核苷酸扩增反应的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及核苷酸扩增反应。
[0002] 背景知识
[0003] 很多酶，几乎囊括了所有与核苷酸和大多数蛋白酶互作的酶，都需要二价离子的 辅助。例如包含在核苷酸扩增反应中的酶通常需要二价镁离子（Mg++)作为辅助剂。
[0004] 核苷酸扩增能够产生非特异性的扩增产物。在很多情况下，这是由于在扩增程序 发生之前，非特异的寡核苷酸就可以启动和随后的引物延伸，这是因为所用的酶在室温时 通常是有活性的。例如，由于引物二聚体和随后的延伸导致的扩增产物可以经常被观察到。 用于克服这个问题的常用方法包括所谓的"热启动"反应，其中被包括在扩增反应中（如酶 或二价镁离子辅助因子）的至少一种成分要么与反应混合物分开，要么保持失活状态，直 到反应混合物的温度达到适宜的温度。
【发明内容】
[0005] 本发明是基于，至少部分基于，控制酶促反应改进的方法。
[0006] 本发明也基于，至少部分基于，核苷酸扩增方法和组成成分的改进，该核苷酸扩增 具有利用简单试剂进行热启动的优势。
[0007] -方面，本发明提供了一种方法包括：(a)使多（聚）核苷酸和扩增试剂混合形成 反应混合物，其中，反应混合物包括当处于溶液中的可逆结合的二价离子，和（b)调节反应 混合物中的pH值来释放该可逆结合的二价离子，从而启动多核苷酸的扩增。
[0008] 在一些实施例中，二价离子从下列组合中选择：镁、钙、铜、锌、锰、铁、镉和铅。
[0009] 在一些实施例中，二价离子是镁。
[0010] 在本发明的任意实施例中，扩增试剂混合物可以包括一种pH敏感螯合剂。这种pH 敏感螯合剂可以从下列组合中选择：乙二醇-双（2-氨基乙醚）四乙酸（EGTA)，EGTA的衍 生物，和EDTA的衍生物。优选的溶液中的二价离子能与pH敏感螯合剂可逆结合。优选的 pH敏感螯合剂是乙二醇-双（2-氨基乙醚）四乙酸。
[0011] 在本发明的任意实施例中，扩增试剂混合物可以包括一种温度敏感缓冲液。在 一些实施例中，温度敏感缓冲液可以包括三（轻甲基）氨基甲烧（tris (hydroxymethyl) aminomethane)〇
[0012] 在本发明的任意实施例中，反应混合物的pH可以通过温度敏感缓冲液的pH而被 调节。
[0013] 在本发明的任意实施例中，通过改变反应混合物的温度从第一温度到第二温度， 反应混合物的pH可以被调节。
[0014] 在本发明的任意实施例中，在第二温度时温度敏感缓冲液的pKa的值至少低于在 第一温度时温度敏感缓冲液的PKa值的0. 4。
[0015] 在本发明的任意实施例中，温度敏感缓冲液的ApKa值在-0. 04°C η和-0. 015°C η 之间。
[0016] 在本发明的任意实施例中，第一温度在约0°C和10°C之间，约10°C和20°C之间，或 约20°C和30°C之间。优选的第一温度在约20°C和30°C之间。
[0017] 在本发明的任意实施例中，第二温度在约30°C和40°C之间，约40°C和50°C之间， 约50°C和60°C之间，约60°C和70°C之间，约70°C和80°C之间，约80°C和90°C之间，或约 90°C和100°C之间。优选的第二温度在约50°C和60°C之间。
[0018] 在本发明的一些特异实施例中，第一温度在约20°C和30°C之间，第二温度在约 50°C和60°C之间。
[0019] 在本发明的任意实施例中，扩增试剂混合液包括一种切口内切酶，一种DNA或RNA 聚合酶，一种重组酶和/或一种逆转录酶。在一些特异实施例中，扩增试剂混合液包括一种 切口内切酶和一种DNA或RNA聚合酶。在另一个实施例中，扩增试剂混合液包括一种重组 酶和一种DNA或RNA聚合酶。这些实施例可选择性的包括一种逆转录酶。
