用于癌症检测的血浆dna突变分析的制作方法
【专利说明】用于癌症检测的血浆DNA突变分析
[0001] 相关申请的夺叉引用
[0002] 本申请是2012年6月21日提交的标题是"用于癌症检测的血浆DNA突变分析 (MUTATIONAL ANALYSIS OF PLASMA DNA FOR CANCER DETECTION)" 的美国临时专利申请第 61/662,878号、2012年8月13日提交的标题是"用于癌症检测的血浆DNA突变分析"的美 国临时专利申请第61/682, 725号、2012年8月31日提交的标题是"用于癌症检测的血浆 DNA突变分析"的美国临时专利申请第61/695, 795号、和2012年10月8日提交的标题是 "用于癌症检测的血浆DNA突变分析"的美国临时专利申请第61/711，172号的非临时申请， 并且要求所述临时专利申请的权益，所述临时专利申请以全文引用的方式并入本文中用于 所有目的。
【背景技术】
[0003] 已经显示，肿瘤来源的DNA存在于癌症患者的无细胞的血浆/血清中（陈XQ (Chen XQ)等人自然医学（Nat Med) 1996;2:1033-1035)。大多数现行方法基于对已知与癌症相 关的突变进行直接分析（迪尔F(Diehl F)等人美国国家科学院院刊（Proc Natl Acad Sci) 2005; 102:16368-16373;弗休 T(Forshew T)等人科学?转化医学（Sci Transl Med) 2012 ;4:136ra68)。另一种方法已经研究了通过对血浆DNA进行随机测序而检测的癌 症相关基因组拷贝数变异（洛（Lo)等人的美国专利公开2013/0040824)。
[0004] 已知随着时间，多于一种癌细胞将获得生长优势并且产生多个子代细胞克隆。 最终，肿瘤的生长和/或其转移灶将含有多种克隆癌细胞群的聚结物。此现象典型地称 为肿瘤异质性（格林杰M(Gerlinger M)等人新英格兰医学杂志（N Engl J Med)2012; 366:883-892 ;叶 TA (Yap TA)等人科学?转化医学 2012 ;4:127psl0)。
[0005] 已知癌症是高度异质的，即相同组织类型的癌症的突变分布可以大幅变化。因此， 对特定突变进行直接分析典型地仅可以检测已知与那些特定突变相关的特定癌症类型内 的病例的子集。另外，肿瘤来源的DNA通常是人类血浆中DNA的微量物质；血浆中DNA的绝 对浓度低。因此，即使在患有已知具有标靶突变的癌症的患者中，直接检测血浆或血清中某 一或某一小批癌症相关的突变也可能会获得低分析敏感性。此外，已经显示，即使在单一肿 瘤内就突变来说也存在显著瘤内异质性。突变可以仅见于肿瘤细胞的亚群中。原发性肿瘤 与转移性病变之间的突变分布差异甚至更大。一个关于瘤内和原发性-转移性间的异质性 的实例包括罹患结肠直肠癌的患者中的KRAS、BRAF和PIK3CA基因（巴尔杜斯（Baldus)等 人临床癌症研究（Clin Cancer Research) 2010. 16:790-9·)。
[0006] 在其中患者具有原发性肿瘤（携带KRAS突变但无 PIK3CA突变）和隐蔽转移性病 变（携带PIK3CA突变但无 KRAS突变）的情形下，如果集中于检测原发性肿瘤中的KRAS突 变，那么无法检测隐蔽转移性病变。然而，如果在分析中包括两种突变，那么可以检测原发 性肿瘤和隐蔽转移性病变两者。因此，包括两种突变的测试在残余肿瘤组织的检测中将具 有更高敏感性。当针对癌症进行筛选时，当拥有极少或不拥有关于可能出现的突变类型的 信息，这种简单实例变得更复杂。
[0007] 因此需要提供新技术，以便针对癌症执行广泛筛选、检测或评估。
【发明内容】
