制备含有编码在其反馈抑制中减弱或者消除的酶的基因的载体的方法及其用于制备氨基 ...的制作方法
【专利说明】制备含有编码在其反馈抑制中减弱或者消除的酶的基因的 载体的方法及其用于制备氨基酸和核苷酸的用途
[0001] 本发明涉及一种制备含有编码在其反馈抑制中减弱或者消除的酶的基因的载体 的方法及其用于制备氨基酸和核苷酸的用途。
[0002] 氨基酸使用在人类医学、制药工业、食品工业和尤其是动物饲料中。氨基酸已知通 过发酵的方式从棒状杆菌的细菌菌株，特别是谷氨酸棒状杆菌，以及从肠杆菌菌株，特别是 大肠埃希氏杆菌中来制备。由于其巨大的重要性而不断地要改善制备的工艺。制备工艺的 改良本身设计发酵技术上的措施实施，如搅拌和氧气供给，或者培养基的营养组成，如发酵 过程中的糖浓度或者产物形状的后处理，通过例如离子交换层析法又或者微生物的内在工 作性能。
[0003] 突变、选择和突变体选择的方法被采用来提高这些微生物的工作性能。通过该方 式可以获得菌株，其耐受抗代谢物或者对于调节性重要的代谢物是营养缺陷型的，并生产 氨基酸。同样采用了重组DNA技术来完善在L-氨基酸生产用的菌株，在此过程中扩增单个 氨基酸生物合成基因，并研究对氨基酸生产的影响。
[0004] 氨基酸的合成在微生物中通过合成路线完成，此路线称为氨基酸生物合成路线或 者氨基酸合成路线或者也通称为合成路线。这些合成路线由单个步骤组成，在每个步骤中 从前体中合成氨基酸。这些前体可在中心代谢中供使用。例如有丙酮酸、α-酮戊二酸、草 酰乙酸、戊糖磷酸、乙酰辅酶Α、赤藓糖磷酸、磷酸烯醇丙酮酸或磷酸甘油酸。此外，由前体 通过所述合成路线合成氨基酸需要NADPH2、NH4+和还原的四氢叶酸。在棒状杆菌的细菌和 肠杆菌中由前体通过所述合成路线合成氨基酸是本领域技术人员已知的。这适用于氨基酸 L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苏 氨酸、L-异亮氨酸、L-组氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、脯氨酸、甘氨酸、L-精氨酸、L-色氨 酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸和L-半胱氨酸。氨基酸合成在大肠埃希氏杆菌和谷 氨酸棒状杆菌中被很好地研究。
[0005] 合成路线由一系列酶催化的反应组成，此类酶催化的反应受到严格地控制。特别 严格的控制通过反馈抗性酶进行。在野生型菌株中，严格的控制机理防止代谢产物如氨基 酸超越本身需求的生产及其在培养基中的释放。因此，从生产者的观点看，过量生产有机化 学的化合物的菌株的构建需要克服这些代谢控制。这些反馈抗性酶优选合成路线的起始反 应或者合成路线的分支点。在此，通常通过合成路线的最终产物进行控制，这些最终产物即 氨基酸L-丙氨酸、L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、 L-苏氨酸、L-异亮氨酸、L-组氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、脯氨酸、甘氨酸、L-精氨酸、 L-色氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸和L-半胱氨酸。
[0006] 也可以用中间体进行控制，如0-乙酰丝氨酸、0-乙酰高丝氨酸、0-琥珀酰丝氨酸、 〇-琥珀酰高丝氨酸或腺苷蛋氨酸。控制如下进行：在上述氨基酸或者中间体的浓度增高时 合成路线的各种酶或者合成路线的反馈抗性酶被抑制。
[0007] 在表1中列举了在现有技术中用于合成路线的酶和编码其的基因的实例，该酶在 细胞中的形成通过反馈控制。此外，也给出了 EC编号，其就关键反应的机理的底物和产物 方面表征了每个反应。进一步给出了对大肠埃希氏杆菌和谷氨酸棒状杆菌野生型的控制的 反馈抗性酶的序列访问编号。这些基因的核苷酸序列和编码的多肽序列存放在公共数据库 中。例如，谷氨酸棒状杆菌在国立生物技术信息中心（NCBI)的国家医学图书馆（Bethesda， MD, USA)数据库内，访问编号NC_003450. 2和BX927148. 1至BX927157. 1。这些基因的 核苷酸序列和大肠杆埃希氏杆菌的编码多肽序列由Blattner等人描述（Science 277 : 1453-1462 (1997))并存入国立生物技术信息中心（NCBI)的国家医学图书馆（Bethesda， MD, USA)数据库内，访问编号：NC_000913.2。也可通过海德堡UniProtKB/Swiss-Prot欧 洲分子生物学实验室数据库访问。
[0008] 表1 :反馈抑制的酶的实例、表征其的酶分类号和编码其的基因、以及示例性的大 肠埃希氏杆菌和谷氨酸棒状杆菌的基因访问编号
【主权项】
