快速杂交装置及方法

专利名称：快速杂交装置及方法
技术领域：
本发明涉及一种分子生物科技中快速杂交反应技术，更具体言之，涉及加速核酸杂交反应的方法及装置。
杂交技术的运用之一，即是利用不同生物体之间组成基本物质-核酸序列不同的特性，用以鉴别物种。将待测的核酸固定在基质上(譬如固体基质或滤膜等)，欲鉴定物种的特定核酸序列先以放射性物质或其他化学呈色物质或萤光物质等标记后，溶于溶液中，利用扩散或震力等使该二种核酸互补键结，经由感光、化学成色或激光来判读结果。
核酸杂交技术目前已广泛地应用在核酸测序，基因突变分析，及细菌、病毒的临床检测等。此技术主要是将两群单股的核酸一起反应，在一定的环境下彼此互补而形成双股核酸。杂交可归类为两种形式溶液或液相杂交，如P.Wattre,55 Ann.Biol.Clin.25-31,1997所揭示；及固相杂交，请参考E.M.Southern,98 J.Mol,Biol.503-517,1975,F.C.Kafatos et al,7 Nucleic Acids Res.1541-1552,1979,D.Nanibhushan和D.Rabin,EP0228075,1987年7月8日，M.Grunstein和D.S.Hogness.72 Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,3961-3965,1975,A.R.Dunn和J.A.Hassell,12 Cell 23-36,1977，及Ranki等人的美国专利第4,563,419号。溶液或液相杂交的最大的缺点是原为双股的两群单股核酸(即探针核酸及靶核酸)均在溶液中，杂交过程中会个别与同组互补的序列杂交，降低两组核酸的杂交效率。而固相杂交是将其中一组核酸固定，可以克服此缺点。
固相杂交有许多种形式，最早源自于“Southern印迹杂交程序”，为E.M.Southem于98 J.Mol.Biol.503.517,1975所揭示。简言之，是将DNA转印至硝基纤维膜，此膜之后可供互补的DNA序列杂交。斑点杂交为F.C.Kafatos等人于7Nucleic AcidsRes.1541-1552,1979所发表，是将靶核酸点在膜上，以标记有放射性或其他呈色物质之探针核酸与之杂交，此技术已广泛使用在基因突变的分析，如D.Nanibhushan和D.Rabin于欧洲专利EP0228075所述，及其他分子生物学相关研究。
菌落杂交是M.Grunstein和D.S.Hogness.于72 Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.3961-3965,1975所揭示，将微生物(譬如细菌、噬菌体或其他微生物)固定在薄膜上，原位将其破碎，释出其核酸并使之变性之后固定，同样以标记有放射性或其他呈色物质的探针核酸与之杂交。
另有一种夹心式杂交法是A.R.Dunn和J.A.Hassell于12 Cell 23-36,1977以及Ranki等人的美国专利第4,563,419号，此方法使用两组探针核酸，第一组探针核酸固定在薄膜上，与靶核酸杂交，之后与第二组探针核酸杂交，最后再与抗体反应并呈色。此方法可以克服斑点杂交技术中人为将靶核酸点在薄膜上难以定量的缺点，但上述三种常用的杂交系统则有以下几项共通的缺点杂交程序是在液体环境进行，溶液中的核酸分子以扩散(布朗运动)的方式接近转印在薄膜上的核酸来达成杂交，是一种被动杂交，由于扩散速度缓慢，一般需做隔夜杂交，即需要十数小时以达到最佳的杂交效果，相当耗时。杂交耗时，易导致溶液中的核酸由单股的状态，与原本互补股的核酸单股结合，复性成双股，此情形发生在双股的DNA，或形成二级结构，此情形发生在RNA，造成杂交效率变差。
