第一状态时扩增的比值至少高 约100倍。
[0136] 在上述方法任意包含扩增的实施例中，在混合物的温度没有升高到一个温度，在 这个温度下，超过50 %，超过30 %，超过20 %，超过10 %，或超过5 %的存在于混合物中的双 链多核苷酸被全部变性的情况下，至少约50%，至少约75%，至少约90%，至少约95%，或 基本是所有扩增总量可以被执行。例如，第一种方法可以通过扩增被执行，最初在混合物中 存在双链多核苷酸的超过50 %，超过30 %，超过20 %，超过10 %，或超过5 %时没有完全变 性的情况下，至少约50%，至少约75%，至少约90%，至少约95%，或基本上的所有扩增总 数被执行。
[0137] 本发明所公开的所有范围，例如"X和Y之间"是包括端点的。
[0138] 本发明中一个或多个实施例在附图和下列说明中被详细阐述。本发明的其他特 征、目的和优点在本文的描述、附图和权利要求中是显而易见。
【附图说明】
[0139] 图1是包括没有模板（NTC)，100个拷贝的模板（IOOcp)，具有EGTA但没有模板 (NTC+EGTA)，和具有EGTA和100个模板拷贝（100cp+EGTA)的NEAR反应的荧光图。
[0140] 图2是NEAR反应的荧光图，包括没有模板（ntc)的，20个模板拷贝（20cp)，和200 个模板拷贝（200cp)，在所有情况下都具有EGTA。实线是罗红霉素标记的分子信标荧光数 据，虚线是SyBr II荧光数据。
[0141] 详细描述
[0142] 本发明是基于，至少部分基于，发现需要一种二价离子辅助因子的酶的活性可以 通过可逆结合反应混合物中的二价离子来被控制。在典型方法中，反应混合物通过使一种 酶与试剂混合物的混合来制备，其中反应混合物包括溶解状态的可逆结合的二价离子。然 后反应混合物的pH可以被调节来释放可逆结合的二价离子，从而激活酶。
[0143] 本发明也适用于任何涉及到需要二价离子辅因子的酶反应。酶所必需的二价离子 辅助因子包括镁，钙，铜，锌，锰，铁，镉，和铅。
[0144] 一个典型应用就是所谓的"热启动"的反应，其特征在于，直到混合物的温度达到 适当的温度之前，参与反应中所涉及的至少一个组分（如，酶或二价离子的辅助因子）要么 从反应混合物被分开，要么保持在非活动状态。
[0145] 本发明涉及新的"热启动"核苷酸扩增反应，该反应包括一种温度敏感缓冲液和一 种PH敏感螯合剂。在典型方法中，反应混合物在第一温度（如室温）被制备，在该温度下， 对于可逆结合游离的镁离子的PH敏感螯合剂，温度敏感缓冲液的pH为可操控的，这些可逆 结合的游离的镁离子是反应的一种或多种酶组分必须的辅助因子，反应的进程被抑制了。 接着反应混合物的温度被调节到第二温度，在这个温度温度下，敏感缓冲液的pH被操控来 从PH敏感螯合剂中释放结合的二价镁离子，和让反应继续进行。
[0146] 由于本发明，一般技术人员可以根据所用的特定核苷酸扩增方法的属性选择第一 温度，第二温度，温度敏感缓冲液条件和PH敏感螯合剂。当升高到所需的反应温度时，所用 的酶可以来自耐热种类的酶（如Thermus aquaticus)。
[0147] 例如，切口和延伸扩增反应（NEAR)可以在56°C时运作。反应混合物一般在室温制 备，并且包括靶标核苷酸，寡核苷酸，DNA聚合酶，切口内切酶，三（羟甲基）氨基甲烷缓冲液 (pH = 8)，乙二醇双（2-氨基乙醚）四乙酸（EGTA)，一种或多种盐（例如，一个或多个一价 和/或二价镁盐），和dNTP。在这个pH时，EGTA与镁离子结合相对牢固，然后阻止了镁离 子与切口酶和聚合酶结合。一般来说，反应中没有镁离子，酶不能展现酶活力并且反应被有 效暂停。温度增加到56°C时，在该温度下，温度敏感缓冲液的pH值降低到小于pH7. 4。在 这个pH值，EGTA与镁离子的有效结合被降低了，导致镁离子从EGTA-镁复合物中解离。镁 离子是游离的，与切口和聚合酶互作形成全酶，扩增反应继续进行。
