玉米非翻译区域用于植物中转基因表达的用图
【专利说明】玉米非翻译区域用于植物中转基因表达的用途 发明领域
[0001] 本发明一般地涉及基因工程领域，更具体地涉及植物中转基因表达的领域。
[0002] 发明背景
[0003] 重组DNA技术和基因工程已经使得将期望的DNA序列导入植物细胞以便表达感兴 趣的蛋白质常规上成为可能。但是，为了获得产业上可行的转化事件，获得重要作物中稳定 和可预测的表达的理想水平仍然是具有挑战性的。
[0004] 在作物中以期望水平表达异源基因的方法之一包括对控制植物中的表达的调节 机制进行操作。该调节可以是转录调节或转录后调节，可以包括，例如，增强、限制或防止 DNA转录的机制，以及限制或增加 mRNA产生后的寿命的机制。这些调节过程中涉及的DNA 序列可以维护编码基因的蛋白质产生的结构DNA序列的上游、下游、或者甚至内部。
[0005] 为了调节转基因植物中的转录，可以使用多种多样的启动子。启动子可以用来控 制外来基因在转基因植物中的表达，其表达模式与该启动子原始来源的基因的表达模式类 似。一般而言，启动子分为两类："组成型"启动子在大多数组织中大多数时间表达，而"受 调节型"启动子通常仅在特定的组织类型（组织特异性启动子）或仅在发育过程中的特定 时间（时序性启动子）表达。来自组成型启动子的表达通常在整个发育过程中大致处于稳 态的水平。编码具有看家功能的蛋白质的基因通常是由组成型启动子驱动的。玉米中组成 型表达的基因的实例包括肌动蛋白和泛素（ubiquitin) (Ubi)。
[0006] 通过将"增强子"序列置于启动子的上游（5'）可以获得转基因植物中转录的进 一步提高。增强子元件是顺式作用的，可以相对独立于增强子的上游位置和朝向的方式增 加其启动子对其邻近基因的转录水平。人们已经从多种来源，包括病毒、细菌和植物基因， 分离了此类序列。良好表征的增强子序列的一个实例是来自根癌土壤杆菌的章鱼碱合酶 (OCS)，如美国专利号5, 837, 849, 5, 710, 267和5, 573, 932所述。已经证明这种短（40bp) 的序列可以在单子叶和双子叶植物，包括玉米中以显著的水平增加基因表达。已经证明这 种增强子的串联重复可在玉米中增加 GUS基因的表达至8倍。这些增强子序列如何发挥功 能仍然不清楚。有可能的是，增强子结合激活子蛋白，从而易化RNA聚合酶II对TATA框的 结合。W095/14098描述了对ocs增强子和mas (甘露碱合酶）增强子的多种多个组合的测 试，导致GUS基因在转基因烟草愈伤组织中基因表达的数百倍增加。
[0007] 然而，使用特定的启动子，同时有或没有一个或多个增强子，并不一定保证植物中 期望的基因表达水平。除了期望的转录水平之外，其他因素如不恰当的剪接、多聚腺苷酸化 和核输出可能影响mRNA和感兴趣的蛋白质的积累。因此，通过转录后调节机制增加 RNA稳 定性和翻译效率的方法是本领域中需要的。
[0008] 关于转录后调节，已经证明真核mRNA的特定5'和3'非翻译区（UTR)分别在翻译 效率和RNA稳定性方面扮演主要角色。例如，烟草花叶病毒（TMV)和苜蓿花叶病毒（AMV)衣 壳蛋白mRNA的5'和3' UTR已知可增强烟草植物中的基因表达。玉米醇脱氢酶-I (adhl) 基因的5'和3' UTR已知涉及低氧原生质体中的高效翻译。
[0009] 对多种5' UTR前导序列的实验显示5' UTR的不同结构特征可能与翻译效率水 平相关。某些5' UTR已经被发现含有这样的AUG密码子，当40S核糖体亚单位扫描起 始位点的AUG密码子时，这些密码子可能与40S核糖体亚单位相互作用，从而降低翻译 速度（Kozak，Mol.Cell.Biol.7:3438(1987);Kozak，J.Cell Biol.l08,209(1989))。此 外，mRNA上的AUG起始位点两侧的5' UTR核苷酸序列可能对翻译效率有影响。如果两 侧5' UTR的环境不是有利的，40S核糖体亚单位的一部分可能无法识别翻译起始位点， 这样多肽合成的速率会减慢（1(〇231^18丨〇1.