专利名称：衍生自多能干细胞的肝细胞谱系细胞的制作方法
技术领域：
本发明一般涉及胚胎细胞和肝细胞的细胞生物学的领域。更具体的，本发明涉及人多能干细胞在特定培养条件下朝肝细胞谱系的细胞的定向分化。
相关申请的引用本申请要求美国临时专利申请60/200,095，2000年4月27日提交；和美国实用新型申请09/718,308，2000年11月20日提交的优先权。为了在美国的执行，在此完整地引入优选权申请以供参考。
背景技术：
肝脏疾病在全世界影响着数以百万计的人。暴发性肝脏衰竭是肝功能迅速和灾难性停止的临床术语，通常导致在几小时内死亡。肝脏疾病的其它形式，例如慢性肝炎和肝硬化，涉及肝功能的隐伏和进行性的衰竭，具有生理上健康和长期预后的可怕效果。在美国，每年估计有300,000肝病例住院和30,000例死亡，而可供移植的捐献肝脏只有4,500个。
健康的肝脏具有显著的自我再生的能力—但是当该能力受损时，后果是可怕的。现代医学的一个重要挑战是寻找一条补充再生的天然途径，从而恢复病人的肝功能的方法。
进行了一些早期研究以鉴定小动物模型中的肝脏祖细胞。Ageili等(Histochem，J.29205，1997)，Brill等(Dig.Dis.Sci.44364，1999)和Reld等(美国专利5,576,207)提出了早肝脏祖细胞在胚胎和新生大鼠肝脏中扩增的条件。Michalopouloe等(Hepatology 2990，1999)报道了一种在生物学基质中培养大鼠肝细胞和非实质细胞的系统。Block等(J.Cell Biol.1321133，1996)发现了在合成培养基中，由生长因子组合诱导的肝细胞原代培养物的增殖、克隆生长和特定分化的条件。一段时间来已知大鼠肝细胞是从能分化成成熟肝细胞或胆表皮细胞的前体(有时称为“肝母细胞”或“卵形细胞”)衍生出来的(L.E.Rogler，Am.J.Pathol.160591，1997；M.Alison，Current Opin.Cell Biol.10710，1998；Lazaro等，Cancer Res.58514，1998；Germaln等，Cancer Res.484908，1983)。
遗憾的是，未鉴定出重建治疗用的人肝细胞的现成来源。欧洲专利申请EP 953633 A1提出了一种细胞培养方法和用于产生显然来自人肝脏组织的增殖和分化的人肝脏细胞的培养基。在大多数人手中，在培养物中复制人肝细胞的能力是令人失望的。作为补救，提出了通过用SV40病毒的大T抗原转染使肝细胞无限增殖(美国专利5,869,243)。
许多近来的发现产生希望干细胞成为各种细胞类型和组织的来源，用于替换那些在疾病、感染或先天异常的过程中受损的细胞。各种类型的推定的干细胞随着其分裂而分化，成熟为进行特定组织，例如心脏、肝脏或大脑的独特功能的细胞。
特别重要的进展是从胚胎组织分离出两类人多能干细胞。据信多能细胞能在体内分化成大多数细胞类型(R.A.Pedersen，Scientif.Am.280(4)68，1999)。在小鼠中进行了胚胎干细胞的早期工作(Robertson综述Math.Cell Biol.75173，1997；和Pederson，Reprod.Fertil.Dev.6543，1994)。然而证明猴和人的多能细胞脆弱得多，而且对小鼠胚胎细胞的相同培养条件没有反应。仅在最近发现能体外获得和培养的原代胚胎细胞。
Thomson等(美国专利5,843,780；Proc.Natl.Acad.Sci.USA 927844，1995)首先成功地从灵长类培养胚胎干细胞。它们然后衍生出来自人胚泡的人胚胎干细胞(hES)细胞系(Science 282114，1998)。Gerahart和同事从胎儿性腺组织衍生出入胚胎精细胞(hEG)(Shamblott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9513726，1998和国际专利申请WO 98/43679)。hES和hEG细胞都具有长期寻求的人多能干细胞(hPS)特征；它们能在体外持续增殖而不分化，维持正常的核型，维持能分化产生所有成熟细胞类型的能力。
多能干细胞在培养物或畸胎瘤中的自发分化产生具有不同表型混合的细胞群，代表不同的细胞谱系的谱。在许多用途中，理想的是分化的细胞具有更均一的性质—在它们表达表型和能产生子代的类型方面。
因此，需要从灵长类尤其是从人的多能胚胎细胞中产生更均一化的细胞群的技术。
发明简述本发明提供了一种有效产生从多能细胞分化肝母细胞谱系细胞的灵长类细胞的系统。获得的这些细胞的培养物与未分化的细胞和传送到其它组织类型的细胞相比，相对富含肝细胞的典型特征。
本发明的一个实施例是一种从分化的灵长类多能干细胞(pPS)获得的细胞群，其形式是该群中显著比例的细胞具有肝细胞谱系的细胞的特征。在说明书后文中列出了所需的特征。细胞可以显示任何或所有下列α1-抗胰蛋白酶或白蛋白的抗体可检测表达；不存在α-胎蛋白的抗体可检测表达；以反向PCR扩增可检测的水平表达无唾液酸糖蛋白受体；糖原储藏的证据；细胞色素p450或葡萄糖-5-磷酸酶活性的证据；和肝细胞的形态特征。优选的细胞群在该群中较大比例的细胞中具有多种这些肝细胞特征。应理解细胞可在分化期间和随后的操纵中复制形成子代。这些子代在所有未明确排除的情况下也属于本发明的范围内。
通过使来自人胚泡的培养物获得的胚胎干细胞(hES)得到示范性细胞。通过在含有干细胞分化剂，例如正丁酸或其它文献中描述的分化剂的生长环境中培养pPS细胞产生分化的细胞。可直接将分化剂加到含或不含饲养细胞的未分化pPS细胞培养物中。另外，使pPS细胞分化成混合的细胞群(例如通过形成胚状体或通过培养物过度生长)，在混合群中加入分化剂。出现较少均一的群，其中有相当比例的细胞具有所需的表型。在一些情况下，培养方法还包括肝细胞成熟因子，例如文献中举例的那些，它们包括二甲基亚砜(DMSO)，FGF、EGF和肝细胞生长因子，以及糖皮质激素样地塞米松。
本发明的另一个实施例是一种分化的细胞，具有肝细胞谱系的细胞的特征，它是从本发明的分化的细胞群收集的或是从该群收集的细胞的子代。例子是一种分化的细胞，它是通过提供一种在基本无饲养细胞的生长环境中的人多能干细胞(hPS)产生的；在含有肝细胞分化剂的培养基中，在产生富含具有肝细胞特征的细胞的细胞群的条件下，培养该hPS细胞；随后从富集的细胞群中收集分化的细胞。
本发明的另一个实施例是一种处理人多能干细胞(hPS)，以获得能在体外培养物中维持的分化的细胞的方法，该方法是提供一种hPS细胞的培养物，在含有肝细胞分化剂的培养基中的基质上，允许分化的细胞富集的条件下培养细胞。用于该方法的有益技术和试剂在下文中公开。在本发明中还体现的是一种根据本发明的方法产生的分化的细胞，特别是那些具有肝细胞谱系特征的细胞。
本发明的另一个实施例是一种筛选或调节肝细胞毒性的化合物的方法，包括使本发明的分化的细胞接触，并检测得到的细胞中任何表型或代谢变化。本发明的另一个实施例是使一种液体解毒，例如血液的方法，包括在允许细胞去除或改变液体中的毒素的条件下，本发明的分化的细胞与液体接触。在这方面，公开内容中所述的分化的细胞可用作肝脏支持装置的一部分，或治疗性施用以在体内重建肝细胞功能。
本发明的这些和其它实施例根据下面的描述将变得明白。
