杂化。本发明人已经实现了在要克隆的位点创建一系列突变等位基因，并将它们纳入 “突变池”中然后对来自该池的所有cDNA进行多次再测序的方案。与来自非突变同胞池 (“野生型池”)的所有cDNA序列对比时，在突变池中的一个cDNA会显示出高度增加的突变频率。这很可能是形成突变表型基础的基因。根据本发明的方法，该池是由在其他同基因遗传背景中的(诱导的)等位基因系列构成的。本发明所述方法(大突变分析，BMA)检测了位于要克隆的基因内的连锁SNPs。该方法可应用于可以被人工杂交和致突变的所有物种，包括那些众所周知的复杂作物如胡椒和洋葱，该方法不依赖于基因图谱的存在，并可在任何大小和复杂程度的基因组中实施。
具体而言，根据本发明的方法，将至少两个具有特定表型(或具有特定性状A)的生物体个体成员与至少两个不具有所述表型(但具有对应相同特征的性状B)的所述生物体个体成员进行对比。技术人员会理解本发明方法不限于仅比较具有性状A的成员和具有性状B的成员，也可以包括具有相同特征的性状C，D，E……的成员。本发明要求具有性状A或性状B的生物体成员都来源于所述生物体的同基因成员，换而言之具有相同遗传背景的生物体(例如来源于相同的近交系)。具有性状A或性状 B的个体成员是同基因的，即具有相同的遗传背景，除了由于自然变异或在本发明的优选实施方式中由于致突变处理而被引入遗传物质的变化之外。所观察表型包含的具有性状A的成员和具有性状B的成员之间在遗传物质上具有这些差异。具有性状A的成员所表达的核酸中必然有至少一个不同于具有性状B的生物体成员所表达的核酸，且该核酸与生物体特征相关，而其中性状A和性状B是表型形式。为了检测这种加标签(通过例如点突变)核酸，在本发明方法中，对比了具有性状 A成员的总转录物组和具有性状B成员的总转录物组，即对比了在所选组织中所有表达基因的完整序列。总cDNA是从具有性状A的成员和具有性状B的成员中获取的。可以通过本领域技术已知的任何适宜方法从具有性状A的生物体成员或具有性状B的生物体成员的每一池中制备总cDNA。可购买许多商业可供的cDNA合成试剂盒，例如从ABgene，Ambion，Applied Biosystems, BioChain, Bio-Rad, Clontech, GE Healthcare, GeneChoice, Invitrogen, Novagen, Qiagen, Roche Applied Science, Stratagene 等。这类方法例如在 Sambrook 等人(Sambrook, J. , Fritsch, E. F. , and Maniatis, Τ. , in Molecular Cloning ALaboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, Vol. 1,2,3(1989))例如有描述。本发明的方法要求获得至少两个具有性状A成员和至少两个具有性状B成员的总 cDNA。更优选地，在本发明所述方法中提供了每个具有第一性状A的至少3，4，5，6或7个生物体成员。如上所述地，本发明是基于以下而实现的，与特定特征(或性状)相关的基因差异可通过对比因为具有表型区别性状而可以相互区别的生物体整体转录物组的序列而鉴别。 然而，因为在优选实施方式中，具有性状A的成员是通过对具有性状B的成员进行随机的 (化学)致突变处理而产生的，所以这种处理生物体的遗传物质会含有许多且随机的突变， 其中大部分并不会与所观察的性状相关。因而对比具有性状A的一个成员的总cDNA和具有性状B的一个成员的总cDNA并不能鉴别与所观察表型相关的核酸。但是本发明人实现了将至少两个具有第一性状A的成员与至少两个具有性状B的成员对比，现在可以鉴别负责(或与其相关)特征(或性状)的核酸具有性状A和性状B的成员都源自于相同的同基因来源。