〇16111.266，19867-19870(1991) ;?3丨113111·· J.Biochem. 236, 747-771(1996))。5'UTR的二级结构（例如发夹形成）也可能会阻碍 40S核糖体亚单位在其扫描过程中的运动，从而对翻译效率造成不利影响（Sonenberg et al. ,Nature 334:320(1988) ;Kozak, Cell 44:283-292,(1986))。5'UTR 序列的相 对GC含量已经被显示可指示潜在二级结构的稳定性，GC水平越高越不稳定。（Kozak, J. Biol. Chem. 266, 19867-19870(1991)。较长的5' UTR可能展现更多数量的抑制性二级结 构。因此，任何给定的5' UTR的翻译效率高度依赖于它的具体结构，而且已经证明通过优 化前导序列可增加基因表达，这是翻译起始效率提高的直接结果。此外，有人通过加入来 自植物病毒或热激基因的前导序列显著增加了基因表达（Raju et al. ,Plant Science 94:139-149(1993)) 〇
[0010] 除了 5'UTR之外，mRNA的3'UTR(后随）序列也与基因表达有关。3'UTR(又 称聚腺苷酸化元件或腺苷化控制元件）已知能够控制核输出、聚腺苷酸化状态、亚细胞 靶向、和RNA酶对mRNA的翻译和降解的速率。尤其是，3' UTR可能含有一个或多个倒序 重复（inverted repeats)，它们能够折叠成莖环结构，莖环结构不但构成对外切核酸酶 的屏障，还与已知促进RNA稳定性的蛋白质（例如RNA结合蛋白）相互作用（Barkan et al. , A Look Beyond Transcription:Mechanisms Determining mRNA Stability and Translation in Plants, American Society of Plant Physiologists, Rockville, Md. ，pp. 162-213(1998))。然而，3'UTR中发现的某些元件可能是RNA去稳定性的。植物中 出现的此类实例之一是DST元件，它可以在小生长素上升RNA(small auxin up RNAs， SAURs)中发现（Gil et al.，EMBO J. 15, 1678-1686(1996))。某些 3' UTR 中的另一种导致 去稳定的特征是 AUUUA 五聚体的存在（Ohme-Takagi et al. ,Pro. Nat. Acad. Sci. USA 90 11811-11815(1993))〇
[0011] 已经证明3'UTR在数种玉米基因的基因表达中扮演显著的角色。具体 地，已经显示，一种200碱基对的3'序列负责玉米叶肉细胞中核酮糖-1，5-二磷酸 羧化酶基因的小m3亚单位的光诱导的抑制（Viret et al. ,Proc Natl Acad Sci USA. 91 (18) : 8577-81 (1994))。在植物，尤其是玉米中，这种序列不是非常好地保守的。在植 物基因工程中经常使用的一种3'瓜1?源自胭脂碱合酶基因（3'11 〇8)(17&?的&1.，？1&拉 Mol Biol 22(5):731-49(1993))〇
[0012] 在某些植物病毒，如苜蓿花叶病毒（AMV)和烟草花叶病毒（TMV)中，它们高度结构 化的3' UTR对复制是必不可少的，可以折叠成为含有数个高亲和力衣壳蛋白结合位点的茎 环结构的线性排列，或折叠成为被RNA依赖性RNA聚合酶识别的tRNA样位点（Olsthoorn et al.,EMB0 J 1 ； 18 (17) : 4856-64 (1999) ；Zeyenko et al.,1994))〇
[0013] 然而，仍然有需要鉴定其他的5'和3'UTR是否可用于调节转基因植物中重组核酸 的表达，因为并非任一种应用都有最优的UTR序列可供使用。 发明概要