附1是相差光学显微照片(4X、10X、20X)的半色调复制。右侧来自人多能胚胎肝干细胞(hES)的胚状体在肝细胞分化剂正丁酸盐中培养2天。得到的细胞显示均一的形态。左侧，在仅含培养基的血清(PBS)中培养的胚状体细胞。细胞的不均一小块显示许多不同细胞类型的形态。
图2是相差光学显微照片(上两栏10X、其它栏20X)的半色调复制。这些是与正丁酸盐培养6天的分化的细胞。细胞明显具有成熟肝细胞的特征。在视野中的细胞具有双核并且是多边形的，表达通过免疫染色或反向PCR检测到的成熟肝细胞的标记。
图3是半色调复制，显示一些细胞特异性标记(右侧)的免疫组织化学染色的结果，与同一视野中细胞核的位置(二苯酰亚胺染色，左侧)比较。图3A(40X)显示成年人肝细胞的结果；图3B(20X)显示用正丁酸盐培养6天的分化的hES细胞结果。两个培养物都显示高比例的对白蛋白、α1-抗胰蛋白酶和CD18(三个肝细胞谱系特征性标记)染色阳性的细胞，和α-胎蛋白(较不成熟细胞的标记)阴性。
图4是用高碘酸Schiff染色细胞检测糖原存在的半色调复制(10X和40X)。与约80％胎肝细胞(中部)和成纤维细胞系基本无(底部)相比，约60％的丁酸盐处理的细胞(顶部)显示糖原储藏的证据。
图5是相差光学显微照片(10X，40X)的半色调复制，显示在示范性分化和成熟过程中不同时间的细胞。A列显示在含有5mM正丁酸钠的SR培养基中培养4天后的细胞。培养物中80％以上的细胞直径大，含有大核和颗粒状胞质。5天后，细胞被转移到特制的肝细胞培养基(HCM)中。B和C列显示在HCM中培养2天或4天后的状态。多核化多边形细胞是常见的。用这些条件，衍生自ES的细胞类似新鲜分离的人成年肝细胞(D列)和胎儿肝细胞(E列)。
图6是柱状图，显示细胞色素P450酶1A1和1A2(CYP1A1/2)的活性。用5μm甲基胆蒽(methylchloranthrene，MC)培养诱导酶，然后用乙氧试卤灵(ethoxyresorufin)测定。在衍生自ES细胞的H1细胞系和衍生自H9品系的的两个肝细胞谱系中检测CYPlA1/2活性。活性的水平超过在两个新鲜分离的人成年肝细胞(HH)制备物中观察到的水平。未分化的H1和H9细胞和BJ胚胎成纤维细胞中的活性可忽略不计。
发明详述本发明提供了一种从灵长类来源的多能干细胞制备肝细胞谱系的分化细胞的系统。
已发现当多能干细胞在肝细胞分化剂存在下培养时，衍生出一群细胞，它们是具有显著高比例的具有培养的肝细胞表型特征的细胞。可任选的，该效果可通过再在肝细胞成熟因子存在下培养细胞而增强。由于多能干细胞可在培养物中增殖一年或更长(超过300次群体倍增)，本公开中描述的发明提供了几乎无限的肝细胞样细胞来源，适合各种开发和治疗的目的。
图2显示已通过与表型肝细胞分化剂正丁酸盐一起培养分化的细胞的相差光学显微照片。细胞显示相同的肝细胞特征，包括多边形，显示白蛋白，α1-抗胰蛋白酶(AAT)和无唾液酸糖蛋白受体的特征性表型标记，而缺少α-胎蛋白。细胞已在含有丁酸盐的培养基中维持了1-3周。
鉴于组蛋白去乙酰酶抑制剂类的丁酸盐和曲古抑菌素A已用于分化各式各样的细胞类型的事实，该发现是惊人的。由因及果，预测丁酸盐将驱动多能干细胞群分化成各种不同的群体，例如不用饲养细胞或在视黄酸存在下培养胚胎干细胞得到的结果是合理的。与该预测相反，获得了显著均一的肝细胞谱系的群体。
这代表了在人多能干细胞群体分化中的一个重要的新范例。就我们所了解，还没有公开报道关于从任何类型的胚胎干细胞获得这种相同的肝细胞品谱系的群体。
Gladhaug等(Cancer Res.486580，1988)，Engelmann等(In vitro Cell.Dev.Biol.2386，1987)，Staecker等(J.Physiol.135367，1988；Arch.Biochem.Biophys.261291，1988；和Biochem.Biophys.Res.commun.14778，1987)研究了丁酸盐对原代肝细胞培养物中的DNA合成和标记表达的作用。Salto等(Int.J.Cancer 48291，1991)和Yoon等(Int.J.Artif.Organs 22769，1999)研究了丁酸盐对人肝细胞系的作用。Pack等(Exp.Cell Res.204198，1993)和Germain等(Cancer Res.46368，1988)研究了丁酸盐对大鼠卵形细胞(肝细胞前体)的作用。Niki等(Hepatology 29858，1999；和欧洲专利申请EP 9837742 A1)研究了曲古抑菌素A对原代培养物中大鼠肝脏星状细胞的作用。Blouin等(Exp.Cell Res.2122，1995)研究了丁酸盐对胚胎大鼠肝脏上皮细胞(对肝细胞和胆上皮的双向潜能性)的作用。Coleman等(J.Cell.Physiol.161463，1994)研究了丁酸盐对培养的大鼠肝脏上皮细胞前体的作用。L.E.Rogler(Am.J.Pathol.150591，1997)报道了用DMSO或丁酸钠处理小鼠肝母细胞系诱导迅速的肝细胞分化。Watkins等(J.Dairy Res.66559，1999)报道了丁酸还能诱导人肝脏肿瘤细胞的凋亡。所有这些研究涉及成熟肝细胞、转化的肝脏细胞或定型的肝细胞前体细胞。
已显示丁酸盐对各种其它细胞类型在培养物和体内都具有分化和调节作用。Kosugi等(Leukemia 131316，1999)和Tamagawa(Biosci.Biotechnol.Biochem.521483，1998)报道组蛋白去乙酰酶抑制剂是急性髓样白血病细胞中分化的强诱导剂。Davis等(Biochem J.346，第二部分455，2000)和Rivero等(Biochem.Biophys.Res.Commun.248664，1998)讨论了丁酸盐在成红细胞分化中的作用。Perrine等(Am.J.Pediatr.Hematol.Oncol.1567，1994)和Perrine等(N.Engl.J.Med.32881，1993)提出了丁酸盐衍生物作为在β-珠蛋白障碍中刺激胎珠蛋白产生的药物。Tal等(Hematol.Oncol.14181，1996)分析了嗜曙红粒细胞的丁酸盐分化的作用。
美国专利5,763,255报道了诱导上皮细胞分化的方法，其中在干燥的天然纤维胶原细胞培养物基质上的未分化的细胞中加入5mM丁酸。Yamads等(Biosci.Biotech.Biochem.551261，1992)研究了丁酸盐对三种成纤维细胞和两种上皮细胞系的作用。Jeng等(J.Periodontal.701435，1999)研究了丁酸盐和丙酸盐对培养的齿龈成纤维细胞的作用。Devereux等(Cancer Res.596087，1999)报道了用曲古抑菌素A处理人成纤维细胞系诱导细胞表达端粒酶反转录酶。Yabushita等(Oncol.Res.5173，1993)研究了丁酸盐、DMSO和二丁酰基cAMP对卵巢腺癌细胞的作用。Graham等(J.Cellular Physiol.13663，1988)报道了丁酸钠诱导乳腺癌细胞系的分化。Kamitani(Arch.Biochem.Biophys.36845，1999)，Slavoshian等(Gut 46507，2000)和Reynolds等(Cancer Lett.1153，1998)研究了丁酸钠和曲古抑菌素A对人肠上皮细胞和结肠癌细胞的增殖和分化的作用。McBain等(Biochem.Pharmacol.531367，1997)报道了腺癌细胞系中的凋亡可以通过丁酸盐和其它组蛋白去乙酰酶抑制剂诱导。