[0148] 这里所用的缓冲液或缓冲试剂是一种弱酸或碱，被用来调节溶液的pH。缓冲液包 括那些一般与核苷酸扩增反应兼容的缓冲液，是本领域公知的。很多缓冲液的PH部分依赖 溶液的温度，例如可以预见缓冲溶液的pH将随温度改变。三（羟甲基）氨基甲烷（TRIS) 缓冲液与温度的关系如表1所示。
[0149] 表1. Tris缓冲液温度与pH的关系
[0150]
【主权项】
1. 方法包括： (a) 使一种多核苷酸与一种扩增试剂混合物混合形成一种反应混合物，其中反应混合 物包括在溶解状态下的能可逆结合的二价离子，和 (b) 调节反应混合物的pH来释放可逆结合的二价离子， 从而启动多核苷酸的扩增。
2. 在权利要求1的方法中，其中二价离子选自下列组合：镁、该、铜、锌、锰、铁、镉和铅。
3. 在权利要求1或权利要求2的方法中，其中二价离子是镁。
4. 在任意一个权利要求1-3的方法中，其中扩增试剂混合物包括一种pH敏感螯合剂。
5. 在权利要求4的方法中，其中pH敏感螯合剂被选自下列组合：乙二醇-双（2-氨基 乙醚）四乙酸，EGTA衍生物，和EDTA衍生物。
6. 在任意一个权利要求1-5的方法中，其中扩增试剂混合物包括一种温度敏感缓冲 液。
7. 在权利要求6的方法中，其中温度敏感缓冲液包括三（羟甲基）氨基甲烷。
8. 在权利要求6或7的方法中，其中反应混合物的pH根据温度敏感缓冲液的pH被调 T。
9. 在任意一个权利要求1-8的方法中，其中反应混合物的pH通过改变反应混合物的温 度来调节，反应混合物的温度从第一温度变为第二温度。
10. 在权利要求9的方法中，其中第二温度时温度敏感缓冲液的pKa值低于第一温度时 温度敏感缓冲液的pKa值的至少0. 4。
11. 在任意一个权利要求6-10的方法中，其中温度敏感缓冲液的ApKa值在_0.04°C 和-0. 015°Ch之间。
12. 在权利要求9-11的任意方法中，其中第一温度约为0°C至10°C之间，约为10°C至 20°C之间，或约为20°C至30°C之间。
13. 在权利要求9-12的任意方法中，其中第二温度约为30°C至40°C之间，约为40°C至 50°C之间，约为50°C至60°C之间，约为60°C至70°C之间，约为70°C至80°C之间，约为80°C 至90°C之间，或约为90°C至100°C之间。
14. 在权利要求1-13的任意方法中，其中扩增试剂混合物包括一种切口内切酶。
15. 在权利要求1-14的任意方法中，其中扩增试剂混合物包括一种DNA或RNA聚合酶。
16. 在权利要求1-15的任意方法中，其中扩增试剂混合物包括一种反转录酶。
17. 在权利要求1-16的任意方法中，其中螯合剂浓度与二价离子浓度的比值约为0. 5 至2。
18. 在权利要求9-17的任意方法中，其中第一温度时游离二价离子的浓度约为0至 10mM之间。
19. 在权利要求9-18的任意方法中，其中第二温度时游离二价离子的浓度约为5至 50mM之间。
20. 在权利要求1-19的任意方法中，其中扩增试剂混合物包括一种或多种冻干形式的 组分。
21. 在权利要求20的方法中，其中扩增试剂混合物包括冻干形式的镁盐。
22. 在权利要求20的方法中，其中扩增试剂混合物包括一种冻干形式的pH敏感螯合 剂。
23. 在权利要求21的方法中，其中冻干的镁盐被重溶在缓冲液中来形成溶解状态的镁 离子。
