>[0097] 另一方面，横向流动装置被提供，其包含多核苷酸扩增试剂例如DNA或RNA聚合 酶，切口酶，重组酶，和/或用于核苷酸扩增的逆转录酶，和一种或多种温度敏感PH缓冲液， 一种或多种pH敏感螯合剂，和一种或多种二价离子例如镁离子和/或一种或多种二价金属 盐，例如镁盐或硫酸镁。在一些实施例中，一种或多种这些组分可以被以冻干形式被提供。
[0098] 另一方面，微流体装置被被提供，其包含多核苷酸扩增试剂例如DNA或RNA聚合 酶，切口酶，重组酶，和/或用于核苷酸扩增的逆转录酶，和一种或多种温度敏感PH缓冲液， 一种或多种pH敏感螯合剂，和一种或多种二价离子，例如镁离子，和/或一种或多种二价金 属盐，例如镁盐或硫酸镁。在一些实施例中，一种或多种这些组分可以被冻干提供。
[0099] 另一方面，一个装置（cartridge)被提供，其包含多核苷酸扩增试剂，例如用于核 苷酸扩增的DNA或RNA聚合酶，切口酶，重组酶，和/或逆转录酶，并且一种或多种温度敏感 pH缓冲液，一种或多种pH敏感螯合剂，和一种或多种二价离子，例如镁离子，和/或一种或 多种二价金属盐，例如镁盐或硫酸镁。在一些实施例中一种或多种这样的组分可以是冻干 的。
[0100]另一方面，样品制备和转运装置中包含多核苷酸扩增试剂例如用于核苷酸扩增的 DNA或RNA聚合酶，切口酶，重组酶，和/或逆转录酶，并且一种或多种温度敏感pH缓冲液， 一种或多种pH敏感螯合剂，和一种或多种二价离子，例如镁离子，和/或一种或多种二价金 属盐，例如镁盐或硫酸镁。在一些实施例中一种或多种这样的组分可以是冻干的。
[0101] 这里描述的方法和组分可以用于核苷酸扩增反应，不需要预热反应来达到反应温 度。不预热，他们也可以用来增加核苷酸扩增反应的选择性、敏感性和重复性。
[0102] 另一方面，本发明提供了一种方法，该方法包括：形成一种混合物，其包括：（a)包 含革G标的样品和（b)包含结合试剂的试剂，被该结合试剂结合的离子，缓冲液，和包含至少 一种组分的扩增试剂，当离子被结合试剂结合时，该组分在离子存在情况下具有第一种活 性，当离子从结合试剂中释放时，在离子存在的情况下该组分具有第二种活性；并且，通过 对混合物的温度从第一温度到第二温度的增加，来从结合试剂一定数量离子的释放足够对 至少一种扩增试剂组分的活性从第一种活性变为第二种活性的改变。
[0103] 上述方法的任意实施例中，该样品可以是一种样品，如液体，例如来自人类或动物 的血液、血浆、血清、痰、鼻拭物、阴道拭物、唾液、分泌粘液、或脊髓液。
[0104] 上述方法的任意实施例中，靶标可以是多核苷酸，如来自病原物，如细菌或病毒的 多核苷酸。靶标，如样品中存在的，可以是双链多核苷酸或单链多核苷酸。
[0105] 上述方法的任意实施例中，靶标是双链多核苷酸，该方法可以不用从多核苷酸的 温度升高到让双链多核苷酸完全变性时另一个温度时执行，该另一个温度够约使50 %，约 35%，约25%，约15%，约7. 5%，约5%，约2. 5%的双链多核苷酸完全变性。例如，在温度 没有升高超过基本上所有双链多核苷酸的退火温度时，该方法也可以被执行。
[0106] 上述方法的任意实施例中，当至少一种组分的活性在第二种状态时，扩增试剂可 以扩增靶标。扩增步骤可以进行，在混合物形成步骤之后，混合物没有跟参与扩增和/或检 测革巴标的额外试剂结合的情况下。
[0107] 上述方法的任意实施例中，该方法可以进一步包括检测靶标存在和/或存在的数 量。检测可以在扩增靶标的数量至少约IO 6倍后进行，如至少约10 7倍，至少约10 8倍，至少 约IO9倍，至少约10 1(1倍，至少约10 11倍，至少约10 12倍之后进行。