[0020] 在本发明的任意实施例中，螯合物试剂浓度与二价离子浓度的比值为约0. 5至约 2〇
[0021] 在本发明的任意实施例中，在第一温度时游离的二价离子浓度为约0至约IOmM之 间。
[0022] 在本发明的任意实施例中，在第二温度时游离的二价离子浓度为约5mM至约50mM 之间。
[0023] 在本发明的任意实施例中，扩增试剂混合物包括一种或多种冻干形式的组分。在 特异实施例中，扩增试剂混合物可以包括冻干形式的镁盐。冻干的镁盐可以在缓冲液中复 原来形成溶液中的镁离子。在另一些实施例中，扩增试剂混合物可以包括一种冻干的PH敏 感螯合剂。PH敏感螯合剂可以在缓冲液中被复原。根据这些实施例，缓冲液可以是一种温 度敏感缓冲液。在一些实施例中，溶液中的镁离子被pH敏感螯合剂可逆结合。根据任意上 述的实施例，缓冲液的pH值为了让pH敏感螯合剂与溶液中的游离镁离子可逆结合而为可 以控制的。优选的，扩增试剂混合物包括溶液中与PH敏感螯合剂可逆结合的镁离子，其中 溶液中的镁离子来自冻干镁盐在温度敏感缓冲液的重新复原。
[0024] 在本发明的任意实施例中，多核苷酸的扩增可以在基本等温的条件下进行。
[0025] 在本发明的任意实施例中，多核苷酸在与扩增试剂混合物混合之前不被变性。
[0026] 在本发明的任意实施例中，混合的步骤可以当温度处于约0°C至KTC之间，约 10°C至20°C之间，约20°C至30°C之间进行。优选的混合的步骤在温度处于约20°C至30°C 之间进行。
[0027] 在本发明的任意实施例中，多核苷酸的扩增直到反应混合物的温度处于约30°C至 40°C之间，约40°C至50°C之间，约50°C至60°C之间，约60°C至70°C之间，约70°C至80°C之 间，约80°C至90°C之间，或约90°C至100°C之间才能发生。优选的多核苷酸的扩增直到反 应混合物的温度处于约50°C至60°C之间才能发生。
[0028] 在本发明的任意实施例中，多核苷酸的扩增可以在没有重复循环处于第一温度和 第二温度之间的反应混合物温度时发生。
[0029] 在本发明的任意实施例中，扩增试剂混合物的一种或多种成分可以被提供在适宜 流体装置、盒式或横向流动装置中使用的容器中。
[0030] 在本发明的任意实施例中，在没有额外的试剂加入到混合步骤（a)中形成的反应 混合物，多核苷酸的扩增可以发生。
[0031] 在本发明的任意实施例中，该方法可以进一步包括步骤（C):检测扩增的多核苷 酸。在本方法的进一步的实施例中包括步骤（c)，在没有额外试剂加入在混合步骤（a)中形 成的反应混合物中，扩增的多核苷酸的检测可以进行。
[0032] 在本发明的任意实施例中，至少50 %，至少60 %，至少70 %，至少80 %，至少90 %， 至少95 %，或基本上所有反应混合物中的二价离子都是可溶形式的。在进一步的实施例中， 二价离子被pH敏感螯合剂可逆结合。在进一步的实施例中，二价离子包括游离的二价离 子。在另一个实施例中，二价离子包括结合的和游离的二价离子。
[0033] 在本发明的任意实施例中，在溶解状态的二价离子不能由沉淀物的解离形成。
[0034] 在本发明的任意实施例中，在多核苷酸扩增之前，低于20 %，低于15 %，低于 10 %，低于5 %，低于1 %，或基本上没有二价离子形成沉淀物。
[0035] 在进一步的实施例中，方法包括步骤（C)，在检测扩增的多核苷酸之前，低于 20%，低于15%，低于10%，低于5%，低于1%，或基本上没有二价离子形成沉淀物。
[0036] 在本发明的任意实施例中，反应混合物不包括以沉淀形式被结合的二价离子。