[0014] 提供了用于提高转基因植物和植物组织中重组核酸序列表达的方法、载体和基因 构建体。根据本发明，从编码泛素蛋白的基因的3'非翻译区获得和/或衍生核酸序列，并 将其工程化到载体的选定编码区域的各自部分的侧翼。载体构建体可以通过常规或基因打 靶程序导入植物和/或植物组织，导致选定的编码区域的表达提高。在某些实施方案中，选 定的编码区域是嵌合基因或基因片段，其编码一种或多种已知对转基因植物和/或植物组 织赋予一定水平的杀昆虫活性的蛋白质。
[0015] 在一个方面，提供了一种核酸构建体，其包含至少一个感兴趣的结构基因，所述基 因功能连接于异源启动子和一个或多个控制序列，所述控制序列与选自SEQ ID NO: 1-3、它 们的互补物、或其组合的核酸序列有至少80%的同一性。
[0016] 在一个实施方案中，所述至少一个感兴趣的结构基因包括赋予植物中的非天然表 型的基因。在另一个实施方案中，所述至少一个感兴趣的结构基因包括赋予植物中的昆虫 抗性或除草剂抗性的基因。在一个实施方案中，所述异源启动子不包括病毒启动子。在另 一个实施方案中，所述异源启动子不包括植物启动子。在另一个实施方案中，所述异源启动 子包括病毒启动子。在另一个实施方案中，所述异源启动子包括植物启动子。
[0017] 在一个实施方案中，所述一个或多个控制序列与选自SEQ ID NO: 1-3、它们的互 补物、或其组合的核酸序列有至少85%，90%，95%，98%，或100%的同一性。在一个 进一步的实施方案中，所述一个或多个控制序列选自SEQ ID N0:l-3、它们的互补物、或其 组合的核酸序列。在另一个实施方案中，所述一个或多个控制序列是能够利用选自SEQ ID NO :4-15的寡核苷酸扩增的。
[0018] 在一个实施方案中，所述核酸构建体包括用于土壤杆菌介导转化的双元载体。在 另一个实施方案中，所述核酸构建体被稳定转化到转基因植物中。在一个进一步的实施方 案中，所述植物是单子叶植物。在另一个进一步的实施方案中，所述植物是双子叶植物。在 另一个实施方案中，所述植物不是单子叶植物。在另一个实施方案中，所述植物不是双子叶 植物。在一个实施方案中，所述核酸构建体包含可选择标记。在另一个实施方案中，所述可 选择标记包括芳基氧基链烷酸双加氧酶。在另一个实施方案中，所述芳基氧基链烷酸双加 氧酶是AAD -I或AAD_12。
[0019] 在另一方面，提供一种载体，其包含本文中提供的核酸构建体。在另一个方面，提 供经本文提供的核酸构建体转化的植物或植物细胞。在一个实施方案中，所述植物或植物 细胞包含与所述至少一种感兴趣的基因叠加的其他感兴趣的结构基因。
[0020] 在另一方面，提供一种重组产生肽或蛋白质的方法，所述方法包括将异源启动子 与一个或多个如下所述的控制序列功能连接，所述控制序列与选自SEQ ID NO: 1-3、它们的 互补物、或其组合的核酸序列具有至少80%同一性。在另一方面，提供一种增加植物或植物 细胞中的基因表达的方法，所述方法包括将异源启动子与一个或多个如下所述的控制序列 功能连接，所述控制序列与选自SEQ ID N0:l-3、它们的互补物、或其组合的核酸序列具有 至少80 %同一*性。
[0021] 在所提供的方法的一个实施方案中，所述异源启动子不包括病毒启动子。在另一 个实施方案中，所述异源启动子不包括植物启动子。在另一个实施方案中，所述异源启动子 包括病毒启动子。在另一个实施方案中，所述异源启动子包括植物启动子。在所提供的方 法的一个实施方案中，所述一个或多个控制序列与选自SEQ ID N0:l-3、它们的互补物、或 其组合的核酸序列具有85%，90%，95%，98%或100%同一性。在另一个实施方案中，所 述一个或多个控制序列选自SEQ ID NO: 1-3、它们的互补物、或其组合。在另一个实施方案 中，所述一个或多个控制序列是能够利用选自SEQ ID N0:4-15的寡核苷酸扩增的。
[0022] 在另一方面，提供了选自SEQ ID N0:l-3、它们的互补物、或其组合的至少一个 控制序列用于在植物中表达转基因的用途。在另一方面，提供了能够利用选自SEQ ID N0:4-15的寡核苷酸扩增的一个或多个控制序列用于在植物中表达转基因的用途。
[0023] 附图简要说明
[0024] 图IA显示了本发明的一个示例性控制序列，玉米Ubil 3'UTR(SEQ ID N0