[0108] 在上述包括扩增方法的任意实施例中，当温度在约第二温度时，如在第二温度的 约15°C内，在第二温度的约10°C内，在第二温度的约7. 5°C内，在第二温度的约5°C内，在第 二温度的约2. 5°C内，或基本在第二温度内，扩增总量的至少约50%，至少约75%，至少约 90 %，至少约95 %或基本上所有的扩增可以被执行。
[0109] 在上述方法的任意实施例中，形成混合物的步骤可以包括使样品与试剂接触，其 中当试剂被样品接触时，试剂是冻干形式的。
[0110] 在上述方法的任意实施例中包括检测，检测的步骤可以在样品与试剂接触后少于 约25分钟，少于约20分钟，少于约17. 5分钟时进行。在上述方法的任意实施例中，形成 混合物的步骤可以在混合物的温度没有增加超过混合物附近环境温度的约30°C，超过约 25°C，超过约20°C，超过约15°C，超过约10°C，超过约5°C时进行。例如形成混合物的步骤 可以在试剂处于约试剂附近的环境温度时进行。
[0111] 在上述方法的任意实施例中，在混合物形成步骤前的瞬间没有大幅增加试剂的温 度到超过试剂温度时，形成混合物的步骤可以进行。混合物形成之前瞬间的试剂温度可以 约等于试剂的环境温度。
[0112] 在上述方法的任意实施例中，该方法可以在不使混合物与（a)具有参与靶标的扩 增和/或检测的额外的试剂接触，或与（b)在混合物温度已经被增加到高于第一温度后的 不同情况下的任何额外试剂接触下进行。
[0113] 在上述方法的任意实施例中，在没有添加（a)具有参与靶标的扩增和/或检测的 额外试剂的情况下，或（b)在释放离子的步骤后的不同情况下的任何额外试剂下，该方法 可以被进行。
[0114] 在上述方法的任意实施例中，在没有使至少一种组分从第二种状态回复到第一种 状态时该方法可以被执行。
[0115] 在上述方法的任意实施例中，在没有使超过约25%，超过约15%，超过约10%，超 过约5%的被释放的离子同时重新在结合的情况下，该方法可以被执行。
[0116] 在上述方法的任意实施例中，样品和/或靶标不与一种含有一定数量离子的不溶 沉淀物接触，这些一定数量的离子足够使扩增试剂中的至少一种组分的活性从第一活性变 为第二活性，这个方法也可以进行。
[0117] 在上述方法的任意实施例中，样品和/或靶标不与一种含有一定数量离子的不溶 沉淀物接触，这些一定数量的离子足够使扩增试剂中的至少一种组分的活性从第一活性变 为第二活性，接着沉淀溶解，这个方法也可以进行。
[0118] 在上述方法的任意实施例中，从混合物中释放的超过约25%，超过约15%，超过 约10%，超过约5%，超过约2. 5%的离子数量的没有被沉淀时，该方法可以被进行。
[0119] 在上述方法的任意实施例中，不使一定数量的离子沉淀从而足够改变扩增试剂中 至少一种组分的活性从第二活性变为第一活性下，该发明的方法可以执行。
[0120] 在上述方法的任意实施例中，第一温度可以是混合物附近的环境温度。
[0121] 在上述方法的任意实施例中，没有使混合物的温度升高到大于80°C的温度，到大 于70°C的温度，到大于65°C的温度，或到大于60°C的温度时，第一种方法可以被执行。
[0122] 在上述方法的任意实施例中，第一温度可以低于约40 °C，低于约35 °C，低于约 30°C，或低于约27. 5°C。
[0123] 在上述方法的任意实施例中，第二温度可以是至少约40°C，至少约45°C，至少约 50°C，或至少约55°C。
[0124] 在上述方法的任意实施例中，第二温度可以低于约75°C，低于约67. 5°C，低于约 62. 5°C，或低于约60°C，或约56. 5°C或更少。
[0125] 在包括检测的上述方法的任意实施例中，当温度处于约第二温度时，如在第二温 度的约15°C内，在第二温度的约10°C内，在第二温度的约7. 5°C内，在第二温度的约5°C内， 在第二温度的约2. 5°C内，或基本上相同的温度，该检测可以被执行。
