专利名称：检测突变的方法
技术领域：
本发明涉及检测生物体基因变异的方法。基因分析用于疾病的危险性评估、诊断、 预后或疾病治疗。例如，针对特定人的特定基因的突变分析使得预测疾病危险性成为可能， 由此促进疾病的预防。通过突变分析，能够检测引起疾病的病毒是否已对药物产生了耐药 性，从而可进行有效的治疗。
背景技术：
人类基因组计划使我们能够更全面的衡量疾病的危险性、诊断或预后以及预测对 药物治疗的反应。大量个体的核苷酸序列的分析呈现出多态性位点，将其称为SNPs(单核 苷酸多态性)。SNP是以特有的频率出现在生物体的染色体的核苷酸序列中的变异。在人 体中，大约每1，000个碱基出现SNP。考虑到人类基因组的大小，数百万的SNP存在于人体 中。由于将SNP视作解释个体之间特征性差别的手段，因此，SNP可通过诊断病因，用于疾 病的预防或治疗。由人类基因组计划发现的SNP仅表明多态性存在于人体中，但并未表明那些多态 性是怎样与疾病相联系的。为了揭示SNP与疾病之间的关系，需要比较分析表现在健康人 和患者中的多态性模式，即SNP计分。为了准确检验SNP和疾病之间的关系，应当正确分析 大量的SNP。SNP 计分法(SNP scoring method)包括 DNA 测序、PCR-SSCP (多聚酶链反 应_单链构象多态性)、等位基因特异性杂交、寡核苷酸连接(oligo-ligation)、微测序 (mini-sequencing)和酶切法。使用DNA芯片的方法也被提出，但除了使用固定寡核苷酸探 针的载体外，该方法与等位基因特异性杂交在原理上是没有区别的。用于进行DNA测序的两种传统方法是Maxam & Gilbert化学测序法，以及近来使 用的Sanger法。DNA测序法是为了弄清楚整个或部分基因的核苷酸序列，而不是检测特定 位点的基因变异。由于可通过检测核苷酸序列来识别特定位点的基因变异，DNA测序法可 用于SNP计分中。然而，由于用靶SNP可读出不需检测的相邻的核苷酸序列，DNA测序法并 不十分有效。在PCR-SSCP (0RITA, M. et al.，Genomics, 1989，5 :8874_8879)中，通过 PCR 扩增 待分析的包含SNP的序列，然后将其分成单链。此后，在聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳。由 于序列的差别改变了 DNA的二级结构，因此可通过由结构差异所导致的电泳迁移速度的差 别，检测序列中的突变。等位基因特异性杂交是通过调节例如温度的杂交条件，使用放射性同位素标记的 DNA与附着在尼龙膜上的探针杂交，来检测突变。寡核苷酸连接(Nucleic Acid Research 24，3728，1996)是通过在一定条件下进行反应来检测序列突变，在该条件下，如果靶DNA不与模板DNA互补，则反应不会发生，从而 确认连接是否发生。微测序(Genome Research 7 =606,1997)是为SNP计分而开发的。该方法在仅可 聚合一个目标碱基的条件下进行DNA聚合，然后识别聚合碱基是什么。由于PCR-SSCP、等位基因特异性杂交、寡核苷酸链接均使用了聚丙烯酰胺凝胶，因 此，这些方法在分析许多样品时不是十分有效的方法。并且，这些方法并不能够识别由探针 与非目标位点错配所导致的错误。尽管微测序在分析许多样品时是简单而有效的，但仍不能识别错配的错误所导致 的不正确的结果，而且微测序不能够发现碱基的缺失和插入。为了 SNP计分，还开发了酶切法(W0 01/90419)。在酶切法中，使用例如PCR的适 当方法扩增待分析的序列。该扩增产物包括可被两种限制性内切酶酶切或识别的序列。酶 切法是通过用两种限制性内切酶酶切扩增产物并检测酶切片段的分子量来检测序列变异。 由于在用PCR扩增基因后，由限制性内切酶反应所得片段的分子量可通过质谱分析检测得 到，因此酶切法具有简单、快速的优点。然而，在专利WO 01/90419中描述的酶切法并不能 识别由错误导致的不正确的分析。尽管在PCR期间，当引物结合在非目标位点上时，可能导 致不正确的分析，但并不能识别该不正确的分析。例如，用于检测CYP2C9的多态性的引物 可以与CYP2C8相结合。在这种情况下，由于并不能识别除了 CYP2C9以外，引物是否还与 CYP2C8结合，因此，很难发现是否发生了错误。该方法可以检出一个碱基的取代，但不能检 出碱基缺失或插入。而且，该方法还不能同时检出相邻的两个或两个以上碱基的取代。