大部份核酸分子具高度复杂性，因此易发生不完全杂交或少数几个碱基不配对的情形，因此专一性较差。另一方面，由于核酸分子分散在溶液中，所以敏感度较差，一般少于100,000个靶核酸分子就检测不到，欲达到一定的敏感度，则需高浓度的核酸才能达成。再者，核酸对大部份材质具有高亲和性，令核酸在溶液中自由运动，自由选择结合的物质，在非最佳杂交条件下，容易与基质结合，结果造成严重的背景值。
习知方法利用提高反应温度，调整反应溶液的盐离子浓度及杂交后冲洗的条件，添加帮助分离双股的物质(如尿素、甲酰胺)等方式，以提高杂交专一性。然而最佳的杂交条件并不容易调整，而且专一性提高后往往降低反应敏感度。
目前已有文献发表，在杂交溶液中添加一些物质以加速杂交，例如M.Renz等人于12,Nucleic Acids Res.,3435-3444,1984所揭示的聚乙二醇，G.M.Wahl等人于76,Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.,3683-3687,1979所揭示的硫酸葡聚糖，以及，S.J.Boguslawskif和L.H.D.Anderson于美国专利第4,689,294号揭示的聚丙烯酸酯或聚甲基丙烯酸酯，然而上述其他的缺点仍无法克服。
近年来，原位杂交技术被广泛使用在检测单一细胞中的基因及染色体异常。而M.Barinaga,253 Science,1489,1991的DNA晶片(DNA chip)则是将核酸序列固定在微小的晶片上进行杂交，为将斑点杂交、菌落杂交及夹心式杂交缩小在极小范围中进行，具有浓缩局部核酸的效果，因此敏感度较上述三种杂交方法高，然而其他缺点仍是无法克服。
另有一种在固定有核酸的基质下施以点电场的杂交技术，请参考Heller等人的美国专利第5,605,662号、美国专利第5,849,486号、和第5,632,957号。此方法利用核酸带负电的特性，在特定的核酸基质的点电极施以正电，待杂交的核酸会迅速被吸引至正电极附近，具有浓缩核酸的效果，而利用电场带动核酸的移动可缩短杂交的时间，当待杂交核酸与互补核酸结合后，随即将点电场的电性改为负电，使未键结或错配的核酸离开电场，因此能除去非专一性的杂交。此点电极的杂交法能克服传统以扩散方式杂交的专一性及敏感度不高的缺点，然而点电场的设计使得待杂交核酸分布不平均，造成杂交机会的不均等，而有伪阳性杂交的缺点。此外，杂交的基质受制于点电极，必须为一个电路板，传统常用且成本便宜的薄膜并不适用在此杂交系统。
利用电场加速带电荷物质的结合亦被应用在抗体与抗原的结合反应，Zhang等人于CNl092174中利用上下两片铜板以缆线与高频震荡装置连接，将置有抗原与抗体的塑胶板放在下铜板上，高频震荡装置将220伏特的交流电转变为高频电场，使得塑胶板上的抗原与抗体这些带电分子在此高频电场快速震动，于数分钟内完成结合反应。而高频电场造成带电荷物质快速的震动，并不适于应用在核酸的杂交，因为杂交的形成是两条单股核酸序列间数个碱基互补键结的过程(通常至少十个碱基互补才能形成较稳定的结构)，需提供一定的作用时间，故高频震动环境会不利杂交。此外，高频的震动造成反应的核酸在原地震动，无法达到混和的效果，且不具备浓缩的功能，使得结合的效率降低，且高频电场因无法转换上下电场的带电性质，而无法排除非专一性的结合。
亦有文献报告利用电场帮助其他带电荷物质的结合，例如I.Karube等人于W09423287教示抗原和抗体的结合将两个电极放在溶液中，电极表面吸附有已知的抗原或抗体，在两电极间的溶液则含有待测的抗原或抗体，反应足够的时间后，溶液中的抗原或抗体会移动至电极，与电极上的抗原或抗体形成复合体，检测导电度可以得知溶液中抗原或抗体的浓度。此方法施予电场令抗原或抗体移动，最终达到结合的目的，然而并没有利用电场强弱的控制加速复合体的形成，若用以施行在核酸杂交，不仅无法加速作用，亦不能排除非专一性杂交；且藉由导电度的测量推算出溶液中抗原或抗体的浓度，造成电极均需放在溶液中的限制。