[0126] 在上述方法的任意实施例中，混合物温度没有在第一和第二温度间循环时，该方 法可以被执行。
[0127] 在上述方法的任意实施例中，混合物的温度没有在更低的温度和第二温度之间循 环时，该方法可以被执行，在该较低温度时混合物中存在的双链多核苷酸基本上被退火，在 第二温度时混合物中存在的双链多核苷酸基本上被变性。
[0128] 在上述方法的任意实施例中，（混合物）的形成和混合步骤可以在壳体内的流体 网络中进行。壳体可以是便携式的，如手持式。壳体可以是单独使用的，包含储藏试剂的壳 体，第一种方法包括导入样品进入壳体的流体网络。壳体可以包括一个内部电源例如电池 和一个由电池供应的加热器，并且足够增加混合物的温度到第二温度。
[0129] 在上述方法的任意实施例中，试剂可以在形成混合物前被冻干。
[0130] 在上述方法的任意实施例中，结合试剂可以是pH敏感结合试剂，并且缓冲液可以 是一种温度敏感缓冲液，其中，使混合物从第一温度增加到第二温度的增加改变缓冲液的 缓冲作用，那样混合物的pH从第一 pH变为第二pH，不同的pH，以及其中，在第二pH时，结 合试剂释放足够数量的离子。
[0131] 在上述方法的任意实施例中，至少一种组分可以是一种酶例如DNA聚合酶，RNA聚 合酶，切口内切酶，或重组酶。例如这些酶可以是切口酶，例如Nt. BstNBI或N. BspD6I。
[0132] 在上述方法的任意实施例中，结合试剂可以是一种螯合剂，例如乙二醇双（2-氨 基乙醚）四乙酸，EGTA衍生物，和EDTA衍生物。在上述方法的任意实施例中，离子可以是 镁、钙、铜、锌、锰、铁、镉和铅。在上述方法的任意实施例中，缓冲液可以是三（羟甲基）氨基 甲烷。在任意上述方法的实施例中，这些扩增试剂可以包括一定数量的试剂足够通过NEAR 来扩增靶标。例如，螯合剂可以是乙二醇双（2-氨基乙醚）四乙酸，离子可以是镁，缓冲液 可以是三（羟甲基）氨基甲烧，至少一种组分可以是DNA聚合酶，RNA聚合酶，Nt. BstNBI或 N. BspD6I，并且扩增试剂可以包括足够通过NEAR来扩增靶标的一定数量的试剂。
[0133] 在上述方法的任意实施例中，在已被释放一定数量离子存在的情况下，至少一种 组分的活性比一定数量的离子被结合试剂结合时至少高约10倍，在已被释放一定离子存 在的情况下，至少一种组分的活性比一定数量的离子被结合试剂结合时至少高约20倍，在 已被释放一定离子存在的情况下，至少一种组分的活性比一定数量的离子被结合试剂结合 时至少高约50倍，在已被释放一定离子存在的情况下，至少一种组分的活性比一定数量的 离子被结合试剂结合时至少高约100倍。这种活性可以针对靶标的扩增。
[0134] 在靶标被扩增的上述方法的任意实施例中，存在已释放离子的情况下，扩增的比 值可以比在如果离子数量被结合试剂结合的情况下时至少高约10倍，存在已释放离子的 情况下，扩增的比值可以比在如果离子数量被结合试剂结合的情况下至少高约20倍，在存 在已释放离子的情况下，扩增的比值可以比在如果离子数量被结合试剂结合的情况下至少 高约50倍，或在存在已释放离子的情况下，扩增的比值可以比在如果离子数量被结合试剂 结合的情况下至少高约100倍。
[0135] 在靶标被扩增的上述方法的任意实施例中，至少一种组分处于第二状态时扩增的 比值比相比于第一组分在第一状态时至少高约10倍，在至少一种组分处于第二状态时的 扩增比值相比于最初组分在第一状态时扩增的比值至少高约20倍，在至少一种组分处于 第二状态时的扩增比值相比于最初组分在第一状态时扩增的比值至少高约50倍，或在至 少一种组分处于第二状态时的扩增比值相比于最初组分在