生产具有可控分子量的高纯度透明质酸钠(hana)的方法
【专利说明】生产具有可控分子量的高纯度透明质酸钠（HANA)的方法
[0001] 说明书摘要
[0002] 公开的是用于生产透明质酸钠（HANa)的方法，其包括在合适的条件下，在含有糖 作为碳源的营养培养基中培养马链球菌属（Streptococcus equi)兽疫（zooepidemicus) 亚种的微生物。
[0003] 本发明涉及通过链球菌属（Streptococcus)的微生物的大规模发酵来生产高度 纯化的透明质酸钠盐的方法。 发明领域
[0004] 本发明涉及用于生产高度纯化的透明质酸钠的方法，并特别涉及包括发酵步骤的 方法。
[0005] 通过本发明的方法，按照当前的纯度、安全性和一致性标准生产HANa。为了获得高 的纯度，在方法中使用不含有动物来源成分的培养基。
[0006] 由于其颗粒的多孔性和小的尺寸，通过本文要求保护的方法获得的HANa比动物 和发酵来源的其他HANa溶解地更快，导致制造时间和成本的极大降低。此外，材料的高纯 度使得其能够随后被灭菌，而分子量没有任何明显丢失。这种新的制造方法的优势因而是 绝对的安全性、高纯度谱和低热不稳定性；快速的容散性和简单的过滤性以制备溶液；和 分子量的重复性，其与低多分散性（polydispersity)相关。 现有技术
[0007] 透明质酸是自然界中存在的糖胺聚糖，其由具有50, 000-13, 000, 000道尔顿分子 量的线性聚合物组成。其是通过交替的β 1-3和β 1-4键键合的葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄 糖胺的重复单元形成的多糖。透明质酸存在于动物的多种结缔组织中，如皮肤和软骨。一 些器官，如脐带、滑膜液、玻璃体液和公鸡冠中特别富含透明质酸。透明质酸还由多种微生 物，如类型A和C的链球菌产生。透明质酸存在于所有的身体组织中，并执行许多重要的功 能。其促进营养物的释放并从没有血液供应的细胞，如定位在软骨中的那些细胞中转运毒 素；没有足量的HA的话，关节会恶化并且变脆。透明质酸不仅保持关节润滑，还刺激其他身 体组织中的液体潴留。在皮肤和软骨中，透明质酸的作用是结合水并保持组织的张力和弹 性。关节液中的粘性透明质酸溶液充当润滑剂，为细胞提供保护环境。
[0008] 由于其亲水的性质及其流变学和润滑的性质，透明质酸钠是具有高增值的生物聚 合物，其具有广泛的医学应用，包括皮肤水合、骨关节炎治疗、眼科手术、在腹部外科手术后 防止粘连，和创伤愈合。
[0009] 透明质酸钠的新用途是基于其修改细胞行为能力的药物释放、包被/移植和治疗 处理。因为在许多所述应用中配制的产物的性能依赖于生物聚合物的分子量，所以MW代表 透明质酸钠生产中头等重要性的特征。
[0010] 具有两种获得透明质酸钠的主要方法：（i)从动物组织中提取透明质酸（例如从 公鸡冠中提取）；（ii)培养微生物并回收作为发酵产物的透明质酸。 toon] ⑴从公鸡冠中提取昂贵且耗时，并且导致严重的问题，即由于降解透明质酸的酶 (HAase)的污染而导致质量下降，和注射时的炎症反应。提取方法的特征还在于许多问题和 低产量、初始材料的受限可用性、不能控制终产物的特征（如分子量），和来自病毒的污染 风险。
[0012] (ii)通过发酵合适的微生物生产透明质酸钠在成本方面代表有效的方法。在文献 中描述了许多方法使用发酵技术生产和纯化透明质酸钠。然而，它们中的许多方法通常使 用季铵盐来去除杂质，导致漫长的沉淀再溶解时间并且在终产物中存在季铵盐。此外，所述 纯化技术主要基于不同的沉淀步骤，其需要广泛使用有机溶剂，因此增加了纯化产物和处 理废物相关的成本。
[0013] US2010/0137579A1公开了用于纯化生物来源（兽疫链球菌（Sti^ptococcus zooepidemicus))的透明质酸的方法，其适合用于医学使用，包括渗滤和超滤步骤。
[0014] 出版物Biopolymers, 2010, 387-412描述了这样的方法，其用于通过发酵 Streptococcus zooepidermicus，通过碳滤池过滤、超滤/渗滤和通过微量过滤灭菌来生物 技术生产透明质酸。
[0015] Separation and Purification Technology, 2006, 52, 29-38 描述了两步切向流 过滤方法，其用于从发酵液中分离透明质酸。然而，该方法不适合于大规模生产透明质酸， 并且后者不能达到适合于医学使用的纯度。
