猪德尔塔冠状病毒和猪传染性胃肠炎病毒多重rt-pcr检测引物及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种病毒的检测方法，具体涉及一种猪德尔塔冠状病毒和猪传染性胃 肠炎病毒多重RT-PCR检测引物及检测方法。
【背景技术】
[0002] 猪德尔塔冠状病毒（Porcine Deltacoronavirus，F1DCoV)属于尼多病毒目 (Nidovirales)、冠状病毒科（Coronaviridae)、冠状病毒属（Coronavirus)的 Delta 冠状病 毒，为有囊膜的单股正链RNA病毒。早在2012年，Woo等发表的文章中就有I3DCoV的报道：他 们对广东和香港等地采集的哺乳动物和禽类病料进行Delta冠状病毒检测，其中在猪粪便 样品（169份）中检测到近10%的H)CoV。2014年初，美国俄亥俄州首次检测报道一种新的 猪肠道冠状病毒roc〇v，截止2014年底，美国发现roc〇v感染病例达17个州。随后在加拿和 韩国也报道检测到了 roCoV，其阳性检出率高达25%。猪传染性胃肠炎病毒（Tansmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV)为套式病毒目冠状病毒科、Alpha冠状病毒属的 病毒，是猪传染性胃肠炎的主要病原。由于roCoV和TGEV的临床表现、病理变化、流行病学 等方面非常相似，给临床诊断带来了一定的困难。诊断这两种疾病的传统方法有临床观察、 病毒分离、显微病变观察、荧光抗体检测、免疫组织化学法等。然而这些方法操作较繁复，且 难以有效区分I 3DCoV感染还是TGEV感染。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种猪德尔塔冠状病毒和猪传染性胃肠炎病毒多重RT-PCR 检测引物及检测方法。
[0004] 本发明的技术方案是：猪德尔塔冠状病毒和猪传染性胃肠炎病毒多重RT-PCR检 测引物：猪德尔塔冠状病毒的引物序列如下：
[0005] 上游引物 Pl :5 ' -ATGGCTACTGGCTGCGTTAC-3 '
[0006] 下游引物 P2 :5 ' -GCGTTTCCTGGGCTGATT-3 '
[0007] 扩增猪德尔塔冠状病毒基因部分片段383bp ;
[0008] 猪传染性胃肠炎病毒的引物序列如下：
[0009] 上游引物 P3 :5 ' -CCCTCCAGCAAGGTTCAA-3 '
[0010] 下游引物 P4 :5 ' -GCAACCCAGACAACTCCA-3 '
[0011] 扩增猪传染性胃肠炎病毒基因部分片段229bp。
[0012] 利用所述引物检测猪德尔塔冠状病毒和猪传染性胃肠炎病毒多重RT-PCR的方 法，该方法不用于疾病的诊断和治疗，包括提取病毒的DNA后，按如下多重荧光定量RT-PCR 反应体系和反应条件对病毒进行检测：
[0013] 所述SYBR Green I多重荧光定量RT-PCR反应体系，在25 μ 1体系中加入以下成 份：
[0015] 所述反应条件为：95°C 5min，94°C lmin，58°C 30s，72°C 30s，35 个循环，72°C延伸 10min〇
[0016] 本发明的有益效果是：本发明根据GenBank中登录的猪Deltacoronavir (PDCoV) 和猪传染性胃肠炎病毒（TGEV)基因序列，设计了 2对引物分别用于扩增roCoV N基因和 TGEV N基因的目的片段。通过对PCR反应条件进行优化，建立了检测roCoV和TGEV的多 重RT-PCR (mPCR)诊断方法。敏感性和特异性结果显示，该多重RT-PCR对I3DCoV和TGEV的 最低检测量分别是4. 05X IO1拷贝/ μ L和5. 47X 10 2拷贝/ μ L，而对猪流行性腹泻病毒 (PEDV)，博卡病毒（PBoV)，猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV)和猪轮状病毒（RV)的扩增结 果均为阴性。57份临床样品的多重RT-PCR检测结果显示，同时感染这2种病毒的阳性率 为1. 75%，感染I3DCoV阳性率为19. 30%，感染TGEV阳性率为1. 75%。结果表明，建立多重 RT-PCR方法能够对roCoV和TGEV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断。
【附图说明】
[0017] 图 1 为多重 RT-PCR 电泳图，M:DL2000DNA marks l:PDCoV and PEDV 2:PDCoV 3:PEDV4:阴性对照；
[0018] 图 2 为多重 PCR 特异性试验，M:DL2000DNA marks I :PDCoV、TGEV 多重 PCR 产物； 2 ~7 分别是：PDCoV、TGEV、PEDV、PBoV、PRRSV、RV 的 PCR 产物；8:阴性对照；
[0019] 图 3 为 PDCoV 的 PCR 敏感性试验，M:DL2000DNA marks 1 ~9:4. 05X108拷贝 / μ L~4. 05 X 10°拷贝/ μ L 10:阴性对照；
