47. 在权利要求45或46的方法中，其中温度敏感缓冲液包括三（羟甲基）氨基甲烷。
48. 在权利要求45-47的任意方法中，其中在第二温度时温度敏感缓冲液的pKa值少于 第一温度时温度敏感缓冲液的pKa值的至少0. 4。
49. 在权利要求45-48的任意方法中，其中温度敏感缓冲液的ApKa值在-0. 04°C 和-0. 015°Ch之间。
50. 在权利要求45-49的任意方法中，其中第一温度在约0°C至10°C之间，约10°C至 20°C之间，或约20°C至30°C之间。
51. 在权利要求45-50的任意方法中，其中第二温度在约30°C至40°C之间，约40°C至 50°C之间，约50°C至60°C之间，约60°C至70°C之间，约70°C至80°C之间，约80°C至90°C之 间，或约90°C至100°C之间。
52. 在权利要求45-51的任意方法中，其中扩增试剂混合物包括一种切口内切酶。
53. 在权利要求45-52的任意方法中，其中扩增试剂混合物包括一种DNA或RNA聚合 酶。
54. 在权利要求45-53的任意方法中，其中扩增试剂混合物包括一种逆转录酶。
55. 在权利要求45-54的任意方法中，其中螯合剂浓度与镁离子浓度的比值约为0. 5至 2之间。
56. 在权利要求45-55的任意方法中，其中第一温度时游离的镁离子浓度为约0至 10mM之间。
57. 在权利要求45-56的任意方法中，其中第二温度时游离的镁离子浓度为约5至 50mM之间。
58. 在权利要求45-57的任意方法中，其中扩增试剂混合物包括一种或多种冻干形式 的组分。
59. 在权利要求45-58的任意方法中，其中扩增试剂混合物包括冻干形式的镁盐。
60. 在权利要求45-59的任意方法中，其中扩增试剂混合物包括一种冻干形式的pH敏 感螯合剂。
61. 在权利要求59的方法中，其中冻干的镁盐被重新溶解在缓冲液中形成溶解状态的 镁呙子。
62. 在权利要求60的方法中，其中冻干的pH敏感螯合剂被重新溶解在缓冲液中。
63. 在权利要求61的方法中，其中溶解状态的镁离子被可逆结合在pH敏感螯合剂上。
64. 在权利要求61或62的方法中，其中缓冲液是一种温度敏感缓冲液。
65. 在权利要求61-64的任意方法中，其中，对于pH敏感螯合剂与溶解状态的游离镁离 子可逆结合，缓冲液的pH是可操控的，。
66. 在权利要求45-65的任意方法中，其中多核苷酸的扩增在基本等温条件下进行。
67. 在权利要求45-66的任意方法中，其中多核苷酸在与扩增试剂混合物结合之前不 被变性。
68. 在权利要求45-67的任意方法中，其中混合步骤发生在温度处于约0°C至10°C之 间，约10°C至20°C之间，或约20°C至30°C之间。
69. 在权利要求45-68的任意方法中，其中，多核苷酸的扩增直到反应混合物的温度为 约30 °C至40 °C之间，约40 °C至50 °C之间，约50 °C至60 °C之间，约60 °C至70 °C之间，约70 °C 至80°C之间，约80°C至90°C之间，或约90°C至100°C之间才发生扩增。
70. 在权利要求45-69的任意方法中，其中在反应混合物的温度没有在第一温度和第 二温度之间重复循环时，多核苷酸的扩增可以进行。
71. 在权利要求45-70的任意方法中，其中扩增试剂混合物的一种或多种组分被提供 在适宜流体装置、盒式或横向流动装置中使用的容器中。
72. 在权利要求45-71的任意方法中，其中，在没有额外的试剂添加到在混合步骤（a) 中形成的反应混合物中时，多核苷酸的扩增可以发生。
73. 在权利要求45-72的任意方法中，进一步包括步骤（c):检测扩增的多核苷酸。
74. 在权利要求73的方法中，其中在没有额外的试剂加入混合步骤（a)中形成的反应 混合物时，扩增的多核苷酸的检测可以进行。
75. 在权利要求45-74的任意方法中，其中至少50 %，至少60 %，至少70 %，至少80 %， 至少90%，至少95%，或基本上反应混合物中的所有二价离子是可溶形式的。
76. 在权利要求75的方法中，其中镁离子被可逆结合到一种pH敏感螯合剂上。
77. 在权利要求75的方法中，其中镁离子包括游离的镁离子。
78. 在权利要求75的方法中，其中镁离子同时包括游离的和被结合的镁离子。
79. 在权利要求45-78的任意方法中，其中可溶形式的镁离子不能来自沉淀的溶解。
80. 在权利要求45-79的任意方法中，其中，在多核苷酸扩增前，少于20%，少于15%， 少于10%，少于5%，少于1%，或基本是没有镁离子形成沉淀。
81. 在权利要求73的方法中，其中在检测扩增的多核苷酸前，少于20%，少于15%，少 于10%，少于5%，少于1%，或基本是没有镁离子形成沉淀。
82. 在权利要求45-81的任意方法中，其中反应混合物不包括被结合在沉淀形式中的 镁呙子。
83. -种组分包括用于核苷酸扩增的一种或多种试剂和依赖pH的溶解状态的可逆结 合的镁离子。
84. 在权利要求83的组分中，进一步包括一种温度敏感缓冲液和一种pH敏感螯合剂。
85. 在权利要求84的组分中，其中温度敏感缓冲液包括三（羟甲基）氨基甲烷。
86. 在权利要求84或85的组分中，其中温度敏感缓冲液的ApKa值在-0.04°C 一1 和-0. 015°Ch之间。
87. 在任何一个权利要求84-86的组分中，其中pH敏感螯合剂是乙二醇-双（2-氨基 乙醚）四乙酸。