发明内容
因此，本发明的目的在于提供一种用于准确而有效的检测生物体突变的方法。为了实现上述目的，在本发明的具体实施方式
中，提供了一种用于准确而有效的 检测生物体突变的方法。本发明能够简单而快速的检测出许多样品中的突变，而且能够通过识别由引物在 错误区域的结合而导致的错误而准确检测突变。而且，本发明提供了检测两个或两个以上 突变位点的方法，该突变位点在32个碱基之内同时相邻；本发明还提供了检出缺失或插入 的方法。特别是，当在个体中有不同的基因型时，本发明方法可识别出不同位点的突变是在 一个基因型中同时存在，还是在不同的基因型中混合存在。例如，人具有包含相同基因信息 的一对(两条)染色体。当突变出现时，它可能或者出现在两条染色体中(纯合子)，或者 出现在一条染色体中(杂合子)。当两个或两个以上相邻碱基的突变均是杂合的时，那些突 变可能同时存在于一条染色体中，或者可能存在于不同的染色体中。由于这两种情形可能 对生命有不同的作用，因此应当将它们区分开。在人受到病毒感染的情况下，各种基因型混 合。当两个以上相邻碱基的突变均是杂合的时，应当区分那些突变是同时存在于一个基因 型中，还是存在于不同基因型中。为了分析突变，本发明的方法扩增目标序列，以包含可被限制性内切酶酶切的所 得产物的位点，而且将由限制性内切酶酶切的片段中的碱基数控制为少于32个，且它们之 中的至少一个碱基是由模板而不是引物本身的复制所产生的，用限制性内切酶将扩增片段 酶切后，检测片段的分子量以分析突变。
在本发明的一个具体实施方式
中，提供了检测突变的方法，包括a)使用正向引物和反向引物扩增靶多核苷酸；b)通过用限制性内切酶酶切扩增的靶多核苷酸，生成两个或两个以上单链多核苷 酸片段，该片段包含长度为2 32个碱基的一个或多个突变序列；以及c)检测酶切片段(cleaved fragment)的分子量。优选的，将所述扩增的多核苷酸切成在一个单链多核苷酸片段中包含两个或两 个以上不同突变中的一个突变，而在另一个单链核苷酸片段中包含所有的突变。例如，当 在...ATG...中的A和G为突变序列时，第一个由限制性内切酶酶切得到的单链核苷酸片 段仅包含两个突变序列中的A，而第二个单链核苷酸同时包含A和G。为了分析突变，本发明的方法扩增目标序列，以使其包含这样的位点，在这些位点 扩增得到的产物可被限制性内切酶酶切，并且酶切片段具有如下的结构。
权利要求
一种检测突变的方法，包括a)使用正向引物和反向引物扩增靶多核苷酸；b)用限制性内切酶酶切扩增的靶多核苷酸，其中，当第一个限制性内切酶与扩增的多核苷酸反应时，第二个限制性内切酶不反应；以及c)检测酶切片段的分子量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用具有不同最适温度的限制性内切酶 进行所述限制性内切酶处理步骤。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述限制性内切酶为选自FokI、Bbv I、 Bsg I.Bcg I、Bpm I,BseR I,Bae I的具有较低最适温度的限制性内切酶和选自BstF5 I、 Taq I,BsaB I,Btr I,BstAP I,Fau I,Bcl I,Pci I,Apo I 的具有较高最适温度的限制性 内切酶。
全文摘要
本发明提供了用于准确有效的检测生物体突变的方法。所述用于检测突变的方法包括下述步骤a)使用正向引物和反向引物扩增靶多核苷酸；b)通过用限制性内切酶酶切扩增的靶多核苷酸，生成两个或两个以上单链多核苷酸片段，该片段包含长度为2～32个碱基的一个或多个突变序列；以及c)检测酶切片段的分子量。
文档编号G01N33/50GK101962672SQ20091020880
公开日2011年2月2日 申请日期2003年10月17日 优先权日2002年10月18日
发明者刘王敦, 文明顺, 李昌弘, 池美善, 洪璿杓, 郑贤在, 金寿玉, 金恩玉, 金楠根, 金锡俊, 黄圣奎 申请人:基因矩阵公司