[0020] 图4为TGEV的PCR敏感性试验，M:DL2000DNAmarksl~9:5·47X10s拷贝/μL~ 5. 47 X 10°拷贝/ μ L 10:阴性对照；
[0021] 图5为多重RT-PCR的敏感性试验，M:DL2000DNA marks 1~9: IO8~10 °拷贝/ μ L 10:阴性对照。
【具体实施方式】
[0022] 本发明根据GenBank登录的PDCoV的HKU15-155株N基因序列，TGEV的Η155株 N基因序列，通过序列分析获得其高度保守的特异性序列，并根据该特异性保守序列设计了 两对特异性引物。在此基础上建立了 PDCoV和TGEV的多重RT-PCR检测方法，并对此方法 进行了评价分析。对河南地区送检的病料样品进行检测分析，进一步在实践中验证方法的 可靠性，从而为兽医临床的诊断和治疗提供理论依据。
[0023] 猪德尔塔冠状病毒和猪传染性胃肠炎病毒多重RT-PCR检测引物：
[0024] 猪德尔塔冠状病毒的引物序列如下：
[0025] 上游引物 Pl :5 ' -ATGGCTACTGGCTGCGTTAC-3 '
[0026] 下游引物 P2 :5 ' -GCGTTTCCTGGGCTGATT-3 '
[0027] 扩增猪德尔塔冠状病毒基因部分片段383bp ;
[0028] 猪传染性胃肠炎病毒的引物序列如下：
[0029] 上游引物 P3 :5 ' -CCCTCCAGCAAGGTTCAA-3 '
[0030] 下游引物 P4 :5 ' -GCAACCCAGACAACTCCA-3 '
[0031] 扩增猪传染性胃肠炎病毒基因部分片段229bp。
[0032] 利用所述引物检测猪德尔塔冠状病毒和猪传染性胃肠炎病毒多重RT-PCR的方 法，该方法不用于疾病的诊断和治疗，包括提取病毒的DNA后，按如下多重荧光定量RT-PCR 反应体系和反应条件对病毒进行检测：
[0033] 所述SYBR Green I多重荧光定量RT-PCR反应体系，在25 μ 1体系中加入以下成 份：
[0035] 所述反应条件为：95°C 5min，94°C lmin，58°C 30s，72°C 30s，35 个循环，72°C延伸 10min〇
[0036] I材料和方法
[0037] I. 1病毒和细胞
[0038] 猪Deltacoronavirus (PDCoV)、猪流行性腹泻病毒（PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒 (TGEV)、猪博卡病毒（Porcine bocavirus，PBoV)、猪轮状病毒（RV)、猪繁殖与呼吸综合征病 毒（PRRSV)、LLC-PK细胞、ST细胞均由河南农业大学河南省动物性食品安全重点实验室保 存。PDCoV接种LLC-PK细胞、TGEV接种ST细胞传至8代后出现80%以上的细胞病变（CPE) 时收毒。
[0039] 1. 2主要试剂
[0040] pMD18-T载体、QIAamp Viral RNA Mini Kit提取试剂盒和QIAGEN反转录试剂盒 购自QIAGEN公司、2 X Taq PCR Mix酶、DNA Marker、DNA凝胶回收试剂盒均购自TaKaRa公 司；TRIzol试剂购自Invitrogen公司。
[0041] 1. 3引物的设计及合成
[0042] 应用Primer Premier 5. 0基因分析软件，参照Genbank中登录的]3DCoV N基因、 TGEV N基因设计2对引物（表1)，扩增I3DCoV N基因部分片段383bp，TGEV N基因部分 片段229bp，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。用双蒸水稀释为25 μπιο?/ L，-20°C 保存
[0043] 表1多重RT-PCR引物信息
[0044] Table I The information of primers for multiplex RT-PCR
[0046] I. 4病毒核酸的提取
[0047] 接毒细胞悬液和临床样品于-80°C反复冻融3次后用于病毒核酸的提取。参照 QIAamp Viral RNA Mini Kit提取试剂盒提取病毒总RNA，并利用反转录试剂盒制备反转录 为 cDNA，-80°C 保存。
[0048] I. 5RT-PCR产物的鉴定
[0049] 单一病毒的RT-PCR反应在25 μ L体系中进行，包括2 X Taq PCR Mix酶15 μ L，上 下游引物各lyL(25ymol/L)，CDNA模板4yL，CldH2O补足25yL。PCR反应扩增参数为： 95 1€5111丨11，94°(：1111丨11，581€3〇8,721€3〇8,35个循环，72°(：延伸1〇111丨11。訂-?0?产物经1.0% 琼脂糖凝胶电泳检测，用胶回收试剂盒回收目的产物，将回收的目的片段与PMD18-T载体 连接，转化感受态细胞，用质粒提取试剂盒提取质粒，由上海生工生物工程技术服务有限公 司测序。
[0050] 1. 6 单一 RT-PCR 的反应
[0051] 在25 yL体系中进行，2XTaq DNA MasterMix 12 yL，上下游引物各 0· 5 μ L(25 μL?〇1/υ，质粒模板各 1 μ L，CldH2O 补足 25