由于同基因来源的突变处理，变化被随机引入遗传物质中。在第一成员中诱导的变化会不同于在第二成员中诱导的变化。然而，在所述第一成员和所述第二成员的两种情况中，由于致突变处理，现在都表现出表型，即具有性状A，很可能是在两个成员中，与从具有性状B的成员所获取的相应 cDNA相比，相同cDNA会显示了单个核苷酸多态性(SNP)(这种SNP不一定必需位于这种 cDNA内的相同位置)。所述cDNA现在可鉴别为源自表达核酸的cDNA，而该表达核酸是与所研究生物体的特定性状或特征相关，因为在具有性状A的两个成员中，这种非相关cDNA会显示出这种SNP的变化接近零。换而言之，本发明是基于以下实现的，在所有来自“突变池”的cDNA序列中，如在一个基因(性状A)有5个等位基因突变，与具有性状B的成员cDNA相比，将只有一个个体 cDNA 一直显示出序列变化。为了对比具有性状A成员的总cDNA和具有性状B成员的总cDNA，总cDNA需要测序。cDNA的测序可通过技术人员已知的任何适宜方法完成。然而，尤其高度优选Margulies M.等人(http://www. 454. com, Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature 437 :376-80,2005]中描述的这些方法，来实现快速并有效地测序整体转录物组(所有cDNA)。例如，在优选实施方式中，所获得的cDNA片段的核苷酸序列可通过高通量测序方法测定，例如WO 03/004690, WO 03/054142, WO 2004/069849, W02004/070005, WO 2004/070007，和 WO 2005/003375，Seo 等人 Q004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101 :5488-93,and technologies of HeIicos,Solexa,US Genomics,etcetera中所公开的那些，它们都通过参考引入本文。在本发明所述方法的下一步中，将所获得的具有性状A成员的总cDNA序列与具有性状B成员的总cDNA对比，从而建立cDNA的单核苷酸多态性频率。可以通过技术人员已知的任何适宜方法完成这种测定，例如在所附实施例中展示的那些。简而言之，例如cDNA片段核苷酸序列的排列可用于收集源自相同转录基因的核苷酸序列，和对比这些核苷酸序列。核苷酸序列是否源自相同的转录基因，可以根据序列之间的同源性来建立。为了本发明的目的，假定他们在至少30、优选至少50、更优选至少90、 还更优选至少100、150、200核苷酸长度中至少百分之95、96、97、98、99、100是同源的，则核苷酸序列是源自相同的转录基因。统计解释可以辅助该方法来证实统计差异频率。根据所获得的数据，可以鉴别具有性状A并具有增加SNP频率的成员的总cDNA中的cDNA。在本发明所述的方法中，具有性状A成员的所有测序cDNA中，具有性状A的每个成员有至少一个特定cDNA会携带遗传上非中性单核苷酸多态性(SNP)。换而言之，具有性状A的每个成员中该特定cDNA会含有SNP (不一定处于相应cDNA的相同位置)。随后这个 cDNA可通过技术人员已知的方法用于鉴别所表达的核酸序列并克隆相应的基因。在优选实施方式中，提供本发明所述的方法，其中具有性状A的所述生物体成员是通过具有所述性状B的所述生物体成员致突变而获得的，其中具有性状B的所述成员在所述致突变处理之前是同基因的。在本发明所述方法的实施方式中，至少两个具有区别特征性状A的成员是自然变异的结果，即是由于核酸中的自然或自发变化是之前显现性状B的所述生物体。