Rocchi等(Anticancer Res.181099，1998)和Mateul等(Brain Res.843112，1999)报道了丁酸盐类似物在人成神经细胞瘤细胞中对增殖、分化和诱导儿茶酚胺合成的作用。Gillenwater等(Head Neck 2247，2000)研究了丁酸钠对鳞状癌细胞系的作用。Buommino等(J.mol.Endocrinol.)研究了丁酸盐对精囊上皮细胞的作用。Sun等(Lipids 32273，1997)研究了神经胶质瘤细胞的丁酸盐诱导的分化。Wang等(Exp.Cell.Res.19827，1992)研究了正丁酸盐对正常人角质形成细胞分化的作用。Porez等(J.Surg.Res.781，1998)报道了丁酸盐上调Kupffer细胞的PGE2生产和调节免疫功能.Schultz等(J.Exp.Zool.(Mol.Dev.Evol.)286276，1999)发现用组蛋白去乙酰酶抑制剂处理2-细胞胚胎重新调整了一些基因的表达.Chen等(Proc.Natl.Acad.Sci.945796，1997和PCT申请WO97/47307)报道了用组蛋白去乙酰酶抑制剂重新激活病毒转导的基因。Simon等(Regul.Pept.70143，1997)研究了丁酸盐对诱导胰岛细胞分化的作用，导致胰岛素生产的增加。
由于丁酸盐和相关的化合物促进大量的不同细胞类型的分化，人们会预料到处理衍生自多能胚胎细胞的混合细胞群将导致该群中的每一个细胞沿着已确定的路线分化-仅得到更成熟的混合细胞群。不能预计到丁酸盐处理将得到相同的细胞群-或这些细胞将变成何种组织类型。
本发明涉及该惊人的发现，即用丁酸盐(或另一种肝细胞分化因子，下文详述)培养胚胎多能细胞，产生具有显著高比例的肝细胞表型特征的细胞的细胞群。
用分化因子培养多能细胞的常见结果是80％以上的细胞在开始的24小时内从培养物中丢失。培养几天后出现的是主要具有肝细胞谱系特征的细胞群，例如多边形双核表型，α1-抗胰蛋白酶和白蛋白，和代谢上重要的酶活性的表达，例如细胞色素P450酶1A1和1A2。不受本发明实施的限制，假定丁酸盐和其它分化因子帮助诱导细胞变为肝细胞谱系，或优选促进肝细胞谱系的细胞存活，或具有这两种作用的组合。
下面进一步描述该培养系统如何用于从灵长类来源的多能胚胎干细胞产生肝细胞谱系细胞。描述了肝细胞分化剂(举例说明但不限于正丁酸盐)和促进肝细胞谱系细胞在培养物中产生的其它培养系统的特征。
由于多能胚胎干细胞可基本上无限生长，该系统提供了肝细胞样细胞在研究、药物开发和肝脏疾病的治疗中的无限的来源。
定义可使用术语“肝细胞谱系”细胞、“肝胚样细胞”和“肝胚胎样细胞”，指本发明的分化的细胞，它们是用所述方法分化多能细胞获得的。分化的细胞至少具有一种已知肝细胞前体细胞、肝母细胞和肝细胞的各种有区别的表型特征，如在本公开下文中的那样。通过使用这些术语，对于细胞表型、细胞标记、细胞功能或增殖能力不暗示特定的限制，除非有明确的需要。
“肝细胞前体细胞”或“肝细胞干细胞”是一种细胞，它能够在合适的环境条件下增殖并进一步分化肝母细胞。这些细胞偶尔具有能产生其它类型的子代，例如卵形细胞，胆管上皮细胞或其它肝细胞前体细胞的能力。
“肝细胞分化剂”和“肝细胞成熟因子”是在本公开内容中使用的两个具有不同意义的术语，代表可用于制备和维持本发明的分化细胞的化合物的集合。下面的章节中进一步描述和举例说明了这些试剂。术语不意味着暗示特定的模式或作用的时间，也不涉及这些限制。“肝细胞增殖因子”是一种促进肝细胞和/或肝细胞前体细胞增殖的生物或合成的化合物(肽、寡糖等)。
原型“灵长类多能干细胞”(pPS细胞)是在受精后的任何时间衍生自前胚胎、胚胎或胎儿组织的多能细胞，并且具有在正确条件下产生多种不同细胞类型的子代的能力。如本公开的目的所限定的，根据标准的本领域已接受的试验，例如在合适的宿主中形成畸胎瘤的能力，pPS细胞能产生作为全部三种胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的衍生物的子代。
pPS细胞的非限制性例子是人胚胎干细胞(hES)细胞，如Thomson等，Science2821145，1998；其它灵长类的胚胎干细胞，例如Thomson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 927844，1995所述的Rhesus干细胞；和人胚胎生殖细胞(hEG细胞)，Shamblott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9513726，1998所述。该术语也描述了其它类型的非恶性多能细胞。特别是，包括完全多能(能产生全部三种胚层的衍生物的子代)的任何灵长类的细胞，不论它们是否衍生自胚胎组织、胎儿组织或其它来源。
当显示能将其与胚胎或成年人来源的分化细胞清楚地区别开的形态时，pPS细胞培养物是“基本未分化的”。pPS细胞通常具有高的核/胞质比，显著的核，和很难辨别的细胞接头形成紧密的集落，容易被本领域技术人员识别。未分化细胞的集落可以被周围的分化的细胞包围。另外，在适当的条件下培养时，基本未分化的集落将继续存在，且未分化的细胞在培养细胞传代后占增殖细胞的很大比例。含有任何比例的具有这些条件的未分化pPS的细胞群可用于本发明。被描述成基本未分化的细胞培养物通常含至少约20％、40％、60％、80％未分化的pPS，按照提高的优选的次序。
“饲养细胞(feeder cell)”或“饲养细胞(feeders)”是术语，用于描述与第二类型的细胞共同培养的一种类型的细胞，以提供第二种类型的细胞可维持，且可能增殖的环境。饲养细胞可任选自与其支持的细胞不同的物种。例如，可用小鼠胚胎成纤维细胞(来自原代培养物或端粒化品系)或人成纤维细胞样或间充质细胞(例如可分化并选自hES细胞的)支持的一些pPS细胞。通常(但不一定)，通过辐射或用抗有丝分裂剂，例如丝裂霉素C处理灭活饲养细胞，以防止其生长超过它们支持的细胞。
如果细胞在新的培养环境中已传代且未加入新鲜的饲养细胞，pPS细胞群被称为是“基本无”饲养细胞。认识到如果先前用含有饲养细胞的培养物作为pPS来源用于传代，将有一些饲养细胞在传代中存活下来。例如，hES细胞通常在9.6cm2孔中，在接近汇合的约375,000个初次辐照过的胚胎成纤维细胞上培养。在下一次传代时，或许150,000个饲养细胞仍然存活，分裂并与hES一起传代，后者增殖到约1-1.5×106的数量。在1∶6分裂后，hES细胞通常继续增殖，但成纤维细胞不生长，仅一小部分在培养约6天结束时存活。该培养物“基本无”饲养细胞，组合物含有少于约5％饲养细胞，更优选少于1％、0.2％饲养细胞的组合物。
“生长环境”是一种感兴趣的细胞将体外增殖的环境。环境特征包括细胞培养的培养基、温度、O2和CO2的分压和如果存在支持结构(例如固体表面上的底物)。