综而言之，习知技术的缺点在于第一，利用核酸本身以扩散运动作杂交，与互补核酸接近的速率及效率均差，一般需要十数小时的时间，耗时甚多，而且对于杂交的专一性及敏感性亦无法控制，当待杂交核酸浓度过低时，会因为与互补核酸接近机率低，造成伪阴性，而不完全互补的情况下产生键结则造成伪阳性杂交；第二，以点电场加速待杂交核酸移动至互补核酸所在的技术，虽然可以克服扩散移动的耗时，并能浓缩核酸，提高杂交机率，但是局部的点电场会造成待杂交核酸分布不均匀，提供的杂交机会不均等，造成伪阳性杂交反应等等缺点；第三，以高频电场加速抗原与抗体结合反应的装置及方法，无法提供核酸杂交所需的一定作用时间，不利于核酸的杂交，而高频震动造成核酸原地震动，使核酸无法均匀混合，并排除非专一性的结合。
本发明即藉由一外加电场的设定变化，解决上述习知技艺的缺点，达到快速核酸杂交的目的。
本发明的一目的在于提供一种新的且实用的快速杂交的装置及方法，其可以使得待杂交的靶核酸与互补的探针核酸快速接近，达到快速核酸杂交的目的；并且可以快速浓缩核酸，解决低浓度待杂交核酸不利键结的问题。
本发明的另一目的在于提供一种快速杂交的装置及方法，其可以排除非专一性的键结并具有高敏感性。
本发明的再一目的在于提供一种快速杂交的装置及方法，其可以使待杂交的核酸均匀分布，使得杂交的机会均等。
本发明的次一目的在于提供一种快速杂交的装置及方法，其操作简单且通用于各种尺寸大小的杂交反应应用。
为达到上述目的并避免习知技术的缺点，本发明揭示一种快速杂交反应的装置，包括一用于装载基质的容器，及一电场产生装置，其中该容器内的基质上载有待进行杂交反应的核酸，及位于该基质上的缓冲液层，该电场产生装置包含一电源调控器以及导通至该电源调控器的至少一片电极板，其中该对电极板分别置于该容器上方及下方的任意位置，并由该电源调控器供给一电动势至该电极板，藉此产生一可改变方向且至少涵盖该基质的电场。
本发明另揭示一种快速杂交的方法，包括下列步骤将第二杂交核酸附载于一容器中的基质上，并且于基质上的缓冲液层中含有第一杂交核酸；施予-方向向上之面电场于该容器上以进行第一杂交核酸与第二杂交核酸的杂交反应；改变电场方向而成为一方向向下的电场，使不完全杂交的第一杂交核酸往远离第二杂交核酸的方向移动；以及重复上述两步骤数次达到符合要求的杂交反应。
本发明将以下列图示进一步说明，其中


图1为本发明装置的主结构图；图2为本发明装置的主结构侧面图；图3为基质上附载核酸物质的示意图；图4a～图4f为显示本发明中快速核酸杂交的反应步骤；图4a显示本发明中快速核酸杂交方法中的加热反应；图4b显示本发明中快速核酸杂交方法中于加热反应后，待测核酸物质由双链裂解为单链；图4c显示本发明中快速核酸杂交方法中于外加一向上电场后，探针核酸向下快速移动；图4d显示本发明中快速核酸杂交方法中停止外加电场；图4e显示本发明中快速核酸杂交方法中外加一向下电场后，未键结探针核酸向上快速移动；图4f显示本发明中快速核酸杂交方法中外加一向上电场方向后，未键结探针核酸向下快速移动；图5为本发明装置的另一实施方案；及图6为本发明装置的另一实施方案。
附图元件符号说明
