的PH敏感螯合剂。冻干pH敏感螯合剂可以在缓冲液中被重新溶解。根据这些实施例，缓 冲液可以是温度敏感缓冲液。在一些实施例中，溶解的镁离子可逆结合到PH敏感螯合剂。 根据任意上述的实施例，缓冲液的pH对于能可逆结合溶解状态的游离镁离子的pH敏感螯 合剂是可控的。优选的，扩增试剂混合物包括被PH敏感螯合剂可逆结合的溶解状态的镁离 子，其中溶解状态的镁离子产生自于重新溶解在温度敏感缓冲液中的冻干镁盐。
[0052] 在上述方法的任意实施例中，多核苷酸的扩增基本上可以在等温条件下进行。
[0053] 在上述方法的任意实施例中，多核苷酸在与扩增试剂混合物混合前不被变性。
[0054] 在上述方法的任意实施例中，混合步骤在温度处于约0°C至10°C之间，约10°C至 20°C之间，约20°C至30°C之间时进行。优选的混合步骤在温度处于约20°C至30°C之间时 进行。
[0055] 在上述方法的任意实施例中，多核苷酸直到反应混合物的温度处于约30°C至 40°C之间，约40°C至50°C之间，约50°C至60°C之间，约60°C至70°C之间，约70°C至80°C之 间，约80°C至90°C之间，或约90°C至100°C之间才能进行扩增。优选的多核苷酸的扩增直 到反应混合物的温度处于约50°C至60°C之间才进行扩增。
[0056] 在上述方法的任意实施例中，在没有处于第一温度和第二文件之间反应物温度的 重复循环时，多核苷酸的扩增进行。
[0057] 在上述方法的任意实施例中，扩增试剂混合物的一种或多种成分可以被提供在适 宜流体装置、盒式或横向流动装置中使用的容器中。
[0058] 在上述方法的任意实施例中，多核苷酸的扩增可以在没有额外试剂添加到混合步 骤（a)中形成的反应混合物中时进行。
[0059] 在上述方法的任意实施例中，该方法可以进一步包括步骤（C):检测扩增的多核 苷酸。在包括步骤（C)的方法的进一步的实施例中，扩增的多核苷酸的检测可以在没有额 外试剂添加到在结合步骤（a)中行程单反应混合物中发生或进行。
[0060] 在上述方法的任意实施例中，至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少 90 %，至少95 %，或基本上所有反应混合物中的二价离子都是可溶形式的。在进一步的实施 例中，二价离子被pH敏感螯合剂可逆结合。在一个进一步的实施例中，二价离子包括游离 的二价离子。在另一个实施例中，二价离子同时包括结合的和游离的二价离子。
[0061] 在上述方法的任意实施例中，溶解的二价离子不能由沉淀解离形成。
[0062] 在上述方法的任意实施例中，低于20 %，低于15 %，低于10 %，低于5 %，低于1 %， 或基本上没有二价离子在多核苷酸扩增前形成沉淀物。
[0063] 在包含步骤（c)的上述方法的任意实施例中，低于20%，低于15%，低于10%，低 于5 %，低于1 %，或基本上没有二价离子在检测扩增的多核苷酸之前形成沉淀物。
[0064] 在上述方法的任意实施例中，反应混合物不包括以沉淀形式结合的二价离子。
[0065] 另一方面，本发明提供一种组分，其包括用于核苷酸扩增的一种或多种试剂和溶 解状态下的依赖pH的可逆结合的镁离子。
[0066] 在上述组分的任意实施例中，该组分可以进一步包括一种温度敏感缓冲试剂和一 种PH敏感螯合剂。在特定的实施例中，温度敏感缓试剂可以包括三（羟甲基）氨基甲烷。 在另一个特定实施例中，pH敏感螯合剂可以包括乙二醇-双（2-氨基乙醚）四乙酸。优选 的，该组分进一步包括三（羟甲基）氨基甲烷和乙二醇-双（2-氨基乙醚）四乙酸。
[0067] 在上述组分的任意实施例中，温度敏感缓试剂的ApKa值为-0. 04 °C η 和-0. 015°C η之间。