在遗传信息中的这些突变是非故意的，但揭示了生物体携带负责所观察的表型变化的遗传信息(例如，从性状B至性状A)。然而优选地，本发明所述方法不依赖于遗传信息中的这种非故意和不可控变异， 反而依赖于故意致突变引起的具有特定性状的突变。技术人员可以理解如何使任何生物体的遗传信息发生突变，例如通过采用已知的致突变剂。由于采用这些致突变剂，突变可随机发生在生物体成员的基因组中。换而言之，核酸例如基因可以用(化学地，生物地或通过辐射方式)诱导突变(如点突变，如通过乙基甲磺酸)加标签(与非突变核酸对比)。“辐射致突变”的示例包括X-射线，Y-射线，UV光，或电离离子。“生物致突变”示例包括例如W00150847所述的方法，例如使用重组酶如recA。可用于本发明所述方法的 “化学致突变”示例包括应用特定化学制剂如乙基甲磺酸(EMS)，硫酸二乙酯(DES)，N-亚硝基-N-乙脲(ENU)，双环氧丁烷，2-氨基嘌呤，5-溴尿嘧啶，溴化乙啶，亚硝酸，亚硝基胍，羟胺，叠氮化钠，或甲醛。优选地，致突变方法包括基因组的点突变，或插入，置换或删除高达10个连续核苷酸。技术人员可以理解在该实施方式上下文中，具有性状A的成员和具有性状B的成员是同基因的(因为它们源自相同的遗传背景)，除所述致突变处理引入的突变之外。与经典绘图和用插入突变的加标签策略相反，这种小而随机的突变难以检测因为它们无法通过任何形式的特定PCR扩展来定量。然而，使用以上策略存在以下优势致突变本质上可应用于任何感兴趣的物种，诱导突变的范围比加标签途径更宽，致突变通常更有效并且更易于获得第二位点突变。尽管可以采用多种适宜的致突变方法，优选地致突变剂不是选自转座子插入物或 T-DNA插入物的生物致突变剂。优选地，所用的致突变方法在遗传物质中引入点突变。在另一实施方式中，提供了本发明所述的方法，其中生物体是植物，优选选自下组的作物植物番爺，胡椒，茄子，莴苣，胡萝卜，洋葱，韭菜，菊苣，萝卜，欧芹，菠菜，甜瓜，黄瓜。可用于本发明的生物体可以是任何生物体，包括细菌，原核生物和真核生物。然而优选生物体是真核生物，特别是植物，更特别是作物植物。优选地，植物是属于以下重要作物植物的植物番茄，胡椒，茄子，莴苣，胡萝卜，但是本方法本质上可应用所有其他植物。特别地，本发明实现了鉴别和克隆核酸，例如作物植物的基因，这些作物植物不可能或很难采用现有技术中可用的绘图和加标签技术。在另一实施方式中，提供了本发明所述的方法，其中生物体是植物，其中在步骤a) 之前建立了编码性状A的等位基因和编码性状B的第二等位基因的杂合子Fl种群，其中所述Fl种群可用于致突变，且其中所述Fl种群在所述致突变之后分为具有性状A成员和具有性状B成员。优选地，等位基因系列可通过例如在已知位点选择新的等位基因的标准遗传方法构建。该方法是由建立一个突变参照等位基因(其产生之前已知的位点表型)和一个野生型等位基因的杂合子Fl种群。Fl的致突变将通过敲除野生型等位基因显露突变表型。这种突变Fl植物在其他野生型Fl种群中会以一定频率出现。通过在一个多杂合基因型中组合不同突变位点，在这种方式中一个Fl种群要处理的不同基因(位点)数量可以根据意愿增加。通过本发明所述方法鉴别的核酸之后可以被分离，克隆(基因)，或引入宿主细胞，或用于例如植物培育程序。综上所述，本发明涉及鉴别，和任选地分离在生物体中所表达的并与所述生物体的特定表型(特征的性状)相关的核酸序列的新策略。与本领域已知的方法相反，本发明的方法可以有效地鉴别，分离或克隆生物体例如(作物)植物的基因，这些植物没有或只有有限的基因组相关信息。此外，现在可以利用化学诱导点突变作为通用，广泛地可用于建立突变种群的方法，例如这比通过使用T-DNA或转座子体系生成高得多的突变频率，从而减少该方法所需要的生物体数量，例如植物。而且，该方法不依赖于使用基因组中的标记或其存在，因为它直接检测感兴趣的/特别的基因的变化。