a,b 代表待测核酸物质的运动方向1代表容器2代表下电极板3代表上电极板4代表电源调控器5代表基质6代表待测的样本核酸7代表杂交缓冲液层8代表探针核酸(双股)9代表探针核酸(单股)10 代表平行电极板11 代表转盘本发明涉及在核酸杂交技术中有效加速杂交的反应速率，并且能兼顾反应的专一性与机会均等的装置及方法。根据本发明，一种快速杂交反应的装置，包括一用于装载基质的容器，及一电场产生装置，其中该容器内的基质上载有待进行杂交反应的核酸，及位于该基质上的缓冲液层，该电场产生装置包含一电源调控器以及导通至该电源调控器的至少一片电极板，而该对电极板是分别置于该容器上方或下方的任意位置，并由该电源调控器供给一电动势至该电极板，藉此产生一可改变方向且至少涵盖该基质的电场，经由控制该电场的方向将促进杂交的进行。
于本发明的各式较佳实施方案中，该电极板可为两个平面板，一平面板与一曲面板，以及两个曲面板等的任意一种组合，且分别置于该容器的上方以及下方。电极板的材料可为任意导电材质，而基质为固体材质、如硅胶、玻璃或半导体，或者是滤膜，如尼龙膜、硝基纤维膜或滤纸。而本发明的装置中可视需要进一步包含一旋转马达，藉以扰动该核酸；一温度控制装置，藉以控制反应温度；或者一对位于该容器两侧的电极板，藉以产生一水平平行方向的电场。
本发明还涉及一种快速杂交的方法，包括下列步骤(a)将第二杂交核酸附载于一容器中的基质上，并且将第一杂交核酸加至基质上的缓冲液层中；(b)施予一方向向上之面电场于该容器上以进行第一杂交核酸与第二杂交核酸的杂交反应；(c)改变电场方向而成为一方向向下的电场，使不完全杂交的第一杂交核酸往远离第二杂交核酸的方向移动；及(d)重复上述两步骤数次达到符合要求的杂交反应。
本发明的方法中，于步骤(c)改变电场方向前，可先归零该电场，使第一杂交核酸电泳至第二杂交核酸并且进行杂交反应。而电场方向改变的步骤约重复进行至少三次，即可快速完成杂交反应。
于各式较佳实施例中，可视需要进一步包含旋转该杂交核酸，或施予一平行方向的电场，或加热步骤。
于一具体实施例中，本发明利用核酸(DNA或RNA)带负电的性质，将附着有待测的样本核酸的基质容器置于两个电极板中央，于基质上滴入含有探针核酸的溶液后，基质下方电极板通以正电，上方电极板通负电，利用同性电荷相吸，异性电荷相斥的原理，藉由电场的设定变化，达到快速核酸杂交的目的。溶液中探针核酸受电场影响而快速浓缩并接近基质上的样本核酸(即靶核酸)，随后解除电场，使探针核酸以布朗运动泳动，找到基质上互补核酸序列的样本核酸并共价键结。之后将下方电极板改通以负电，上方电极板改通正电，使未与样本核酸结合或不完全互补的探针核酸脱离基质，之后再次解除电场，令探针核酸自由泳动。随后再回复下方电极板通以正电，上方电极板通负电，令溶液中探针核酸再次接近基质上的样本核酸，与之键结，之后再将上下电极板电性调换，反复数次后，可快速使探针核酸与基质上的样本核酸的键结具有最高的专一性及敏感性。
以下就附图例示本发明的具体实施例，惟需注意者，该附图仅作为示范之用，并不据以局限本发明的范围。
图1为本发明装置的主结构图，其中容器1是用以承载基质、杂交核酸以及缓冲液层(未图示)等进行杂交反应的必要物质；下电极板2以及上电极板3分别位于该容器1的下方以及上方，为任意导电材质所构成的平面或曲面板，由电源调控器4供应一电动势至该上下电极板，该电动势的范围为从十伏特至一万伏特，藉此产生一可转换方向的电场通过该容器以及其内承载的物质。其主结构侧面图则如图2所示，其中特别图示位于容器1内的基质5。图3为基质上附载核酸物质的示意图，其中基质5上载有待测的样本核酸6，该待测的样本核酸6是经放大以清楚表示。
图4a至图4f为本发明一具体实施例，其显示快速核酸杂交反应的步骤。首先，加热杂交反应物质，如图4a所示，杂交缓冲液层7以及探针核酸(双股)8加入容器1内(未按比例)，加热使该探针核酸由双股变性成为单股，如图4b所示的探针核酸(单股)9。接着，外加一向上电场，使探针核酸向下快速移动，如图4c所示；该电场是由下电极板的正电压以及相对上电极板3的负电压所产生，探针核酸(单股)9本身所带的负电性，受到该电场的吸引，往运动方向a前进，快速接近基质6，并与之产生杂交反应，期间维持五秒钟至五分钟，较佳者为三十秒钟至三分钟。