“营养培养基”是用于培养细胞的含有促进增殖的营养物的培养基。营养培养基可含有任何下列合适的组合等渗盐水、缓冲液、氨基酸、抗生素、血清或血清替换物、和外源加入的因子。
“条件培养基”是通过在培养基中培养第一群细胞，然后收集培养基制备的。条件培养基(和细胞分泌到培养基中的任何东西)然后可以用于支持第二群细胞的生长。
用于该公开的术语“抗体”指多克隆和单克隆抗体。术语的范围有意不仅包含完整的免疫球蛋白分子，还包括免疫球蛋白分子的片段和衍生物(例如单链Fv构建物、二价抗体和融合构建物)，如本领域已知的技术制备的，并维持所需的抗体结合特异性。
“限制性发育谱系细胞”是衍生自胚胎组织的细胞，通常是通过pPS细胞的分化衍生的细胞。这些细胞能增殖和分化成几种不同的细胞类型，但是其子代的表型范围有限。例子包括造血细胞，它是血细胞型的多能细胞；神经前体，它可产生神经胶质细胞前体，发展成少突胶质细胞；神经元限制细胞，它发展成各种类型的神经元；和肝细胞前体，它对于肝细胞和有时其它类型的肝脏细胞，例如胆管上皮是多能的。
一般技术为了进一步详细描述本发明实践中使用的一般技术，实施人可引用细胞生物学、组织培养和胚胎学中的标准教科书和综述。包括《Teratocarcinoma & EmbryonicStem CellA Practical Approach》(E.J.Robertson编，IRL Press Ltd，1987)；《Guide to Techniques in Mouse Development》(P.M.Wasserman等编，AcademicPress 1993)；《Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro》(M.V.Wiles，Meth.Enzymol.225900，1993)；《Properties and uses of Embryonic Sten CellsProspects for Application to Huamn Biology and Gene Therapy》(P.D.Rathjen等，1993)。与肝细胞谱系的细胞有关的一般信息可在《Live Stem Cells》中找到(S.Seil & Z.Ilic，R.G.Landes Co.，1997)，Stem Cell Biology(L.M.Reid，Curr.Opinion Cell Biol.2121，1990)，和Liver Stem Cells(J.W.Grisham，pp232-282于(Stem Cells)，Academic Press，1997)。在药物研究中使用肝细胞样细胞《In Vitro Methods in Pharmaceutical Research》(Academic Press，1987)中有所描述。
分子遗传学和基因工程中的方法一般在《分子生物学实验室手册》(《Molecular CloningA Laboratory Mannual》)，第二版(Sambrook等，1989)；《0ligonucleotide Synthesis》(M.J.Gait编，1984)；《Animal Cell Culture》(R.I.Freshney编，1987)；《the series Methods in Enzymology》(Academic Press，Inc.，)；《Gens Transfer Vectors for Mammalian Cells》(J.M.Miller&M.P.Calos编，1987)；《Current Protocols in Molecular Biology》and《Short protocolsin Molecular Biology》，第三版(F.M.Ausubel等编，1987 & 1995)；和《RecombinantDNA Methodology II》(R.Wu编，Academic Press，1995)中有所描述。本公开中引用的试剂、克隆载体和基因操纵的试剂盒购自供货商例如BioRad、Stratagene、Invitrogen、ClonTech和Sigma Chemical Co.等。
用于产生，纯化和修饰抗体的一般技术，和包括免疫组织化学的免疫测定的设计和执行，读者可参见Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir & C.C.Blackwell编)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等编，1991)；和Methods of Immunological Analysis(R.Masseyeff，W.H.albert和N.A.Staines编，WeinheimVCH Verlags GmbH，1993)。
培养基和饲养细胞分离和繁殖pPS细胞的培养基具有几种不同配方，只要获得的细胞具有所需的特征，可以进一步繁殖。合适的来源如下Dulbecco的改良Eagles培养基(DMEM)，Gibco #11965-092；剔除Dulbecco的改良Eagles培养基(KO DMEM)，Gibco#10829-018；200mM L-谷氨酰胺，Gibco#15039-027；非必需氨基酸溶液，Gibco11140-050；β-巯基乙醇，Sigma#M7522；人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，Gibco #13256-029。示范性含血清的ES培养基是用60％ DMEM(通常是KO DMEM)、20％未热灭活的限定性胎牛血清(FBS)、1％非必需氨基酸、1mM L-谷氨酰胺和0.1mMβ-巯基乙醇制备的。无血清的ES培养基是用60％KO DMEM、20％血清替代物、0.1mM非必需氨基酸、1mM L-谷氨酰胺和0.1mM β-巯基乙醇制备的。不是所有的血清替代物都可以用；一种有效的血清替代物是Gibco #10828-028。对于增殖多能干细胞中无血清培养基的信息出版在国际专利出版物WO97/47734(Pedersen，U.California)和WO 98/30679(Price等，LifeTechnologies)。过滤培养基，储藏在4℃不超过2周。在使用前，加入最终浓度为4ng/ml的人bFGF(Bodnar等，Geron Corporation，国际出版物WO99/20741)。
pPS细胞通常在一层以各种方式，例如产生促进pPS存活或增殖，或抑制分化的可溶性因子支持pPS细胞的饲养细胞上培养。饲养细胞通常是成纤维细胞类型的细胞，通常衍生自胚胎或胎儿组织。饲养成纤维细胞的常用来源是小鼠胚胎。饲养细胞铺板至接近汇合，辐射防止增殖，用于支持pPS细胞培养。
在饲养细胞上培养pPS细胞的一个例子中，从远系繁殖的CF1小鼠(获自SASCO)或其它合适品系获得小鼠胚胎成纤维细胞(mEF)。用70％乙醇擦拭妊娠13天的小鼠腹部，将蜕膜移到磷酸缓冲盐水(PBS)中。收集胚胎；除去胎盘、膜和软组织；用PBS洗涤尸体两次。然后将其转移到新鲜的含2ml胰蛋白酶/EDTA的10厘米培养皿中，精细切碎。37℃培育5分钟后，用含有10％FBS的5ml DMEM灭活胰蛋白酶，将混合物转移到15ml锥形管中，并分离。使碎片沉淀2分钟，上清液占终体积10ml，铺在10厘米组织培养板或T75烧瓶中。烧瓶静置培养24小时，然后替换培养基。当烧瓶汇合(约2-3天)，细胞1∶2分到新烧瓶中。
