确定个体基因突变的方法和系统的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医学领域。具体而言，涉及确定个体基因突变的方法和系统。
【背景技术】
[0002] 随着现代工业的发展，环境污染及不良生活习惯导致的肿瘤发生率逐步上升，已 成为影响人类健康寿命的第一大因素。据国际癌症研究机构公布的数据显示，每年全球约 800万人死于癌症。据推断，目前我国的癌症治疗市场规模大约每年新增1800-3600亿元。由 于肿瘤的异质性及人群间的个体差异，不同种群、不同性别，甚至不同生活环境下不同个体 间同一组织的肿瘤样本都会呈现不同遗传背景，如果简单对所有个体都采用同一个用药及 治疗方案，就很容易产生治疗不当或治疗过度的问题，因此获得个体遗传信息就显得尤为 必要。伴随着测序技术的发展，遗传分子水平的检测技术已可以区分不同个体间基因差别， 越来越多的肿瘤相关的基因突变标记被发现，通过寻找到个体肿瘤特异性突变标记，可以 进而有针对性的指导靶向用药及治疗。
[0003]然而，目前普遍的检测方法是，对病人数个热点基因，如EGFR，KRAS等进行sanger 测序，得到其突变信息。对大多数癌种，这样的检测能在一定程度上获得个体遗传信息帮助 治疗，但同时存在三个问题：1)少数基因检测的指导意义有限，不能综合反映病人实际的病 理特征；2)样本多次消耗，需求量大;3)很多癌种仅通过数个基因的测序，不可能确定其癌 症的分子突变分型种类，因此无法给出可靠信息辅助后续治疗。
[0004]而在国外，目前最先进的手段是通过综合性Panel进行关键位点的捕获测序，这也 是这类技术在实践范围内的发展趋势，但是存在价格过高以及参考数据库多为白人，与黄 种人突变频谱存在差异的问题。因此，这类产品在中国今后的发展趋势势必是：1)丰富的检 测位点（综合Panel及基因组测序）；2)合理的价格;3)基于黄种人特有的基因频谱。其市场 容量按上述估计，约10亿。
[0005]然而，目前肿瘤基因检测技术仍有待改进。
【发明内容】
[0006]本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个方面 提出了一种能够有效确定个体基因突变的方法。另一个方面提供了一种能够有效实施该方 法的有效确定个体基因突变的系统。
[0007]根据本发明的实施例，提出了一种确定个体基因突变的方法，所述基因突变与预 定的疾病相关，该方法包括：
[0008] (1)从所述个体的患病组织获取患病组织核酸样本，以及任选地从个体的正常组 织获得正常组织核酸样本；
[0009] (2)利用探针对所述患病组织核酸样本以及任选的正常组织核酸样本进行筛选并 构建测序文库，其中，所述探针特异性识别所述疾病相关的靶基因；
[0010] (3)对步骤(2)中所构建的测序文库进行测序，以便获得患病组织核酸测序结果以 及任选的正常组织核酸测序结果；以及
[0011] (4)基于所述患病组织核酸测序结果，确定与所述疾病相关的基因突变。
[0012] 根据本发明的实施例，通过采用特异性识别靶基因的探针，能够从完整基因组中 提取自定义的基因组区域，富集目的基因组区域进行测序，捕获区域可以是连续或非连续 的基因组长片段、全外显组或其他任何区域，所以可以一次性富集所有感兴趣基因组区域， 从而大幅度降低测序所需样品量及测序费用。进而，根据本发明的实施例，为可以疾病的基 因检测，尤其是癌症基因检测提供更精确、有效、快捷并价格合理的方案，并且根据本发明 的实施例，可以用少量的样本得到更多的肿瘤相关的基因信息，能够准确快捷的对疾病相 关基因突变尤其是癌症分子突变进行分型，从而给出可靠的个体疾病尤其是肿瘤遗传信 息。
[0013] 根据本发明的实施例上述确定个体基因突变的方法还可以具有下列附加技术特 征：
[0014] 根据本发明的一个实施例，所述个体为哺乳动物。