由于电场是由面电极板所产生，可以产生一全面性的吸引力施加于整个缓冲液层，杂交核酸的杂交机会是均等的。图4d显示停止外加电场，期间维持五秒钟至五分钟，较佳者为三十秒钟至三分钟，使互补的样本核酸与探针核酸产生杂交反应；惟探针核酸迅速往下并与样本核酸反应的同时，非互补的核酸之间同样产生键结，会造成伪阳性杂交结果；因此接着至少需要一次以上施加反向电场，如图4e图示，外加一向下电场后，期间维持五秒钟至五分钟，较佳者为三十秒钟至三分钟，未键结的探针核酸(单股)9沿运动方向b快速移动，该电场是由下电极板的负电压以及相对上电极板3的正电压所产生，不互补或未完全反应完全的探针核酸(单股)9本身所带的负电性，受到该电场的排斥，往运动方向b前进，快速远离基质6。此一电场方向的转换，得以区别互补与不互补的核酸，与基质上的各样本核酸互补的探针核酸由于杂交后产生高度键结，不受该电场的排斥，继续留在基质上。
为了提高杂交反应的完全性，接着外加一向上电场，使未键结探针核酸向下快速移动，如图4f图示。电场方向转变，一方面提高缓冲液层内杂交核酸的混合程度，使得杂交机会均等性提高，另一方面，使尚未来得及完成杂交反应的探针核酸能够再次接近互补的样本核酸(当电场方向往上时)，以及使伪杂交反应的探针核酸与不完全互补的样本核酸分离(当电场方向往下时)，提高准确度。
本发明尚包含在两电极板旁吹气或通电，如图5为本发明装置的另一实施例，另外加入一对平行电极板10。图6亦为本发明装置的另一实施例，在下方电极板装设转盘11使基质旋转；或藉由温度的控制等方法，其皆能增加混合程度，提高杂交反应速率以及机会均等性。
本发明利用电极板电性的转换控制核酸的泳动，可在数分钟内完成杂交反应，较传统以扩散原理达成杂交所需的8至10数小时快速60-100倍。而电极板的设计可排除点电场造成探针核酸分布不均匀所引起杂交机会不均等的缺点。
兹以下列实施例作进一步的例示，以使本发明更加具体。此等实施例仅在使技术人员得以清楚明了本发明方法的技术内容，从而得以据以实施之，而非以限定本发明所应获致的保护范围。
实施例以面电场控制核酸杂交将待测DNA(lug)95℃作用5分钟使其变性，即令核酸由双股分开成单股，于冰上静置1-2分钟后点在4cm2(2cm×2cm)尼龙膜(Boehringer Manngeim Biochemicals BM,cat.no.1209299)上，于80℃烘干两小时以固定核酸。
将点有核酸的尼龙膜放在塑胶盒中(L×W×H 5.5cm×4cm×0.5cm)并置于相距二公分的上电极板以及下电极板(L×W×H10cm×10cm×0.5cm)之间，加入1ml的杂交溶液于塑胶盒中(5×SSC；0.1％(w/v)N-月桂酰肌氨酸；10％(w/v)SDS；1x封闭缓冲液，Boehringer Manngeim Biochemicals BM；cat.no.1093657,DlG DNA标记和检测试剂盒)[20ml/100cm2],68℃预温30分钟。
将以DlG标记的探针核酸溶于另一杂交溶液，于95℃作用5分钟后变性(5-25ng/ml,ml)[2.5ml/100cm2]，冰上静置1-2分钟后加在该尼龙膜上，于42℃下电极板通正电(60伏)，上电极板通负电(60伏)，杂交1分钟后解除电场30秒钟，再将上下电极板的电性改为上正(10伏)下负(10伏)，作用30秒钟，再解除电场30秒钟，此电性转换的步骤反复十次，使杂交完全，并排除不完全杂交的部分，随后以0.1％SDS的2x SSC于室温冲洗五分钟。