[0037] 在本发明的任意实施例中，多核苷酸不预热，例如在混合或结合步骤（a)之前，温 度就高于30°C，高于40°C，高于50°C，或高于60°C。
[0038] 在本发明的任意实施例中，扩增试剂混合物不预热，例如在混合或结合步骤（a) 之前，温度就高于30°C，高于40°C，高于50°C，或高于60°C。
[0039] 在本发明的任意实施例中，步骤（a)中与多核苷酸混合的扩增试剂混合物的温度 处于约〇°C和10°C之间，约10°C和20°C之间，约20°C和30°C之间。优选的，步骤（a)中与 多核苷酸混合的扩增试剂混合物的温度约为20°C和30°C之间。
[0040] 另一方面，本发明提供的方法包括：(a)使一种多核苷酸和一种扩增试剂混合物 混合或结合（combining)来形成反应混合物，其中扩增试剂混合物包括溶液状态下的可逆 结合的镁离子，温度敏感缓冲液和pH敏感螯合剂；和（b)，从（i)第一温度到（ii)第二温度 的调节，在第一温度下，温度敏感缓冲液的PH为了让pH敏感螯合剂可逆结合溶解的游离镁 离子而成为可控的，那样多核苷酸的扩增被抑制；在第二温度下，温度敏感缓冲液的PH是 可控的来调节反应混合物温度，从而从PH敏感螯合剂中释放结合的镁离子，那样多核苷酸 的扩增能够继续进行，从而启动多核苷酸的扩增。
[0041] 在上述方法的任意实施例中，pH敏感螯合剂可以从下列组合中选择：乙二醇-双 (2-氨基乙酿）四乙酸（ethyleneglycol-bis(2-aminoethylether)tetraacetic acid)， EGTA衍生物，和EDTA衍生物。优选的pH敏感螯合剂是乙二醇-双（2-氨基乙醚）四乙酸。
[0042] 在上述方法的任意实施例中，温度敏感缓冲液可以包括三（羟甲基）氨基甲烷 (tris(hydroxymethyl)aminomethane)〇
[0043] 在上述方法的任意实施例中，处于第二温度的温度敏感缓冲液的pKa值至少低于 第一温度的温度敏感缓冲液的PKa值的0. 4。
[0044] 在上述方法的任意实施例中，温度敏感缓冲液的ApKa值在_0.04°C η 至-0. 015°C η之间。
[0045] 在上述方法的任意实施例中，第一温度为约0°C至10°C之间，约10°C至20°C之间， 约20 °C至30 °C之间。优选的第一温度为约20 °C至30 °C之间。
[0046] 在上述方法的任意实施例中，第二温度是约30°C至40°C之间，约40°C至50°C之 间，约50°C至60°C之间，约60°C至70°C之间，约70°C至80°C之间，约80°C至90°C之间，或 约90°C至100°C之间。优选的第二温度是约50°C至60°C之间。
[0047] 在上述方法的任意实施例中，扩增试剂混合物可以包括一种切口内切酶，一种DNA 或RNA聚合酶，一种重组酶，和/或一种逆转录酶。在特定的实施例中，扩增试剂混合物包 括一种切口内切酶，一种DNA或RNA聚合酶。在其他实施例中，扩增试剂混合物可以包括一 种重组酶和一种DNA或RNA聚合酶。这些实施例可以根据情况所需包括一种逆转录酶。
[0048] 在上述方法的任意实施例中，螯合剂浓度与镁离子浓度的比值约为0. 5至2。
[0049] 在上述方法的任意实施例中，处于第一温度的游离镁离子浓度约为0至10mM。
[0050] 在上述方法的任意实施例中，处于第二温度的游离镁离子浓度约为5mM至50mM。
[0051] 在上述方法的任意实施例中，扩增试剂混合物可以包括一种或多种冻干形式的组 分。在特定的实施例中，扩增试剂混合物包括冻干形式的镁盐。冻干的镁盐可以在缓冲液 中被重新溶解来形成溶解状态的镁离子。在其他实施例中，扩增试剂混合物包括冻干形式