[0015] 根据本发明的一个实施例，所述个体为人。
[0016] 根据本发明的一个实施例，所述疾病为癌症。
[0017] 根据本发明的一个实施例，所述疾病为肝中分化胆管细胞癌，并且所述靶基因为 选自下表的至少之一。
[0018] 表1靶基因列表
[0029] 根据本发明的一个实施例，所述患病组织是以石蜡切片形式提供的。
[0030] 根据本发明的一个实施例，所述正常组织为血液。
[0031] 根据本发明的一个实施例，所述探针是以固相芯片的形式提供的。
[0032] 根据本发明的一个实施例，所述核酸样本包括DNA样本和RNA样本。
[0033] 根据本发明的一个实施例，在步骤(2)中，针对所述DNA样本，通过下列步骤构建 所述测序文库：
[0034] (a)对所述DNA样本进行片段化，以便获得DNA片段；
[0035] (b)将所述DNA片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的DNA片段；
[0036] (c)将所述经过末端修复的DNA片段的3'末端添加碱基A，以便获得具有粘性末端A 的DNA片段；
[0037] (d)将所述具有粘性末端A的DNA片段与接头相连，以便获得连接产物；
[0038] (e)将所述连接产物进行PCR扩增，以便获得第二扩增产物；以及
[0039] (f)将所述第二扩增产物进行纯化回收，以便获得回收产物，所述回收产物构成所 述测序文库，
[0040]其中，
[0041]在进行步骤(e)之前，利用所述探针对所述连接产物进行筛选。
[0042]根据本发明的一个实施例，在步骤(2)中，针对所述RNA样本，通过下列步骤构建所 述测序文库：
[0043] (a)对所述RNA样本进行反转录PCR，以便获得cDNA片段；
[0044] (b)对所述cDNA样本进行末端修复，以便获得经过末端修复的cDNA片段；
[0045] (c)将所述经过末端修复的cDNA片段的3'末端添加碱基A，以便获得具有粘性末端 A的cDNA片段；
[0046] (d)将所述具有粘性末端A的DNA片段与接头相连，以便获得连接产物；
[0047] (e)将所述连接产物进行PCR扩增，以便获得cDNA扩增产物；以及
[0048] (f)基于所述cDNA扩增产物，建立所述RNA样本的测序文库，
[0049]其中，
[0050]在进行步骤(e)之前，利用所述探针对所述连接产物进行筛选。
[0051]根据本发明的一个实施例，步骤(f)进一步包括：
[0052]利用双链特异性核酸酶，对所述cDNA扩增产物进行均一化处理，以便得到均一化 的cDNA扩增产物；
[0053]对所述均一化的cDNA扩增产物进行二次扩增，以便获得二次扩增产物，所述二次 扩增产物构成所述RNA样本的测序文库。
[0054]根据本发明的一个实施例，与所述疾病相关的基因突变包括下列至少之一 ：SNV、 SomaticIndel、SomaticSV、SomaticCNV以及在正常组织和肿瘤组织之间存在表达差异 的基因，
[0055]其中，任选的，在正常组织和肿瘤组织之间存在表达差异的基因是通过下列步骤 确定的：
[0056] 将所述患病组织的RNA样本测序数据和所述正常组织的RNA样本测序数据分别比 对到全基因组和基因区域；
[0057]基于能够比对到所述基因区域的测序数据的量，分别计算每个基因在正常组织和 肿瘤组织中的RPKM值；
[0058]基于所述RPKM值，确定所述在正常组织和肿瘤组织之间存在表达差异的基因。
[0059]根据本发明的一个实施例，所述靶基因包括选自下列的至少之一:靶向药物相关 基因、化疗药物相关基因、药物代谢相关基因、放疗相关基因、激素药物相关基因、抗体药物 相关基因和疫苗相关基因。
[0060]根据本发明的一个实施例，在步骤(4)中，
[0061] 用Varscan进行SNV的查找；
[0062]用GATK进行SomaticIndel的查找；