饲养细胞在含有90％DMEM(Gibco#11965-092)、10％FBS(Hyclone#30071-03)和2mM谷氨酰胺的mEF培养基中繁殖。mEF在T150烧瓶(Corning#430825)中繁殖，用胰蛋白酶每隔1天将细胞一分为二，保持细胞亚汇合，当需要时任选冷冻。为了制备饲养细胞层，用一定剂量辐照细胞来抑制增殖，但允许合成重要的支持hES细胞的因子(约4000拉德γ-辐射)。通过用37℃培育过夜的1ml0.5％明胶/孔铺6孔培养板(例如Falcon#304)，每孔铺375,000个辐射过的mEF。铺板后5小时-1周使用饲养细胞层。用新鲜hES培养基在接种pPS细胞前替换培养基。
灵长类多能干细胞(pPS)的制备可从灵长类物种成员的成纤维细胞分离胚胎干细胞(Thomson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 927844，1995)。可使用Thomson等(美国专利5,843,780；Science2821145，1998；Curr.Top.Dev.Biol.38133ff.1998)描述的技术从人成纤维细胞制备人胚胎干细胞(hES)。
为了获得人成纤维细胞，可用体内预植入胚胎或体外受精(IVF)的胚胎，或单细胞的人胚胎可以扩张到胚泡阶段(Bongso等，Hum Reprod 4706，1989)。简单地说，人胚胎在G1.2和G2.2培养基中培养到胚泡阶段(Gardner等，Fertil.Steril.6984，1998)。发育的胚泡可选择用于ES细胞的分离。通过简单接触链霉蛋白酶(Sigma)从胚泡除去透明带。用免疫手术分离内细胞团，其中胚泡接触1∶50稀释的家兔抗人脾细胞抗血清30分钟，然后用DMEM洗涤3次，每次5分钟，接触1∶5稀释的豚鼠补体(Gibco)3分钟(见Solter等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA725099，1975)。再用DMEM洗涤2次后，从完整的内细胞团通过温和吸取除去裂解的滋养外胚层细胞，将ICM铺在mEF饲养细胞层上。
9-15天后，内细胞团衍生的长出物通过接触无钙和镁的磷酸缓冲盐水(PBS)和1mM EDTA，通过接触分散酶或胰蛋白酶；或通过用微量滴管机械解离成团；然后重新铺在新鲜培养基中的mEF上。解离的细胞重新铺在新鲜ES培养基中的mEF饲养细胞层上，并观察集落形成。显示未分化形态的集落分别是通过微量滴管、机械分解离成团，和重新铺板选择的。ES-样形态的特征是密集的集落具有高的核/胞质比和显著的核仁。
人胚胎生殖细胞(hEG)可以从存在于最后一次月经后的8-11周的人胎儿材料的原生殖细胞制备。合适的制备方法如Shamblott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9513726，1998和国际专利申请WO 98/43679中所述。
简单地说，用等渗缓冲液漂洗生殖嵴，然后置于0.1mL 0.05％胰蛋白酶/0.53mMEDTA钠溶液(BRL)中，切成＜1mm3的块。然后用100微升移液管尖吸取组织，进一步分解细胞。37℃保温约5分钟，然后加入约3.5mL EG生长培养基。EG生长培养基是DMEM、4500mg/L D-葡萄糖、2200mg/L mM碳酸氢钠；15％ES合格的胎牛血清(BRL)；2mM谷氨酰胺(BRL)；1mM丙酮酸钠(BRL)；1000-2000U/ml人重组白血病抑制因子(LIF，Genzyme)；1-2ng/ml人重组碱性成纤维细胞生长因子(bFGF，Genzyme)；和10μM弗司扣林(在10％DMSO中)。
预先用在无LIF、bFGF或弗司扣林的改良EG生长培养基中培养3天亚汇合的饲养细胞层制备96孔组织培养板，然后用5000拉德γ-辐射灭活。合适的饲养细胞是STO细胞(ATCC登录号CRL 1503)。在各孔中加入约0.2ml原生殖细胞(PGC)悬液。在EG生长培养基中7-10天后进行第一次传代，将各孔转移到24孔培养皿的一个孔中，该孔先前用辐射过的STO小鼠成纤维细胞制备。
未分化的pPS细胞具有特征性形态特点，具有高的核/质比，显著的核仁，和很难辨别的细胞接头形成紧密的集落。需要获得具有“正常核型”的细胞，意味着细胞是整倍体，其中所有人染色体是存在的，没有明显的改变。该特征在任何随后衍生和增殖的分化细胞中也是理想的。
可用免疫组织化学或流式细胞术计数，使用SSEA1、SSEA-3和SSEA-4国立儿童健康和人类发育研究所发育研究杂交瘤库(Development Studies HybridomaBank，National Institute of Child Health and Human Development，BethesdaMD)和TRA-1-60和TRA-1-81(Andrews等，in E.J.Robertson编，Teratocarcinomasand Embryonic Stem Cells.IRL Press，207-246，1987)的抗体鉴定特征性胚胎抗原。SSEA-1标记通常在hES细胞中很少或不存在，但存在于hEG细胞中。细胞体外分化通常导致SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60和TRA-1-81的丧失，及SSEA-1的表达提高。pPS细胞的特征还有碱性磷酸酶活性的存在，它可以通过用Vector Red作为底物(Vector Laboratories，Burlingame CA)显色固定的细胞未检测，并用罗丹明滤膜系统检测产物的红色荧光。
可通过在8-12周龄的雄性SCID小鼠的后腿肌肉中注射约0.5-10×108个细胞，确定胚胎干细胞的多能性。得到的肿瘤可在8-16周发展时固定在4％聚甲醛中，石蜡包埋后组织学检测。显示所有三个胚层的组织，例如软骨、平滑肌或横纹肌(中胚层)；具有毛囊的复层鳞状上皮、具有心室、中间物或套层的神经管(外胚层)；和纤毛柱状上皮和通过吸收性肠细胞排列的绒毛或分泌粘液的杯状细胞(内胚层)的畸胎瘤产生。
pPS细胞的增殖胚胎干细胞可在营养培养基的饲养细胞层上培养。常规每1-2周通过简单胰蛋白酶消化，接触Dulbecco’s PBS(不含钙或镁，含有2mM EDTA)，接触分散酶或IV型胶原酶(1mg/ml；Gibco)或用微量移液管选择单集落分开ES细胞。约50-100个细胞的簇大小是最佳的。另外，在与蛋白酶培育后，刮下培养物，分解离成小簇，并以1∶3-1∶30的分散比重新接种到新鲜饲养细胞上。
胚胎干细胞在饲养细胞上培养，每天更换生长培养基，直到出现形态与EG细胞一致的细胞，通常是7-30天，1-4次传代。细胞在几个月的培养中维持其多能性。
国际专利申请WO 99/20741描述了在不存在饲养细胞的条件下，在含有营养培养基的胞外基质上培养多能干细胞的方法和材料。合适的是来自许多来源的裂解的成纤维细胞或分离的基质成分制备的成纤维细胞基质。营养培养基可含有丙酮酸钠、核苷酸和一种或多种内源加入的生长因子，例如bFGF，还可以通过与成纤维细胞一起培养调理。