[0068] 在上述组分的任意实施例中，用于核苷酸扩增的一种或多种试剂可以包括一种切 口内切酶，一种DNA或RNA聚合酶，一种重组酶，和/或一种逆转录酶。在特定的实施例中， 一种或多种试剂包括一种切口内切酶和一种DNA或RNA聚合酶。在其他实施例中，一种或 多种试剂包括一种重组酶和一种DNA或RNA聚合酶。这些实施例可以根据情况所需包括一 种逆转录酶。
[0069] 在上述组分的任意实施例中，用于核苷酸扩增的一种或多种试剂包括一种或多种 冻干形式的组分。在特定的实施例中，一种或多种试剂可以包括冻干形式的镁盐。冻干的 镁盐可以在缓冲液中重新溶解来形成溶解状态的镁离子。在其他实施例中，一种或多种试 剂可以包括冻干形式的PH敏感螯合剂。优选的，上述组分包括溶解状态的能可逆结合的pH 依赖的镁离子，其中溶解状态的镁离子由冻干的镁盐在温度敏感缓冲液中重新溶解形成。
[0070] 在上述组分的任意实施例中，溶解的镁离子不能由沉淀的解离形成。
[0071 ] 在上述组分的任意实施例中，组分不包括以沉淀形式结合的镁离子。
[0072] 在上述组分的任意实施例中，一种或多种组分可以被提供在适宜流体装置、盒式 或横向流动装置中使用的容器中。
[0073] 在另一方面，本发明提供一种组分，该组分包括一种或多种用于核苷酸扩增的试 剂、温度敏感缓冲液，PH敏感螯合剂和镁盐。
[0074] 在上述组分的任意实施例中，温度敏感缓冲液可以包括三（羟甲基）氨基甲烷。
[0075] 在上述组分的任意实施例中，温度敏感缓冲液的ApKa值在-0.04 °C η 和-0. 015°C η之间。
[0076] 在上述组分的任意实施例中，pH敏感螯合剂可以包括乙二醇-双（2-氨基乙醚） 四乙酸。
[0077] 优选的，该组分包括三（羟甲基）氨基甲烷和乙二醇-双（2-氨基乙醚）四乙酸。
[0078] 在上述组分的任意实施例中，用于核苷酸扩增的一种或多种试剂可以包括一种切 口内切酶，一种DNA或RNA聚合酶，一种重组酶，和/或一种逆转录酶。在特定的实施例中， 一种或多种试剂包括一种切口内切酶和一种DNA或RNA聚合酶。在其他实施例中，一种或 多种试剂包括一种重组酶和一种DNA或RNA聚合酶。这些实施例可以根据情况所需包括一 种逆转录酶。
[0079] 在上述组分的任意实施例中，一种或多种试剂包括一种或多种冻干形式的组分。 在特定的实施例中，一种或多种试剂可以包括冻干形式的镁盐。冻干的镁盐可以在缓冲液 中重新溶解来形成溶解状态的镁离子。在其他实施例中，一种或多种试剂可以包括冻干形 式的PH敏感螯合剂。冻干的pH敏感螯合剂可以在缓冲液中被重新溶解。根据这些实施例， 缓冲液可以是一种温度敏感缓冲液。优选的，上述组分包括冻干的镁盐，该镁盐在温度敏感 缓冲液中被重新溶解，形成溶解状态的pH依赖可逆结合镁离子。
[0080] 在上述组分的任意实施例中，溶解的镁离子不能由沉淀溶解形成。
[0081] 在上述组分的任意实施例中，该组分不包括以沉淀形式被结合的镁离子。
[0082] 在上述组分的任意实施例中，一种或多种组分可以被提供在适宜流体装置、盒式 或横向流动装置中使用的容器中。
[0083] 另一方面，本发明提供的方法包括：（a)使一种酶和一种试剂混合物混合来形成 反应混合物，其中反应混合物包括溶解状态的能可逆结合的二价离子，和（b)调节反应混 合物的PH来释放可逆结合的二价离子，从而激活酶。
[0084] 在上述方法的任意实施例中，二价离子从下列组合中选择：镁、钙、铜、锌、锰、铁、 锦和铅。
[0085] 在上述方法的任意实施例中，试剂混合物可以包括一种pH敏感螯合剂。
[0086] 在上述方法的任意实施例中，试剂混合物可以包括一种温度敏感缓冲液。