[0016] 在所述方法相关的问题上，简单、容易应用并且能够去除杂质如蛋白质、核酸、内 毒素、金属离子等的透明质酸钠制造方法的重要性是清晰的。
[0017] 发明描述
[0018] 本发明涉及高产量生产透明质酸钠的方法，该方法通过在好氧条件下，在富含气 流的生长培养基中发酵链球菌细菌，随后从所得培养液中分离细菌，并从该培养液中分离 透明质酸钠。
[0019] 发明详述
[0020] 本发明通过在适当条件下，在合适的营养培养基中，使用马链球菌种兽疫亚种 (来自野生株DSM 20727的突变株）进行发酵来生产高度纯化的透明质酸钠的方法克服了 上文提及的问题。该突变株在2012年06月21日保藏在法国巴黎巴斯德研究所的法国国 立微生物保藏中心（Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (Paris))， 保藏号为CNCM 1-4645下。
[0021] 在发酵过程中，微生物产生透明质酸，并将其释放到培养基中。
[0022] 然后通过如下方法从发酵培养基中回收透明质酸：利用酸降低溶液的粘度，例如 通过超滤将其浓缩并纯化，利用低PH值的热处理检查并确定分子量，利用合适的吸附技术 通过吸附进一步纯化，例如利用有机溶剂通过沉淀来沉淀透明质酸钠，过滤并干燥沉淀物。
[0023] 图示的方案阐明了本发明的方法。
[0024] 根据本发明，"高分子量透明质酸钠"表示具有> I. 8m3/Kg的特性粘度的透明质酸 钠。
[0025] 在高速搅拌和通气条件下，在生物反应器中的合适的培养基中培养微生物。
[0026] 培养基含有初始浓度在20-80克/升范围内的糖作为碳源，和20-30克/升酵母 提取物和/或大豆蛋白胨。
[0027] 通过pH控制器操作连续加入碱性溶液将培养基的pH保持稳定在6. 0-8. 0间隔 内；优选通过连续加入浓缩的NaOH将培养基的pH维持在约7. 0。
[0028] 在加压的好氧条件下，优选利用高速搅拌进行细菌的培养。将气压保持恒定在约 0. 6-1. Obar gauge，并且将通气维持在约0. 8-1. 2空气体积/培养基体积/分钟。
[0029] 发酵产量在5. O-IOg · Γ1的透明质酸钠范围内，所述透明质酸钠的平均分子量在 约1. 8至约3. OxlO6道尔顿范围内。
[0030] 发酵的持续时间是约7-12小时，其中1-5% v/v接种物生长至在600nm处测定的 4. 0-12. OOD单位。发酵结束时，生物量的密度等于8-160D单位的浊度。
[0031] 最合适的培养基具有以下组分：
[0032]
[
【主权项】
1. 用于制造具有范围在60-2400kDa内的确定分子量和低多分散性（I. 4Mw/Mn)的透明 质酸钠的方法，其包括： a) 马链球菌兽疫亚种CNCM 1-4645在合适的培养基中的发酵步骤； b) L 0-5. Obarg的差压条件（Λ P)和〇· 5-4. 5barg的跨膜压力（TMP)下，浓缩和渗滤溶 液的无细胞过滤溶液的超滤步骤。
2. 权利要求1的方法，其中在分批方法中进行所述发酵步骤，以在7-12小时后给出透 明质酸的最大浓缩（5-10g · I71)。
3. 权利要求1和2的方法，其中在好氧条件，0. 6-1. Obar gauge的压力和约0. 8-1. 2 体积的空气/体积培养基/分钟的通气条件下进行所述发酵步骤。
4. 权利要求1-3的方法，其中所述培养基具有以下组分：
5. 权利要求1-4的方法，其中根据下表通过在低pH值下进行热处理来产生具有预先确 定分子量和特性粘度的透明质酸钠：
6.马链球菌兽疫亚种CNCM 1-4645。
【专利摘要】公开的是用于生产具有60-2400kDa的分子量和低多分散性(1.4Mw/Mn)的透明质酸钠的方法，其包括：a)马链球菌兽疫亚种CNCM I-4645在合适的培养基中的发酵步骤；b)1.0-5.0barg的差压条件(ΔP)和0.5-4barg的跨膜压力(TMP)下，通过浓缩和渗滤溶液超滤无细胞过滤溶液的步骤。CNCM I-464520120621
【IPC分类】C12P19-26
【公开号】CN104662158
【申请号】CN201380035588
【发明人】M·帕柳卡, A·鲁杰罗, F·沃尔佩
【申请人】阿尔特刚意大利有限公司
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2013年6月14日
【公告号】CA2879538A1, EP2870255A1, US20150152459, WO2014005822A1