一种简易有效的气传植物真菌病害孢子的单孢分离法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物生产技术领域，具体是一种简易有效的气传植物真菌病害孢子的单孢分离法。
【背景技术】
[0002]现存的气传真菌孢子分离方法主要包括:(1)病组织培养分离法，主要从病组织分离病菌，病组织通过消毒处理，转移到培养基培养，这种传统的方法比较容易导致污染，需要进行多次分离纯化；(2)稀释法或者划线法，对于初步分离到的真菌，将病原菌孢子用无菌水制成孢子悬浮液，涂于水琼脂平板，挑取单孢，该方法首先需要对病原真菌进行初步的人工培养基分离培养，才能挑取单孢，且挑取孢子过程中由于水的流动容易让孢子离开视野范围；(3)离体培养单孢子分离法，该方法是最常规的病原真菌单孢分离方法，通过离体培养，直接从病斑上获取孢子，涂布到水琼脂片上，在显微镜下找到所需孢子，但是此方法要求具备扎实的专业植物病理知识，否则在采样过程中容易错判病组织，取错样品；(4)带有离心管的孢子捕捉仪捕捉分离法，其弊端主要是成本较高，仪器价格大概6万，野外或田间操作不太方便，也容易导致意外丢失或损坏；以上(1)、(2)、(3)种技术获取的真菌孢子只包括对具体特定的植物寄主具有毒性的菌株，才能从感染病害的病斑上分离到该真菌，由于真菌存在小种或致病性分化，空气中的绝大部分菌株对具体的特定寄主品种不具有侵染能力，因此，这部分从其他寄主植物品种上通过风吹传播来的真菌孢子无法通过上述方法实现，研究人员不能通过上述方法或技术获得某种病原真菌在特定环境中所有的真菌菌株；第(4)种方法虽然可以克服(1)、(2)、(3)种技术的缺点，但其缺陷主要是成本高，田间或野外使用不太方便也不太安全；因此现有技术的气传真菌孢子分离方法存在易导致污染、对专业技术要求高，设备成本高等缺陷；需要探究一种技术简便、成本低、污染小的气传真菌孢子的分离方法以解决上述问题。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种技术简便、成本低、污染小、简易有效的气传植物真菌病害孢子的单孢分离法，以解决上述【背景技术】中提出的问题。
[0004]为实现上述目的，本发明提供如下技术方案:
一种简易有效的气传植物真菌病害孢子的单孢分离法，从孢子捕捉到分离包括以下步骤:
1)制备孢子捕捉工具:用竹子或者木头做一个十字形的伞形支架，在十字支架的横架上设置4个摆设玻片的卡槽，卡槽迎风方向倾斜摆设，卡槽高度与寄主植物高度持平；
2)捕捉孢子:将涂上凡士林的玻片放置于支架上的卡槽内，孢子因重力或风的作用沉降于玻片上，收集玻片置于干净容器内带回实验室备用；
3)除杂:将带回实验室的玻片置于显微镜下观察，镜头下观察到各种杂菌孢子和杂质，包括镰刀菌、青霉菌孢子、昆虫及杂物，用挑针挑除肉眼可见的昆虫及杂质； 4)涂布分离:用玻璃涂布器从玻片上粘取白色凡士林涂布于水琼脂上，将第一个涂有孢子的水琼脂上的凡士林再涂到下一个水琼脂上，由于孢子密度较大，重复涂布多次稀释至在光学显微镜10 X物镜下，一个视野范围内分布3-5个孢子为止；
5)取样:在显微镜下挑取单孢子，实现单孢分离。
[0005]作为本发明进一步的方案:所述步骤1中，卡槽倾斜度为45°。
[0006]作为本发明再进一步的方案:所述步骤4中，采用质量分数为4%的水琼脂。
[0007]作为本发明再进一步的方案:所述寄主植物为水稻，所述单孢子为稻瘟菌单孢。
[0008]与现有技术相比，本发明的有益效果是:本发明采用玻片涂凡士林捕捉空气中的孢子，然后从玻片上分离气传孢子，将空气中捕捉到的气传孢子通过涂布稀释法从玻片上分离下来；空气中捕捉的孢子，通过凡士林直接转移到水琼脂上稀释，更好地避免因通过无菌水稀释孢子而带来的细菌污染；凡士林具有粘性，直接挑取孢子时，不容易在水琼脂上移动，便于操作，技术要求低；在涂有凡士林的水琼脂上，可以在显微镜或者检视镜下将杂菌轻轻挑开，然后挑取目标单孢子，分离纯度较高；本发明提供了一种技术简便、成本低、污染小的分离方法，对气传真菌孢子的分离有很好的效果。
【具体实施方式】
[0009]下面结合【具体实施方式】对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
[0010]实施例1
一种简易有效的气传植物真菌病害孢子的单孢分离法，从孢子捕捉到分离包括以下步骤:
1)制备孢子捕捉工具:用竹子或者木头做一个十字形的伞形支架，在十字支架的横架上设置4个摆设玻片的卡槽，卡槽迎风方向倾斜摆设，卡槽倾斜度为45°，卡槽高度与寄主植物高度持平，寄主植物为水稻；
2)捕捉孢子:将涂上凡士林的玻片放置于支架上的卡槽内，孢子因重力或风的作用沉降于玻片上，收集玻片置于干净容器内带回实验室备用；
3)除杂:将带回实验室的玻片置于显微镜下观察，镜头下观察到各种杂菌孢子和杂质，包括镰刀菌、青霉菌孢子、昆虫及杂物，用挑针挑除肉眼可见的昆虫及杂质；
4)涂布分离:用玻璃涂布器从玻片上粘取白色凡士林涂布于质量分数为4%的水琼脂上，将第一个涂有孢子的水琼脂上的凡士林再涂到下一个水琼脂上，由于孢子密度较大，重复涂布多次稀释至在光学显微镜10X物镜下，一个视野范围内分布3-5个孢子为止；
5)取样:在显微镜下挑取单孢子，得到稻瘟菌单孢，实现单孢分离。
[0011]传统的气传真菌孢子分离方法，主要是通过病组织培养分离法、无菌水稀释法或者划线法、离体培养单孢子分离法及带有离心管的孢子捕捉仪捕捉分离法实现分离，现有的最好的方法是将带有离心管的孢子捕捉仪分离法，但是此方法成本较高，使用不太方便，且田间或野外使用容易丢失；而针对空气中玻片捕捉到的气传孢子分离法，本发明采用的初步探索方法是:第一，离心法，玻片捕捉到的孢子进行离心，根据各种孢子和杂质的质量不同，可以将孢子分离开，但是很难判断目标孢子处于哪一层，层面厚度尚不明确；第二，试剂溶解法，此方法是将凡士林溶解，然后将溶解液涂布于水琼脂进行单孢子分离，此方法由于水的存在，容易导致污染，且不明确溶剂对孢子的影响；通过探索，本发明最终探索得到的最佳方法是:凡士林涂布法，即采用已黏附真菌孢子的凡士林直接涂布于质量分数为4%的水琼脂，不仅避免水的污染，而且工序简单，成本低，成效好。
[0012]本发明提供了“从空气中通过玻片凡士林捕捉到的气传真菌孢子，通过凡士林平板稀释的方法将单孢子分离出来”的技术，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出:对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种简易有效的气传植物真菌病害孢子的单孢分离法，其特征在于，从孢子捕捉到分离包括以下步骤: 1)制备孢子捕捉工具:用竹子或者木头做一个十字形的伞形支架，在十字支架的横架上设置4个摆设玻片的卡槽，卡槽迎风方向倾斜摆设，卡槽高度与寄主植物高度持平； 2)捕捉孢子:将涂上凡士林的玻片放置于支架上的卡槽内，孢子因重力或风的作用沉降于玻片上，收集玻片置于干净容器内带回实验室备用； 3)除杂:将带回实验室的玻片置于显微镜下观察，镜头下观察到各种杂菌孢子和杂质，包括镰刀菌、青霉菌孢子、昆虫及杂物，用挑针挑除肉眼可见的昆虫及杂质； 4)涂布分离:用玻璃涂布器从玻片上粘取白色凡士林涂布于水琼脂上，将第一个涂有孢子的水琼脂上的凡士林再涂到下一个水琼脂上，由于孢子密度较大，重复涂布多次稀释至在光学显微镜10 X物镜下，一个视野范围内分布3-5个孢子为止； 5)取样:在显微镜下挑取单孢子，实现单孢分离。2.根据权利要求1所述的简易有效的气传植物真菌病害孢子的单孢分离法，其特征在于，所述步骤1中，卡槽倾斜度为45°。3.根据权利要求1所述的简易有效的气传植物真菌病害孢子的单孢分离法，其特征在于，所述步骤4中，采用质量分数为4%的水琼脂。4.根据权利要求1所述的简易有效的气传植物真菌病害孢子的单孢分离法，其特征在于，所述寄主植物为水稻，所述单孢子为稻瘟菌单孢。
【专利摘要】本发明公开了一种简易有效的气传植物真菌病害孢子的单孢分离法，从孢子捕捉到分离包括以下步骤：1）制备孢子捕捉工具；2）利用涂有凡士林的玻片捕捉孢子；3）显微镜下对玻片上的可见杂物除杂；4）利用玻璃涂布器从玻片上粘取白色凡士林涂布于4%水琼脂上，反复操作多次稀释孢子浓度；5）在显微镜下挑取单孢子，实现单孢分离；本发明采用玻片涂凡士林捕捉空气中的孢子，然后从玻片上分离气传孢子，将空气中捕捉到的气传孢子通过涂布稀释法从玻片上分离下来；避免了细菌污染、便于操作、技术要求低、分离纯度高、技术简便、成本低，提供了一种很好的气传真菌孢子分离方法。
【IPC分类】C12Q1/24
【公开号】CN105420343
【申请号】CN201610000854
【发明人】谢勇, 徐返, 杨伟, 张时飞, 匡希茜, 王扬, 汤东生, 李凡, 李成云, 王云月
【申请人】云南农业大学
【公开日】2016年3月23日
【申请日】2016年1月4日