图1是本发明所述方法的实施方式的示意图。概括并适用于本文公开的发明，其显示了用致突变剂处理的同基因种群。因此，呈现出特定区别特征的两个性状A(虚线圆圈)和B (实线圆圈)。因而两个性状A和B是源自相同的同基因种群，在该实施方式中的区别仅涉及致突变处理诱导的突变(技术人员可以理解所述处理可以在生物体的所有同基因成员中实施，优选地仅在所述生物体成员的片段上)。为了鉴别负责所观察的性状A或与其相关的表达核酸，集合至少两个具有性状A的成员，获取总cDNA，测序并与至少两个具有性状B的成员总cDNA对比(或与之前从具有性状B成员获取的总cDNA对比，例如在致突变处理之前从同基因成员得到的)。由于容纳了至少两个具有性状A的成员，将随机突变引入到突变池所有成员的相同cDNA，和这种cDNA不涉及所观察到表型的几率实际上是零。在下一阶段中，如果对比具有性状A和具有性状B成员的总cDNA，可以鉴别在具有性状 A突变池中所有成员携带的这种cDNA，因为核酸涉及所观察到的表型/性状A。概括而言， 这是通过显示性状A总cDNA和性状B总cDNA的两个个体cDNA :cDNAl和cDNA2的对比而表示的。如所证实的，性状A和性状B的cDNAl是相同的，除了性状A的一个成员之外。相反地，与性状B的cDNA2相比，性状A的所有cDNA2携带突变(星号所示)。因此cDNA2被鉴别为涉及性状A显现/与其相关的核酸，且该基因可以被克隆。
具体实施例方式实施例在单个花朵颜色基因中产生突变。在以下实施例中，证实了 BMA方法。该方法通过重新鉴别之前已知的杂交牵牛花的花朵颜色基因(RT)来证实。由自交系W5(rt: :dTph3 ；Stuurman和Kuhlemeier. 2005) 禾口 Ml(RT,Snowden KC 禾口 Napoli CA(1998)Psl :a novel Spm-Iike transposable element from Petunia hybrida. Plant J. 14 :43-54)之间杂交产生紫红色花的Fl杂交牵牛花，其形成了在基因RT上携带隐性等位基因的紫红色花的杂合子表型，其编码UDP鼠李糖花青素-3-糖苷鼠李糖基转移酶。在所用遗传背景中，无效突变的RT会产生红色花朵，这是花青素-3-糖苷积累的结果(Kroon等人，1994，Brugliera等人，1994)。用乙基甲磺酸(EMS) 致突变处理Fl杂交种子，一些获得的植物在野生型RT等位基因上会携带新的突变，这造成了杂合性的丧失并表达红色花冠颜色。EMS处理的种子生长出了约3600个Fl植物的种群，可以目测记录所有个体植物的花朵颜色。在生长的植物中，选择了五个红色花朵的突变体。因为红色是隐性的，在原代致突变种群中表达这种颜色表示了红色花朵突变体RT基因的野生型拷贝中携带了 EMS诱导点突变。高通量转录物组测序正确鉴别了 RT基因。为了在5个新鉴别的突变等位基因中重新鉴别构成红色的基因，将2阶段花冠檐的全部转录物组测序，这正是花青素色素变得可见的发育时间点。在相同时间，将来自非EMS处理种子(下文称为野生型)的至少两个植物的全部转录物组对比测序。5个突变体和野生型的每个总RNA可以转化成ds-cDNA，然后将每个个体突变植物的cDNA分别加工用于在GS-FLX钛测序机GM Life Sciences)上测序。加工可包括条码妨4序列接头，5个突变体和野生型每个携带区别条码(参见例如W02007073165，W02007037678或W02007073165， 其中区别条码描述为标签或识别符)。条码可以是5bp序列，被加在4M个接头的3’端，其沿着cDNA读码。这会在每个序列读码框的起始点生成独特的标签，每个确切的5bp序列表示其源自5个突变体或野生型的哪个。