[0063]用CREST进行SomaticSV的查找；
[0064]用CONTRA或ExomeCNV进行SomaticCNV的查找;或
[0065]用GATK进行化疗、放疗、代谢特殊位点SNP和基因型的判定。
[0066] 根据本发明的一个实施例，利用选自Hiseq2000、SOLiD、454、和单分子测序装置的 至少一种进行所述测序。
[0067]在本发明的又一方面，本发明提出了一种确定个体基因突变的系统，所述基因突 变与预定的疾病相关，该系统包括：
[0068]核酸样本获取装置，所述核酸样本获取装置用于从所述个体的患病组织获取患病 组织核酸样本，以及任选地从个体的正常组织获得正常组织核酸样本；
[0069]文库构建装置，所述文库构建装置与所述核酸样本获取装置相连，并且用于利用 探针对所述患病组织核酸样本以及任选的正常组织核酸样本进行筛选并构建测序文库，其 中，所述探针特异性识别所述疾病相关的靶基因
[0070]测序装置，所述测序装置与所述文库构建装置相连，并且用于所述文库构建装置 构建的测序文库进行测序，以便获得患病组织核酸测序结果以及任选的正常组织核酸测序 结果；
[0071]基因突变确定装置，所述基因突变确定装置与所述测序装置相连，并且用于基于 所述患病组织核酸测序结果，确定与所述疾病相关的基因突变。
[0072]由此，利用根据本发明的系统能够有效地实施前面所描述的确定个体基因突变的 方法。关于该方法前面所描述的特征和优点，均使用该系统，不再赘述。
[0073]根据根据本发明的实施例，本发明的用于确定个体基因突变的系统还可以具有下 列附加技术特征：
[0074]根据本发明的一个实施例，所述个体为哺乳动物。
[0075]根据本发明的一个实施例，所述个体为人。
[0076]根据本发明的一个实施例，所述疾病为癌症。
[0077]根据本发明的一个实施例，所述疾病为肝中分化胆管细胞癌，并且所述靶基因为 选自表1的至少之一。
[0078]根据本发明的一个实施例，所述患病组织是以石蜡切片形式提供的。
[0079]根据本发明的一个实施例，所述正常组织为血液。
[0080]根据本发明的一个实施例，所述探针是以固相芯片的形式提供的。
[0081] 根据本发明的一个实施例，所述核酸样本包括DNA样本和RNA样本。
[0082]根据本发明的一个实施例，所述文库构建装置适于针对所述DNA样本，通过下列步 骤构建所述测序文库：
[0083] (a)对所述DNA样本进行片段化，以便获得DNA片段；
[0084] (b)将所述DNA片段进行末端修复，以便获得经过末端修复的DNA片段；
[0085] (c)将所述经过末端修复的DNA片段的3'末端添加碱基A，以便获得具有粘性末端A 的DNA片段；
[0086] (d)将所述具有粘性末端A的DNA片段与接头相连，以便获得连接产物；
[0087] (e)将所述连接产物进行PCR扩增，以便获得第二扩增产物；以及
[0088] (f)将所述第二扩增产物进行纯化回收，以便获得回收产物，所述回收产物构成所 述测序文库，
[0089]其中，
[0090]在进行步骤(e)之前，利用所述探针对所述连接产物进行筛选。
[0091]根据本发明的一个实施例，所述文库构建装置适于针对所述RNA样本，通过下列步 骤构建所述测序文库：
[0092] (a)对所述RNA样本进行反转录PCR，以便获得cDNA片段；
[0093] (b)对所述cDNA样本进行末端修复，以便获得经过末端修复的cDNA片段；
[0094] (c)将所述经过末端修复的cDNA片段的3'末端添加碱基A，以便获得具有粘性末端 A的cDNA片段；
[0095] (d)将所述具有粘性末端A的DNA片段与接头相连，以便获得连接产物；
[0096] (e)将所述连接产物进行PCR扩增，以便获得cDNA扩增产物；以及
[0097] (f)基于所述cDNA扩增产物，建立所述RNA样