在不存在饲养细胞的情况下，适合pPS增殖的基质包括胞外基质成分，例如Matrigel(Becton Dickenson)或层粘连蛋白。Matrigel是在室温胶凝形成重建的基底膜的Engelbreth-Holm-Swarm肿瘤细胞的细胞外基质的可溶性制剂。为了避免存在于膜中的生长因子(例如TGF-1、TGF和PDGF)的影响，可使用减少生长因子的Matrigel。可通过制备所有成分的人工混合物，省去依次测定效果的成分来鉴定基质的关键成分。胞外基质成分的其它混合物也是合适的。例子包括胶原、纤连蛋白、蛋白聚糖、ontactin、硫酸乙酰肝素等的各种组合。
然后将多能细胞以合适的分布涂布在底物上，在促进细胞生存、繁殖和维持所需特征的培养基上有在。所有这些特征是由于仔细留意接种分布获得的。分布的一个特征是铺板密度。发现至少约15,000个细胞cm-2的铺板密度促进生存和限制分化。通常使用约90,000-170,000cm-2之间的铺板密度。
另一种特征是细胞的分散。小鼠干细胞的繁殖涉及细胞分散在单细胞悬液中(Robinson，Meth.Mol.Biol.75173，1997，177页)。相反，在不存在饲养细胞的情况下pPS细胞的传代获得了制备小簇的pPS细胞的益处。通常，在细胞变得完全分散前停止酶消化(即用胶原酶IV约5分钟)。然后用移液管温和地刮平板，用移液管研碎细胞，直到它们作为粘着细胞的簇悬浮，大小约10-2000个细胞。然后直接将簇铺到底物上，而不进一步分散。
还发现在无新鲜的饲养细胞的情况下，pPS细胞可以受益于在营养培养基中培养。培养基通常含有提高细胞存活的常见成分，包括等渗缓冲液，必需矿物质和血清或某种血清替代品。还有利的是经过调理的培养基，供给一些饲养细胞提供的元素。可通过在无血清培养基，例如在加了20％血清替代品和4ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的血清替代培养基(如KO DMEM)中以5×105细胞/9.6cm2孔的密度培养辐照过的原代小鼠胚胎成纤维细胞(或其它合适的细胞制备物)制备条件培养基。在37℃1天后收集培养物上清液，通常补充有益于pPS细胞生长的其它生长因子。对于hES，通常使用bFGF等生长因子。对于hEG，培养基可补充bFGF等生长因子，gp130的诱导物，例如LIF或(制瘤素-M)和可能提高cAMP水平的因子，例如各种类型的pPS细胞可受益于培养基中的其它因子。
用这些技术中的几种技术增殖的细胞通常在许多个月的多次传代中维持基本不分化。认识到在某些传代期间，集落边缘周围的一些细胞可能分化(特别是当作为单细胞重新铺板时，或当使其形成大簇时)。然而，培养物通常在培养期内重建具有特征性形态的较大比例的未分化细胞。可任选的，增殖的细胞将具有不超过约20-40小时的倍增时间。
分化pPS细胞的材料和方法可在肝细胞分化剂存在下培养pPS细胞制备本发明的分化细胞。可任选的，还可在肝细胞成熟因子存在下(与分化剂培养的同时或依次)培养细胞。得到的细胞具有肝细胞谱系的表型特征，如下节所述。
在本发明的一些实施例中，通过首先形成胚状体引发pPS的分化。O’Shea，Anat.Rec.(New Anat.257323，1999)报道了培养胚状体中的一般原理。pPS细胞以允许聚集物形成的方式培养，其中可获得许多选择例如通过供体pPS细胞培养物的过度生长，或通过在具有低粘附性质的基质，例如甲基纤维素的培养容器中培养pPS细胞。胚状体易被本领域技术人员识别，并易收集并转移到新的培养环境中。胚状体通常具有内胚层外部和中胚层和外胚层内部。
如下节实施例中所说明的，胚状体还可以在悬浮培养中制备。简单胶原酶消化，解离成簇，铺在非粘附的细胞培养板上收集pPS细胞。每隔数天喂养聚集物，然后在合适的时间段，通常是4-8天后收集。然后将聚集物铺在适合肝细胞谱系的细胞的底物上。例子是较早更充分描述的Matrigel(Becton Dickenson)、层粘连蛋白、各种类型的胶原和明胶。可使用其它人工基质成分和组合。还可通过首先培养产生基质的细胞系(例如成纤维细胞，内皮细胞或间充质干细胞)，然后裂解和洗去细胞碎片，使得基质维持与容器表面连接来生产基质。通常不需要从胚状体上分散细胞；胚状体可直接铺在基质上。然后在含有肝细胞分化剂的培养基中培养细胞。
在本发明的其它实施例中，pPS细胞与分化剂混合，不形成相当数量的胚状体-即在标准pPS细胞培养物中，在达到汇合时间或达到汇合时间之前，但不是开始过度生长之前加入试剂。这在本文中称为直接分化法。通常有利的是(但不是所需的)pPS细胞在无饲养细胞培养物中。可收集pPS细胞并铺在新的底物上，加入含有分化剂的培养基。另外，如果pPS细胞已经被维持在适合培养分化的细胞的基质上，那么分化剂可直接加到pPS培养物中，不用重新铺板。每天观察培养物，以确定是否达到汇合。已发现正当细胞达到汇合时加入分化剂，肝细胞谱系细胞的产率可以高3倍，而不是在约60-80％汇合时。
通过提供体内肝细胞的环境典型的底物来进一步促进分化肝母细胞谱系。例如，某些胞外基质成分提供了合适的表面，例如Matrigel(Becton Dickenson)、层粘连蛋白或从裂解细胞获得的基质。另一种对于这些细胞分化合适的底物是明胶。在含有适合维持细胞的缓冲液、离子强度和营养物的营养培养基中培养细胞(见WO99/20741)。对特定细胞优化培养基是在熟练技术人员的范围内，并且在本公开中有例证。
细胞在含有合适的底物和肝细胞分化剂的环境中维持足够的时间，使允许从其它细胞富集分化的细胞-如凭经验确定的那样。例如，用分化剂(如正丁酸盐)培养的第一天使得约90％培养的胚状体衍生细胞从基质释放入培养基中。在24小时后更换培养基时，除去这些细胞，在含有正丁酸盐的新鲜培养基中培养存活的细胞。
在充分培养一段时间后，剩余的细胞大量富集了具有肝细胞和/或肝细胞祖细胞特征的细胞。对于肝细胞分化剂正丁酸盐来说，培养期通常约4-8天，通常约6天。读者注意到在本发明的一些分化剂存在下延长培养，对最大限度的获得肝细胞谱系细胞可能是次优的。其它分化剂，例如正丁酸盐在长期培养中会耐受。在这些情况下，将试剂保持在培养基中有利于维持分化的细胞的表型。不意味着被理论所限，本发明假设肝细胞分化剂，例如正丁酸盐具有两种作用第一，促进pPS细胞沿肝细胞谱系分化，第二，随着继续培养优先选择该谱系的细胞存活。
合适的分化剂正丁酸盐是典型的肝细胞分化剂，在下面的实施例中说明。本领域技术人员将不难认识到，易鉴定具有相似作用的许多正丁酸盐的同系物，并在本发明的实践中用作替代品。
一类同系物包括其它烃类，它们与正丁酸盐具有相似的结构和理化性质。这些同系物中的一些是酸性烃类，由3-10个碳原子组成，是分枝、直链或环状形式，或是共轭碱，选自羧酸盐、磺酸盐、磷酸盐和其它质子供体。合适的例子包括但不限于正丁酸、异丁酸、2-丁烯酸、3-丁烯酸、丙酸、丙烯酸、戊酸、戊烯酸、其它饱和或不饱和的短链脂肪酸、氨基丁酸、苯基丁酸、苯基丙酸、苯基乙酸、苯氧基乙酸、肉桂酸和二甲丁酸盐。还感兴趣的是与这些化合物等比容的烃类磺酸酯或磷酸酯，特别是丙烷磺酸和丙烷磷酸，它们与正丁酸盐等比容。