[0008] 实施方案可以观察经历针对癌症的筛选或监测的受试者的生物样品（例如血浆 或血清）中的体细胞突变频率，当与同一受试者的组成型DNA中的体细胞突变频率相比时。 可以使用随机测序来测定这些频率。参数可以来源于这些频率并且用以确定癌症等级的分 类。可以通过要求任何变异基因座都具有至少规定数目的变异序列读取（标签）来将假阳 性过滤掉，由此提供更准确的参数。可以分析不同变异基因座的相对频率以测定患者中肿 瘤的异质性等级。
[0009] 在一个实施方案中，可以将参数与来源于一组不患有癌症或具有低癌症风险的受 试者的相同参数比较。获自测试受试者的参数与来自不患有癌症或具有低癌症风险的受试 者群组的参数的显著差异可以表明，测试受试者患有癌症或癌变前病况或在将来将患上癌 症的风险增加。因此，在一个实施方案中，可以在无肿瘤的先前基因组信息的情况下进行血 浆DNA分析。这种实施方案因此尤其适用于筛选癌症。
[0010] 在另一个实施方案中，实施方案还可以用于监测治疗后的癌症患者并且查看是否 存在残余肿瘤或肿瘤是否已经复发。举例来说，具有残余肿瘤或肿瘤已经复发的患者将具 有比不存在残余肿瘤或未观察到肿瘤复发的患者中更高的体细胞突变频率。所述监测可以 包括在治疗后的多个时间点从癌症患者获得样品，以便确定体液或具有无细胞的核酸的其 它样品（例如血浆或血清）中肿瘤相关的遗传畸变的时间变化。
[0011] 根据一个实施方案，一种方法检测受试者中的癌症或癌变前变化。获得受试者的 组成型基因组。接收受试者的生物样品中的多个DNA片段中每一个的一个或多个序列标 签，其中生物样品包括无细胞的DNA。测定序列标签的基因组位置。将序列标签与组成型基 因组比较以测定某第一基因座的第一数目。在每个第一基因座处，相对于组成型基因组具 有变异序列的序列标签的数目高于某一截止值，其中截止值大于一。基于在第一基因座处 具有变异序列的序列标签的数目测定参数。将参数与阈值比较以确定受试者中癌症等级的 分类。
[0012] 根据另一个实施方案，一种方法分析受试者的一或多个肿瘤的异质性。获得受试 者的组成型基因组。接收受试者的生物样品中的多个DNA片段中每一个的一个或多个序列 标签，其中生物样品包括无细胞的DNA。测定序列标签的基因组位置。将序列标签与组成型 基因组比较以测定第一基因座的第一数目。在每个第一基因座处，相对于组成型基因组具 有变异序列的序列标签的数目高于某一截止值，其中截止值大于一。基于第一基因组位置 集的各自第一数目计算一或多个肿瘤的异质性的度量。
[0013] 根据另一个实施方案，一种方法测定包括无细胞的DNA的生物样品中的肿瘤DNA 的百分比浓度。接收生物样品中的多个DNA片段中的每一个的一个或多个序列标签。测定 序列标签的基因组位置。对于多个基因组区域中的每一者，由在基因组区域内具有基因组 位置的序列标签测定基因组区域内DNA片段的各自的量。将各自的量标准化以获得各自的 密度。将各自的密度与参考密度比较以鉴别基因组区域是展现出1拷贝损失还是1拷贝增 加。由鉴别为展现1拷贝损失的各自的密度或由鉴别为展现1拷贝增加的各自的密度计算 第一密度。通过将第一密度与另一个密度比较以获得差别来计算百分比浓度，其中将差别 用参考密度标准化。
[0014] 其它实施方案涉及与本文中所描述的方法相关的系统和计算机可读介质。
[0015] 可以参考以下【具体实施方式】和附图获得对本发明的本质和优势的更佳理解。
【附图说明】
[0016] 图1是根据本发明的实施方案检测受试者中的癌症或癌变前变化的方法100的流 程图。
[0017] 图2展示了根据本发明的实施方案将样品基因组（SG)直接与组成型基因组（CG) 比较的方法的流程图。
[0018] 图3展示了根据本发明的实施方案使用参考基因组（RG)将样品基因组（SG)与组 成型基因组（CG)比较的方法300的流程图。
[0019] 图4是表400,其展示当假定样品中的肿瘤来源的DNA的百分比浓度是10%时，根 据本发明的实施方案使用不同出现数目作为对样品中所存在的突变分类的标准正确鉴别 的癌症相关的单核苷酸突变的数目。