88. 在任何一个权利要求83-87的组分中，其中用于核苷酸扩增的一种或多种试剂包 括一种切口内切酶。
89. 在任何一个权利要求83-88的组分中，其中用于核苷酸扩增的一种或多种试剂包 括一种DNA或RNA聚合酶。
90. 在任何一个权利要求83-89的组分中，其中用于核苷酸扩增的一种或多种试剂包 括一种逆转录酶。
91. 在任何一个权利要求83-90的组分中，其中用于核苷酸扩增的一种或多种试剂包 括一种重组酶。
92. 在任何一个权利要求83-91的组分中，其中用于核苷酸扩增的一种或多种试剂包 括一种或多种冻干形式的组分。
93. 在任何一个权利要求83-92的组分中，其中用于核苷酸扩增的一种或多种试剂包 括冻干形式的镁盐。
94. 在任何一个权利要求83-93的组分中，其中用于核苷酸扩增的一种或多种试剂包 括冻干形式的pH敏感螯合剂。
95. 在权利要求93的组分中，其中冻干形式的镁盐被重溶在缓冲液中形成溶解状态的 镁呙子。
96. 在权利要求94的组分中，其中冻干形式的pH敏感螯合剂被重溶在缓冲液中。
97. 在权利要求95或96的组分中，其中缓冲液是温度敏感缓冲液。
98. 在任何一个权利要求83-97的组分中，其中溶解状态的镁离子不能来自沉淀的重 溶。
99. 在任何一个权利要求83-98的组分中，其中该组分不包括以沉淀形式被结合的镁 离子。
100. 在任何一个权利要求83-99的组分中，其中一种或多种组分被提供在适宜于流动 装置、盒式或横向流动装置中使用的容器中。
101. 组分包括用于核苷酸扩增的一种或多种试剂，温度敏感缓冲液，pH敏感螯合剂和 镁盐。
102. 在权利要求101的组分中，其中温度敏感缓冲液包括三（羟甲基）氨基甲烷。
103. 在权利要求101或102的组分中，其中温度敏感缓冲液的ApKa值在-0. 04°C ―1 和-0. 015°Ch之间。
104. 在任何一个权利要求101-103的组分中，其中温度敏感螯合剂是乙二醇-双 (2-氨基乙醚）四乙酸。
105. 在任何一个权利要求101-104的组分中，其中用于核苷酸扩增的一种或多种试剂 包括一种切口内切酶。
106. 在任何一个权利要求101-105的组分中，其中用于核苷酸扩增的一种或多种试剂 包括一种DNA或RNA聚合酶。
107. 在任何一个权利要求101-106的组分中，其中用于核苷酸扩增的一种或多种试剂 包括一种逆转录酶。
108. 在任何一个权利要求101-107的组分中，其中用于核苷酸扩增的一种或多种试剂 包括一种重组酶。
109. 在任何一个权利要求101-108的组分中，其中用于核苷酸扩增的一种或多种试剂 包括一种或多种冻干形式的组分。
110. 在任何一个权利要求101-109的组分中，其中该镁离子为冻干形式的。
111. 在任何一个权利要求101-110的组分中，pH敏感螯合剂为冻干形式的。
112. 在权利要求110的组分中，其中冻干的镁盐被重溶在缓冲液中形成溶解状态的镁 离子。
113. 在权利要求111的组分中，其中冻干的pH敏感螯合剂被重溶在缓冲液中。
114. 在权利要求112或113的组分中，其中缓冲液是一种温度敏感缓冲液。
115. 在权利要求112的组分中，其中溶解状态的镁离子不能来自沉淀的重溶。
116. 在任何一个权利要求101-115的组分中，其中组分不包括以沉淀形式被结合的镁 离子。
117. 在任何一个权利要求101-115的组分中，其中一种或多种组分被提供在适宜于流 动装置、盒式或横向流动装置中使用的容器中。
118. 方法包括 (a) 使酶和试剂混合物混合形成反应混合物，其中反应混合物包括溶解状态的可逆结 合的二价离子，和 (b) )调节反应混合物的pH来释放可逆结合的二价离子。 从而激活酶。
119. 在权利要求118的方法中，其中二价离子被选自下列组合：镁、该、铜、锌、锰、铁、 锦和铅。
120. 在权利要求118或119的方法中，其中试剂混合物包括一种pH敏感螯合剂。
121. 在任何一个权利要求118-120的方法中，其中试剂混合物包括一种温度敏感缓冲 液。
122. 在权利要求121的方法中，其中反应混合物的pH根据温度敏感缓冲液的pH来调 T。
123. 在任何一个权利要求118-122的方法中，其中反应混合物的pH通过改变反应混合 物的温度来调节，从第一温度变为第二温度。
124. 在任何一个权利要求118-123的方法中，其中酶是一种DNA或RNA聚合酶。
125. 在任何一个权利要求118 - 123的方法中，其中酶是一种切口内切酶。
【专利摘要】方法包括使一种多核苷酸与一种扩增试剂混合物混合形成一种反应混合物，其中反应混合物包括在溶解状态下的能可逆结合的二价离子，和调节反应混合物的pH来释放可逆结合的二价离子，从而启动多核苷酸的扩增。
【IPC分类】C07H21-04, C12P19-34, C12Q1-68
【公开号】CN104662159
【申请号】CN201380029231
【发明人】张宏华, 佳露·蒲伟德, 瑞查德·若斯
【申请人】爱奥尼安技术公司
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2013年6月7日
【公告号】CA2876159A1, EP2859111A1, US20130330777, WO2013185081A1