24. 在权利要求22的方法中，其中冻干形式的pH敏感螯合剂被重溶在缓冲液中。
25. 在权利要求23或24的方法中，其中溶解状态的镁离子与pH敏感螯合剂可逆结合。
26. 在权利要求23或24的方法中，其中该缓冲液是温度敏感缓冲液。
27. 在权利要求23-26的任意方法中，其中对于pH敏感螯合剂来可逆结合溶液中的游 离镁离子，缓冲液的pH是可操控的。
28. 在权利要求1-27的任意方法中，其中多核苷酸的扩增在基本等温条件下进行。
29. 在权利要求1-28的任意方法中，其中多核苷酸在与扩增试剂混合物混合前不被变 性。
30. 在权利要求1-29的任意方法中，其中在温度处于约0°C至10°C之间，约10°C至 20 °C之间，或约20 °C至30 °C之间，进行混合步骤。
31. 在权利要求1-30的任意方法中，其中多核苷酸的扩增直到反应混合物的温度处于 约30°C至40°C之间，约40°C至50°C之间，约50°C至60°C之间，约60°C至70°C之间，约70°C 至80°C之间，约80°C至90°C之间，或约90°C至100°C之间时才发生扩增。
32. 在权利要求1-31的任意方法中，其中，在反应混合物处于第一温度和第二温度之 间没有重复循环下，多核苷酸的扩增可以发生。
33. 在权利要求1-32的任意方法中，其中一种或多种扩增试剂混合物的组分被提供在 适宜流体装置，盒式或横向流装置使用的容器中。
34. 在权利要求1-33的任意方法中，其中，在没有额外的试剂添加到混合步骤（a)中形 成的反应混合物中时，多核苷酸的扩增可以发生。
35. 在权利要求1-34的任意方法中，进一步包括步骤（c):检测扩增的多核苷酸。
36. 在权利要求35的方法中，其中，在没有额外的试剂添加到在混合步骤（a)中形成的 反应混合物中时，扩增多核苷酸的检测可以发生。
37. 在权利要求1-36的任意方法中，其中至少50%，至少60%，至少70%，至少80%， 至少90%，至少95%，或基本上反应混合物中的所有二价离子是可溶形式的。
38. 在权利要求37的方法中，其中二价离子可以与一种pH敏感螯合剂可逆结合。
39. 在权利要求37的方法中，其中二价离子包括游离的二价离子。
40. 在权利要求37的方法中，其中二价离子同时包括被结合的和游离的二价离子。
41. 在权利要求1-40的任意方法中，其中可溶状态的二价离子不来自沉淀的溶解。
42. 在权利要求1-41的任意方法中，其中，在多核苷酸扩增之前，少于20%，少于15%， 少于10%，少于5%，少于1%，或基本没有二价离子形成沉淀物。
43. 在权利要求35的方法中，其中，在扩增的多核苷酸检测之前，少于20%，少于15%， 少于10%，少于5%，少于1%，或基本没有二价离子形成沉淀物。
44. 在权利要求1-43的任意方法中，其中，反应混合物不包括以沉淀形式存在的被结 合的二价离子。
45. 方法包括： (a)让多核苷酸与扩增试剂混合物混合来形成一种反应混合物，其中扩增试剂混合物 包括可溶状态的可逆结合的镁离子，温度敏感缓冲液和pH敏感螯合剂；和 (b)调节反应混合物的温度，从 (i) 第一温度，在这个温度中，对于pH敏感螯合剂可逆结合可溶状态的游离镁离子，pH 温度敏感缓冲液是可操控的，那样多核苷酸的扩增被抑制，到 (ii) 第二温度，在该温度下，对于让pH敏感螯合剂释放结合的镁离子，温度敏感缓冲 液的pH是可操控的，那样多核苷酸的扩增继续进行。 从而启动多核苷酸的扩增。
46. 在权利要求45的方法中，其中pH敏感螯合剂选自下列组合：乙二醇-双（2-氨基 乙醚）四乙酸，EGTA衍生物，和EDTA衍生物。