1. 制备含有编码在其反馈抑制中减弱或者消除的酶的基因的载体的方法，其中 -将编码反馈抑制的酶的基因在体外突变， -在接下来的步骤中连接入载体， -将载体分别在接下来的步骤中转化入含有代谢物传感器的微生物，该代谢物传感器 在代谢物浓度升高时引起荧光蛋白的合成， -随后选择具有提高的荧光的微生物， -和从具有提高或最高的荧光的微生物中分离所述载体，该载体含有编码在其反馈抑 制中减弱或消除的酶的基因。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于， 所述突变通过不定向突变来实现。
3. 根据权利要求1或者2所述的方法，其特征在于， 使用质粒、插入元件、转座子和/或噬菌体作为将编码反馈抑制的酶的基因所连接入 的载体。
4. 根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于， 使用的代谢物传感器是选自pSenLys、pSenArg、pSenSer、pSenOAS、 pJCl-lrp-brnF-eyfp 的至少一种成分。
5. 根据权利要求1至4任一项所述的方法，其特征在于， 使用的编码反馈抑制的酶的基因是源自酵母或者细菌的基因。
6. 根据权利要求1至5任一项所述的方法，其特征在于， 使用的编码反馈抑制的酶的基因是2-异丙基苹果酸合成酶、乙酰羟基酸合成酶、乙酰 谷氨酸合成酶、邻氨基苯甲酸合成酶、天冬酰胺合成酶、天冬氨酸转氨甲酰酶、天冬氨酸激 酶、ATP-磷酸核糖基转移酶、氨甲酰磷酸合成酶、分支酸变位酶I、分支酸变位酶II、半胱氨 酸合成酶、D-3-磷酸甘油酸脱氢酶、3-脱氧-D-阿糖基庚糖酮酸-7-磷酸合成酶、二氢吡啶 二羧酸合成酶、谷氨酸脱氢酶、谷氨酸合成酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸激酶、高半胱氨酸转 甲基酶、高丝氨酸〇-乙酰转移酶、高丝氨酸〇-琥珀酰转移酶、高丝氨酸脱氢酶、蛋氨酸合成 酶、磷酸核糖焦磷酸合成酶、预苯酸脱氢酶I、预苯酸脱氢酶II、吡咯啉-5-甲酸还原酶、核 糖1，5-双磷酸激酶、丝氨酸乙酰基(琥珀酰)转移酶、苏氨酸解氨酶或者酪氨酸氨基转移酶。
7. 根据权利要求1至6任一项所述的方法，其特征在于， 选择具有最高荧光的微生物。
8. 根据权利要求1至7任一项所述的方法，其特征在于， 将所述载体转化入生产用微生物，该载体含有编码在其反馈抑制中减弱或者消除的酶 的基因和在选择之后从具有提商或最商的突光的微生物中分尚出来。
9. 根据权利要求1至7任一项所述的方法，其特征在于， 将编码在反馈抑制中减弱或者消除的酶的基因连接入已经用于生产所希望的产物并 且导致生产率额外提高的载体，和将该载体转化入生产用菌株。
10. 根据权利要求1至7任一项所述的方法，其特征在于， 将编码在反馈抑制中减弱或者消除的酶的基因引入到生产用菌株的染色体。
11. 根据权利要求1至10任一项所述的方法，其特征在于， 将编码在其反馈抑制中减弱或者消除的酶的基因或含有该基因的载体所转化入的微 生物是细菌或者酵母。
12. 根据权利要求1至11任一项得到的载体或者基因用于生产氨基酸或者核苷酸的用 途。
13. 根据权利要求12所述的用途，其特征在于， 制备的氨基酸是选自L-缬氨酸、L-亮氨酸、L-天冬酰胺、L-赖氨酸、L-蛋氨酸、L-苏 氨酸、L-异亮氨酸、L-组氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、脯氨酸、L-精氨酸、L-色氨酸、L-酪 氨酸、L-苯丙氨酸、L-丝氨酸和L-半胱氨酸的至少一种成分。
14. 根据权利要求12所述的用途，其特征在于， 制备的核苷酸是选自乳清苷-5' _磷酸、5-磷酸核糖二磷酸或者肌苷-5' -磷酸的至少 一种成分。
【专利摘要】本发明涉及一种制备含有编码在其反馈抑制中减弱或者消除的酶的基因的载体的方法及其用于制备氨基酸和核苷酸的用途。根据本发明，将编码反馈抑制的酶的基因在体外突变，-在接下来的步骤中连接入载体，-将载体分别在接下来的步骤中转化入含有代谢物传感器的微生物，该代谢物传感器在代谢物浓度升高时引起荧光蛋白的合成，-随后选择具有提高或最高的荧光的微生物，-和从具有提高或最高的荧光的微生物中分离所述载体，该载体含有编码在其反馈抑制中减弱或消除的酶的基因。
【IPC分类】C12N15-10, C12Q1-68, C12P13-00
【公开号】CN104662169
【申请号】CN201380044415
【发明人】G.申德齐洛茨, S.宾德, L.埃格林, M.博特
【申请人】于利奇研究中心有限公司
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2013年7月23日
【公告号】DE102012016716A1, EP2888372A1, WO2014029376A1