加入标记有碱性磷酸酶的抗DIG抗体(抗-DlG-AP缀合物)[2ul抗DlG-AP缀合物/20ml 1x封闭溶液]室温作用30分钟，以马来酸缓冲液(0.1M马来酸，0.15M NaCl,pH7.5)于室温冲洗2次，每次15分钟。将尼龙膜浸在检测液(0.1M Tris-HCl；0.1M NaCl；50mM MgCl2,pH9.5)分钟，再将尼龙膜移至新鲜配制的呈色液(45ul NBT溶液与35ul X-磷酸盐溶液混和，以检测液将体积调至10ml)，黑暗中作用10分钟，最后以一倍TE缓冲液冲洗一次终止反应，室温风干即可。
以上所述的详细说明，仅为本发明的较佳实施方案，并非据以限定本发明的保护范围；凡其它未脱离本发明所揭示精神下的衍生或改变，均应该由下列所述明的权利要求书所界定。
权利要求
1．一种快速核酸杂交的装置，包括一用于装载基质的容器，及一电场产生装置，其中该容器内的基质上载有待进行杂交反应的核酸，及位于该基质上的缓冲液层，该电场产生装置包含一电源调控器以及导通至该电源调控器的至少一片电极板，而该电极板是置于该容器上方及下方的任意位置，并由该电源调控器供给一电动势至该电极板，藉此产生一可改变方向且至少涵盖该基质的电场，经由控制该电场的方向促进杂交的进行。
2．如权利要求1所述的装置，其中该电极板为两个平面板，一平面板与一曲面板，或两个曲面板的任意一种组合。
3．如权利要求1所述的装置，其中该电极板为任意导电材质。
4．如权利要求1所述的装置，其中该基质为硅胶。
5．如权利要求1所述的装置，其中该基质为玻璃。
6．如权利要求1所述的装置，其中该基质为半导体。
7．如权利要求1所述的装置，其中该基质为尼龙膜。
8．如权利要求1所述的装置，其中该基质为硝基纤维膜。
9．如权利要求1所述的装置，其中该基质为滤纸。
10．如权利要求1所述的装置，进一步包含一旋转马达，藉以扰动该带电荷物质。
11．如权利要求1所述的装置，进一步包含一温度控制装置，藉以控制反应温度。
12．如权利要求1所述的装置，进一步包含位于该容器两侧的电极板，藉以产生一水平平行方向的电场。
13．一种快速核酸杂交的方法，包括下列步骤(a)将第二杂交核酸附载于一容器中的基质上，并且将第一杂交核酸加至基质上的缓冲液层中；(b)施予一方向向上之面电场于该容器上以进行第一杂交核酸与第二杂交核酸的杂交反应；(c)改变电场方向而成为一方向向下的电场，使不完全杂交的第一杂交核酸往远离第二杂交核酸的方向移动；及(d)重复上述两步骤数次达到符合要求的杂交反应。
14．如权利要求13所述的方法，其中于步骤(c)改变电场方向前，进一步包括先归零该电场，使第一杂交核酸电泳至第二杂交核酸并且进行杂交反应。
15．如权利要求13所述的方法，进一步包括旋转该杂交核酸。
16．如权利要求13所述的方法，进一步包括施予一水平平行方向的电场。
17．如权利要求13所述的方法，进一步包括加热步骤。
18．如权利要求13所述的方法，其中电场方向改变的步骤重复进行至少三次。
全文摘要
本发明提供了一种快速杂交的装置,包括一用于承载基质的容器,及一电场产生装置,其中该电场产生装置包含一电源调控器以及至少一片置于该容器上方或下方的电极板,藉此产生一可改变方向且至少涵盖该容器的电场。本发明另提供一种快速杂交的方法,包括施予一方向向上之面电场于杂交反应物质,归零该电场,最后改变电场方向成为一方向向下的电场,藉此吸引或排斥核酸,以加速杂交反应。本发明可加速杂交的反应速率,大幅降低反应时间,并兼顾反应的专一性与机会均等。
文档编号A01H1/02GK1320367SQ00106269
公开日2001年11月7日 申请日期2000年4月26日 优先权日2000年4月26日
发明者杨文通, 李泔泓, 蔡娟美, 施宇豪, 王意雯 申请人:晶宇生物科技实业股份有限公司