随后将所有样品集合起来，在GS-FLX钛测序机中进行三次测序。可以获得平均400bp长度的总共3百万个读码框。使用CAP3 组配软件(Huang，X.和 Madan, A. (1999) CAP3 :A DNA Sequence Assembly Program. Genome Research，9 :868-877)并使用 98 % 同一性设置重叠配对将所有序列数据可以组配在重叠群的非冗余组中。获得了大约20000个平均1. 5kb大小的重叠群，表示在这种深度的测序中花冠转录物组的unigenes最小数量。然后使用技术人员已知的技术分析数据组来分析突变体中发生的SNP，与野生型对比(Savage 等人 2005. SNPserver， al real timeSNP discovery tool Nucl. Acids Res(33)W493-W495)。用于BLAST分析时，这种unigene会显示出与来自杂交牵牛花的UDP 鼠李糖花青素-3-糖苷鼠李糖基转移酶一样。这与RT基因是相同的。BMA程序实现了在至少21000个其他基因的背景中鉴别引起突变表型的单个基因，只要实验条件允许等位基因系列的生成(在我们的情况中在相同基因有5个区别突变) 和足以检测整个组织cDNA池中SNP的测序能力。
权利要求
1.一种鉴别，和任选分离与生物体特征相关的表达核酸序列的方法，其特征在于该方法包括以下步骤a.提供具有所述特征的性状A的所述生物体的至少两个成员和具有所述特征的性状B 的所述生物体的至少两个成员，其中性状A和性状B不同，其中具有性状A或B的所述成员都源自所述生物体的同基因成员；b.从步骤a)的具有性状A每个成员和步骤a)的具有性状B每个成员中获得总cDNA;c.测定从具有性状A成员和具有性状B成员所获得的个体cDNA的每个序列；d.通过与具有性状B成员的相应cDNA对比，测定具有性状A的每个个体cDNA中单个核苷酸的多态性频率；e.通过对比具有性状A每个成员的cDNA和具有性状B每个成员的cDNA中单个核苷酸多态性频率，鉴别来自具有性状A并具有增加的单个核苷酸多态性频率的成员的cDNA ；和f.鉴别步骤(e)的cDNA所源自的表达核酸序列，和任选地克隆含有表达核酸序列的基因。
2.如权利要求1所述的方法，其中具有性状A的所述生物体成员是通过具有所述性状 B的所述生物体成员致突变而获得的，其中具有性状B的所述成员在所述致突变处理之前是同基因的。
3.如权利要求2所述的方法，其中致突变的方法诱导了点突变。
4.如权利要求2-3任一项所述的方法，其中通过使用非生物致突变剂实施致突变。如前述权利要求任一项所述的方法，其中生物体是植物，优选是选自下组的作物植物 番茄、胡椒、茄子、莴苣、胡萝卜、洋葱、韭菜、菊苣、萝卜、欧芹、菠菜、甜瓜、黄瓜。
5.如前述权利要求任一项所述的方法，其中生物体是植物，其中在步骤a)之前建立了编码性状A的等位基因和编码性状B的第二等位基因的杂合子Fl种群，其中所述Fl种群可用于致突变，且所述Fl种群在所述致突变之后分为具有性状A成员和具有性状B成员。
6.如前述权利要求任一项所述的方法，其中将步骤(f)的基因引入生物体中，和/或用于建立转基因生物体，和/或突变，和/或用在植物培育中。
全文摘要
本发明涉及鉴别，和任选分离在生物体中表达的并与所述生物体特定表型(特征的性状)相关的核酸序列的新策略。与本领域已知的方法相反，本发明的方法可以有效地鉴别，分离或克隆生物体例如(作物)植物的基因，这些植物没有或只有有限的基因组相关信息。
文档编号C12Q1/68GK102245784SQ200980150525
公开日2011年11月16日 申请日期2009年11月17日 优先权日2008年11月17日
发明者J·斯图尔曼 申请人:凯津公司