在这些化合物的命名中，应理解包括所有立体异构体，除非特别说明。具有酸基团的化合物可以酸形式提供，或作为共轭碱，具有任何可接受的对相反荷离子。由于使用正丁酸钠将提高所用的环境的离子强度，如需要可通过加入盐改变离子强度来增强其它试剂的作用。
另一类同系物是丁酸盐和丁酸盐同系物的衍生物，包括与其它分子，例如氨基酸、单糖和其它可接受的共轭配对的共轭物。已开发了许多这样的衍生物，作为在体内或原位通过合适的转化酶(例如蛋白酶或糖苷酶)存在转化成活性形式的丁酸盐前药。为了说明起见，该类的成员包括精氨酸丁酸盐、赖氨酸丁酸盐、其它丁酸盐酰胺、葡萄糖戊丁酸盐、三丁精、二丙酮葡萄糖丁酸盐、其它丁酸盐糖类、氨基丁酸、异丁酰胺、特戊氧甲基丁酸盐、1-(2-羟乙基)4-)1-氧丁基)-哌嗪丁酸盐、其它丁酸盐的哌嗪衍生物和吡乙酰胺(2-氧-1-吡咯烷乙酰胺，NotropylTM)，γ-氨基丁酸眼的环衍生物。
另一类同系物是组蛋白去乙酰酶的抑制剂。非限制性例子包括曲古抑菌素A、5-氮胞苷、trapoxin A、oxamflatin、FR901228、顺氯氨铂和MS-27-275。读者还可参见U.S.5,922,837中的抗原生动物的环状四肽；U.S.5,925,659中的抗菌剂；WO 99/23885中的共阻遏物抑制剂；和WO 99/11659中的环状肽衍生物。用组蛋白去乙酰酶抑制剂鉴定化合物的方法可通过去阻遏激素受体化合物(WO98/48825)鉴定。
正丁酸盐的肝细胞分化作用可能至少部分是取决于抑制组蛋白去乙酰酶的能力。组蛋白去乙酰酶活性的检测可用作预先筛选，来选择其它分化剂的候选物。有许多这样的检测方法。例如，U.S.5,922,637(第3栏以下)描述了用含氚的N-去甲氧基阿匹西定(apicidin)和寄生虫或鸡肝S100溶液作为去乙酰酶活性的来源的试验。将候选化合物加到反应混合物中，用滤膜法测定氚释放。Nare等(Anal.Biochem.267390，1999)开发了一种闪烁邻近试验，使用来自组蛋白H4的肽，用氚乙酰化赖氨酸ε-氨基，它与SPA珠结合，后者的闪烁与邻近的氚量成正比。组蛋白去乙酰酶活性(从HeLa细胞核的抽提物获得)释放标记的乙酰基，并减少闪烁，而去乙酰酶抑制剂的存在维持闪烁。Hoffman等(Nucl.Acids Res.272057，1999)描述了组蛋白去乙酰酶活性的非同位素测定。开发了荧光底物，它们是Ω-乙酰化的赖氨酸的氨基香豆素衍生物。这使得底物的定量在纳摩尔浓度范围内，能够进行组蛋白去乙酰酶抑制剂的高通量筛选。
对合适的分化剂的最可靠测试是其将pPS细胞培养物转化成富含肝细胞谱系的细胞培养物的能力，如本公开所述。在pPS细胞或胚状体的培养物中，以类似于已知对正丁酸盐有效的方式，加入可任选的根据上述条件的一个或多个预筛选的候选化合物。任何可至少促进pPS细胞沿肝细胞谱系途径分化，或优选允许成肝细胞型细胞生长，或优选除去其它谱系的细胞的化合物将有利于衍生本发明的一些分化的细胞群。
根据这些指导，作为肝细胞分化剂的特定化合物或化合物的组合包括在化合物存在下培养一群基本未分化的pPS细胞，或一群混合的分化的pPS细胞(例如那些从胚状体或pPS培养物过度生长获得的)，然后确定对细胞形态、标记表达、酶活性、增殖能力或其它与肝细胞谱系的细胞有关的感兴趣的特征的作用。为了最佳结果，评估了几种浓度的测试化合物。合适的基础浓度可以是等渗容摩或与有效丁酸盐浓度等渗的或具有另一种组蛋白去乙酰酶相等的抑制能力。然后可测试的试验化合物超过约1/10ih到10倍基础浓度的范围，或更大，从确定它是否具有所需的肝细胞分化能力。
如果能从pPS细胞培养物或胚状体细胞产生一群细胞，其中至少40％细胞具有肝母细胞或肝细胞的至少三个特征，将该化合物视为有效的分化剂。产生具有大量的肝细胞特征的更均一的群的试剂在一些情况下是有利的。认识到产生较复杂或不太均一或不太成熟的肝细胞群的试剂也可能是有利的，如果细胞维持另一种理想的特征(例如难于操作，或增殖能力)。如下文所述，这些细胞群可以通过分拣或吸附技术进一步富集所需的细胞类型。
成熟因子的选用如需要可使用一种起肝细胞成熟因子作用的分离化合物或化合物的混合物，补充用肝细胞分化剂富集分化的细胞。这些试剂可增强分化剂促进的表型改变，或可以推动分化途径进一步朝更成熟细胞发展，或可以帮助筛选肝细胞谱系的细胞(例如，通过优先支持其生存)，或可以促进更迅速增殖具有所需表型的细胞。
一类肝细胞成熟因子是可溶性生长因子(肽激素、细胞因子、配体-受体复合物等)，它们能促进肝细胞谱系的细胞的生长。这些因子包括但不限于表皮生长因子(EGF)、胰岛素、TGF-α、TGF-β、成纤维细胞生长因子(FGF)、肝素、肝细胞生长因子(HGF)、在地塞米松存在下的制瘤素M、IL-1、IL-6、IGF-I、IGF-II、HBGF-1和胰高血糖素。
另一类肝细胞成熟因子是皮质类固醇，特别是糖皮质素。这些化合物是类固醇或类固醇模拟物，并影响中间代谢，特别是促进肝脏糖原储藏，和抑制炎症。包括天然存在的激素，例如可地松，和合成的糖皮质醇，例如地塞米松(美国专利号3,007,923)及其衍生物，强的松、甲基强的松、氢化可地松和去炎松(美国专利号2,789,118)及其衍生物。
另一类肝细胞成熟因子是有机溶剂，例如DMSO。具有类似性质的取代物包括但不限于二甲基乙酰胺(DMA)、六亚甲基二乙酰胺和其它多亚甲基二乙酰胺。该类中的溶剂在增强细胞膜通透性的性质上是部分相关的。还感兴趣的是烟酰胺等溶质。测试候选化合物是否起到本发明的肝细胞成熟因子的作用是凭经验进行的用上述肝细胞分化剂，联合模式肝细胞分化剂，例如生长因子或DMSO(阳性对照)将pPS培养物分化肝母细胞谱系的细胞。平行对pPS进行类似方案，使用相同的分化剂和候选成熟因子。然后比较得到的细胞的表型，测定候选试剂是否具有阳性对照的类似效果。
在本发明的具体实施例中，同时或依次使用肝细胞分化剂和肝细胞成熟因子。在一个例子中，将新鲜铺板的胚状体或无饲养细胞的pPS培养物铺在含有正丁酸盐和DMSO的培养基中，培养4、6或8天，或直到培养基出现特征性特征，每隔一段时间(即每24小时)用含有正丁酸盐和DMSO的新鲜培养基替换培养基。在另一个例子中，EB或pPS培养物首先和正丁酸盐和DMSO培养4、6或8天，然后用含有生长因子的混合物的对肝细胞有利的培养基(可能与正丁酸盐联合)交换培养基，长期培养或测定。
根据这些指导，起到肝细胞成熟因子作用的特定化合物或化合物的组合的能力包括在化合物存在下培养先前用肝细胞分化剂处理过的一群细胞，或将化合物包括在用肝细胞分化因子处理的细胞培养物中。然后测定化合物对细胞形态、标记表达、酶活性、增殖能力或其它感兴趣的特征的作用，比较不含候选化合物的平行培养物。对于最佳结果，评估了化合物的几个浓度。有机溶剂的合适基础浓度可以是与有效DMSO浓度等渗摩尔或等渗。生长因子、细胞因子和其它激素的合适基础浓度可以是与其它系统中具有类似生长诱导或激素活性的浓度。然后可测试的试验化合物超过约1/10ih到10倍基础浓度的范围，或更大，从确定它是否对肝细胞指导的pPS细胞的成熟具有所需的作用。