[0020] 图5是表，其展示当假定样品中的肿瘤来源的DNA的百分比浓度是5 %时鉴别的假 阳性基因座的预期数目和突变的预期数目。
[0021] 图6A是图表600，其展示肿瘤来源的DNA的血浆百分比浓度是10 %和20 %的血浆 中的癌症相关的突变的检测率并且使用四次和六次出现（r)作为呼叫潜在癌症相关的突 变的准则。图6B是图表650,其展示相对于测序不同测序深度的错误分类，其分别使用突变 核酸出现次数（r)4、5、6和7作为识别突变位点的标准。
[0022] 图7A是图表700,其展示当假定样品中的肿瘤来源的DNA的百分比浓度是5%时 真实癌症相关的突变位点和假阳性位点的数目相对于不同测序深度的变化。图7B是图表 750,其展示假阳性位点的预测数目，包括分析全基因组（WG)和所有外显子。
[0023] 图8是表800,其展示根据本发明的实施方案4名HCC患者在治疗前后的结果，包 括血浆中的肿瘤来源的DNA的百分比浓度。
[0024] 图9是表900,其展示根据本发明的实施方案检测16名健康对照受试者中的HCC 相关的SNV。
[0025] 图IOA展示了根据本发明的实施方案HCC患者的肿瘤样品的序列读取密度的分布 图。图IOB展示了根据本发明的实施方案HCC患者的血浆中的所有基因组区段的z分数的 分布图1050。
[0026] 图11展示了根据本发明的实施方案HCC患者的血浆的z分数的分布图1100。
[0027] 图12是根据本发明的实施方案测定包括无细胞的DNA的生物样品中的肿瘤DNA 的百分比浓度的方法1200的流程图。
[0028] 图13A展示了根据本发明的实施方案在诊断时分析患有卵巢癌和乳癌的患者的 血浆中的突变的表1300。
[0029] 图13B展示了根据本发明的实施方案关于患有双侧卵巢癌和乳癌患者，分析在肿 瘤切除之后的血浆中的突变的表1350。
[0030] 图14A是展示检测HCCl的血浆DNA中的单核苷酸变异的表1400。图14B是展示 检测HCC2的血浆DNA中的单核苷酸变异的表1450。
[0031] 图15A是展示检测HCC3的血浆DNA中的单核苷酸变异的表1500。图15B是展示 检测HCC4的血浆DNA中的单核苷酸变异的表1550。
[0032] 图16是展示检测患有卵巢癌（和乳癌）的患者的血浆DNA中的单核苷酸变异的 表 1600。
[0033] 图17是展示突变出现频率的不同要求和不同测序深度所对应的预测敏感性的表 1700。
[0034] 图18是展示针对不同截止值和不同测序深度所对应的假阳性基因座的预测数目 的表1800。
[0035] 图19展示了说明不同肿瘤位点检测到的突变数目的树图。
[0036] 图20是表2000,其展示治疗前和治疗后血浆样品中携带肿瘤来源的突变的片段 的数目。
[0037] 图21是图表2100,其展示血浆中单一肿瘤位点检测到的突变和所有四个肿瘤位 点都检测到的突变的出现频率分布。
[0038] 图22是图表2200,其展示血浆中来自异质肿瘤的突变的预测出现频率分布。
[0039] 图23展现了本发明的实施方案在16名招募的健康对照受试者中特异性。
[0040] 图24是根据本发明的实施方案分析受试者的一或多个肿瘤的异质性的方法2400 的流程图。
[0041] 图25展示了可与根据本发明的实施方案的系统和方法一起使用的例示性计算机 系统2500的框图。
【具体实施方式】
[0042] 定义
[0043] 如本文中所用，术语"基因座（locus)"或其复数形式"基因座（loci)"是任何长 度的核苷酸（或碱基对）的位置或地址，其可以在越基因组中具有变化。"区间（bin)"是 基因组中的预定长度的区域。多个区间可以具有相同第一长度（分辨率），而不同多个可以 具有相同第二长度。