[0087] 在上述方法的任意实施例中，反应混合物的pH值可以根据温度敏感缓冲液的pH 值被调节。
[0088] 在上述方法的任意实施例中，反应混合物的pH值可以通过改变反应混合物的温 度来调节，从第一温度变为第二温度。
[0089] 在上述方法的任意实施例中，酶可以是一种DNA或RNA聚合酶。
[0090] 在上述方法的任意实施例中，该酶可以是一种切口内切酶。
[0091] 本发明的方法可以包括扩增多核苷酸的反应，例如在基本等温条件下或非等温条 件下。例如扩增反应可以包括切口和延伸扩增反应（NEAR)，或重组聚合酶扩增（RPA)。
[0092] 另一方面，本发明的特点是组分（如干燥的组分），这些组分包括切口内切酶（如 N. BstNBI)，DNA聚合酶（如嗜热DNA聚合酶），和pH敏感螯合剂（如EGTA)。在一些实施 例中，这些组分进一步包括温度敏感缓冲液（如Tris)。在实施例中，组分进一步包括逆转 录酶。在一些实施例中，本发明的这些组分或方法可以包括（i)正向模板，包括在3 '端具 有可识别区域的与靶标序列的反义链的3'端互补的核苷酸序列，切口酶结合位点，识别区 域的上游的切口位点，和上述切口位点上游的稳定区域，和/或（ii)反向模板，该反向模板 在3'端具有一个与靶标序列有义链的3 '端互补的可识别位点的核苷酸序列，（如互补的 靶标序列反义链），切口酶结合位点，可识别区域上游的切口位点，和上述切口位点上游的 稳定区域。在一些实施例中，这些组分能进一步包括镁盐或镁离子。
[0093] 在一些实施例中，本发明的这些组分或方法可以包括一种或多种切口酶，例如， 选自下列组合：Nt. BspQI, Nb. BbvCI, Nb. BsmI, Nb. BsrDI, Nb. BtsI, Nt. AlwI, Nt. BbvCI, Nt. BstNBI, Nt. CviPII, Nb. BpulOl, Nt. BpulOI,和 N. BspD6I。在某些实施例中，切口 酶可以 选自由Nt. NBst. NBI, Nb. BsmI,和Nb. BsrDI组成的组合。优选的切口酶是Nt. BstNBI或 N.BspD6I。本领域的这些普通技术人员都知道除了这里特别提到的切口酶，其他各种切口 酶都可以在本发明的方法和组分中使用。
[0094] 在本发明的方法和组分的一些实施例中可以包括模板，该模板可以是寡核苷酸， 其可以与靶标的可识别区域结合，也可以包含可识别区域上游的切口酶结合区域和切口酶 结合区域上游的稳定区域。这个"可识别区域"可以是模板上与靶标序列的核苷酸序列互 补的核苷酸序列。这个靶序列上的可识别区域可以是靶序列上与模板互补，结合的核苷酸 序列。这个"稳定区域"可以是一个核苷酸序列，该序列具有，例如约50% GC含量，被设计 来用来，例如，在切口和/或扩增反应中来稳定分子。
[0095] 另一方面，本发明的特定在于组分（如干燥的组分）包括一种重组酶（如UvsX)， 一种DNA聚合酶，和pH敏感螯合剂（如EGTA)。在一些实施例中，组分进一步包括一种温度 敏感缓冲液（如Tris)。本发明的这些组分或方法可以包括一种或多种（i)单链DNA结合 蛋白（如gp32)，（ii)UvsY，和（iii)拥挤试剂（如聚乙二醇（PEG))。在一些实施例中，这 些组分进一步包括镁盐或镁离子。在一些实施例中优选的本发明的组分和方法包括工程化 的和修饰过的重组酶的同工酶，例如大肠杆菌recA和T4卩莖菌体uvsX，聚合酶包括大肠杆菌 DNA聚合酶I Klenow片段，Bst聚合酶，Phi-29聚合酶，枯草杆菌Pol I (Bsu)，PolV和来自 大肠杆菌和T4 (如gp32蛋白）的单链DNA结合蛋白。
[0096] 标记的探针能与多核苷酸或扩增的多核苷酸产物有效的互补和杂交，这些探针被 用于本发明的任何方面或实施例中。