一旦获得所需表型的细胞，可以收集细胞用于任何所需的用途。在本发明的某些分化细胞群中，细胞足够表型均一，它们可以简单的通过将细胞从基质释放收集(例如使用胶原酶或物理操作)，和任选的洗涤细胞除去碎片。如需要，收集的细胞可进一步通过阳性筛选所需特征，或阴性筛选不需要的特征来处理。例如，可阳性或阴性筛选表达表面标记或受体的细胞，通过细胞群与抗体或偶联配体一起孵育，然后分离出结合的细胞-例如使用标记的分拣技术，或吸附到固体表面上。还可以通过将细胞群与针对不需要标记的细胞裂解性抗体在补体存在下一起，孵育来进行阴性筛选。
如需要，收集的细胞可转移到其它培养环境中，例如对于其它类型的肝细胞制备物的增殖所述的那些。见例如美国专利号5,030,105和5,576,207；EP专利申请EP 953,633；Angeill等，Histochem J.29205，1997；Gomez-Lechon等，p.130，下文，《药物研究的体内方法》，Academic Press，1997)。
分化的细胞的特征根据许多表型条件可以表征细胞。条件包括但不限于检测或定量表达的细胞标记，和酶活性，以及形态特征和胞内信号的表征。
本发明描述的一些分化的pPS细胞具有肝细胞的特征性形态特征。这些特征易被本领域技术人员在评估这些情况中识别，包括任何或下列全部多边形细胞形状，双核表型，存在粗面内质网用于合成分泌的蛋白质，存在高尔基-内质网溶酶体复合物用于胞内蛋白质分拣，存在过氧化物酶体和糖原颗粒，相对丰富的线粒体，和形成紧密胞内连接的能力，导致形成胆小管空间。存在于单细胞中的许多这些特征与作为肝细胞谱系的成员的细胞一致。可通过对分化的pPS细胞，成年或胎儿肝细胞和一种或多种阴性对照细胞，例如成纤维细胞，或RPE(视网膜色素上皮)细胞的显微照片编码进行无偏的测定细胞是否具有肝细胞的特征性形态特征-然后以不知情方式评估显微照片，并解开编码来确定分化的pPS细胞是否可被准确鉴别。
本发明的细胞还可以根据它们是否表达肝细胞谱系特征性表型标记来表征。用于辨别肝脏祖细胞、肝细胞和胆表皮的细胞标记如表1所示(根据Seil & Zoran，Liver Stem Cells，R.G.Lardes Co.，TX，1997，p35；和Grisham等，“Stem Cells”，Academic Press，1997，p242改编)。
表1肝细胞标记
报道了肝细胞分化需要转录因子HNF-4α(Li等，Genes Dev，14464，2000)。不依赖于HNF-4α表达的标记包括α1-抗胰蛋白酶、α-胎蛋白、apoE、糖激酶、胰岛素生长因子1和2、IGF-1受体、胰岛素受体和苗条蛋白。依赖于HNF-4α表达的标记包括白蛋白、apoA1、apoAII、apoB、apoCIII、醛缩酶B、苯基丙氨酸羟化酶、L-型脂肪酸结合蛋白、转铁蛋白、视黄醇结合蛋白和红细胞生成素(EPO)。感兴趣的其它标记包括那些在下文实施例1、2和6中列出的。
可通过与其它细胞比较，来评估确定这些标记的表达水平。成熟肝细胞标记的阳性对照包括感兴趣的物种的成年肝细胞，和建立的肝细胞细胞系，例如衍生自美国专利5,290,684报道的肝母细胞瘤的HepG2系。读者注意到HepG2等永久细胞系可以代谢性改变，不能表达原代肝细胞的某些特征，例如细胞色素p450。原代肝细胞的培养物还可显示在持续培养后一些标记表达的下降。阴性对照包括独立谱系的细胞，例如成年成纤维细胞系，或视网膜色素表皮(RPE)细胞。未分化的pPS细胞对于上面列出的一些标记是阳性的，但对于成熟肝细胞的标记是阴性的，例如下面的实施例中所说明的。
本公开中列出的组织特异性蛋白质和寡糖决定簇可用任何合适的免疫学技术检测-例如流式免疫细胞化学用于细胞表面标记，免疫组织化学(例如对于固定的细胞或组织切片)用于胞内或细胞表面标记，细胞抽提物的Western印迹分析和酶联免疫分析用于细胞抽提物或分泌到培养基中的产物。据说细胞对抗原的表达是“抗体可检测的”，如果抗体的显著可检测量与抗原在标准的免疫细胞化学或流式细胞术测定中结合，在固定细胞之后可任选的，和可任选的使用标记的二抗或其它偶联物(例如生物素-链霉亲和素偶联物)来放大标记。
还可以在mRNA水平通过Northern印迹分析、斑点印迹杂交分析，或反转录酶引发的聚合酶链式反应(RT-PCR)，在标准扩增方法中使用序列特异性引物检测组织特异性标记的表达。进一步的细节见美国专利号5,843,780。可从公开数据库，例如GenBank(URL www.ncbi.nlm.nih.gov80/entrez)获得在该公开中列出的特定标记的序列数据。根据本公开中的测定之一mRNA水平的表达据说是“可检测的”，只要在典型的受控实验中，根据标准方法测定对细胞样品的性能导致可清楚分辨的杂交或扩增产物。如果水平至少是对照细胞，例如未分化的pPS细胞、成纤维细胞或其它无关的细胞类型的2倍，优选大于10倍或50倍以上，在蛋白质或mRNA水平检测到的组织特异性标记的表达视为阳性。
还可以根据是否显示肝细胞谱系的细胞特征性的酶活性来表征细胞。例如，Bublitz(Mol Cell Biochem.108141，1991)；Yasmineh等(Clin.Biochem.25109，1992)；和Ockerman(Clin.Chem.Acta 17201，1968)描述了葡萄糖-6-磷酸酶活性的测定。Shiojiri描述了肝细胞中碱性磷酸酶(ALP)和5-核苷酶(5’-Nase)的测定(J.Embryol.Exp.Morph.62139，1981)。为研究和卫生部门服务的许多实验室提供了肝脏酶的测定，作为一种商业服务。
细胞色素p450是单加氧酶系统的一种关键的催化成分。它组成一类负责生物异源物质的氧化代谢(施用的药物)和许多内源化合物的血红素蛋白。不同的细胞色素代表特征性和重叠的底物特异性。大部分生物转化能力是基于称为1A2、2A6、286、3A4、2C9-11、2D6和2E1的细胞色素(Gomes-Lechon等，pp.129-153，《药物研究的体外方法二》，Academic Press，1997)。
在测定细胞色素p450酶活性的领域内许多测定是已知的。例如，细胞可以与非荧光底物接触，该底物可被p450活性转化成荧光产物，然后通过荧光激活的细胞计数(美国专利5,869,243)分析。具体是，洗涤细胞，然后与10μm/L 5，6-甲氧基羰基荧光素(Molecular Probes，Eugene OR)的溶液一起在37℃避光孵育15分钟。然后洗涤细胞，用胰蛋白酶从培养平板上分离，并在约520-560nm荧光发射分析。据说如果测试细胞中的活性水平比对照细胞，例如成纤维细胞高2倍，优选10或10倍以上，细胞具有所测定的酶活性。
还可以在蛋白质水平上，例如在Western印迹中使用特异性抗体，或在mRNA水平，在Northen印迹或RT-PCR中使用特异性探针和引物测定细胞色素p450的表达。见Borlakoglu等，Int.J.Biochem.251659，1993。还可测定p450系统的特定活性7-乙氧基香豆素O-去-乙基酶活性，烯丙试卤灵(aloxyresorufin)O-去-烷基酶活性，香豆素7-羟基酶活性，对硝基苯酚羟基酶活性，睾酮羟化，UDP-葡糖醛酸基转移酶活性，谷胱甘肽S-转移酶活性等(由Gomes-Lechon等综述，pp.411-431在“药物研究的体外方法”，Academic Press，1997)。然后可与原代肝细胞比较活性水平，如表2所示。
表224小时原代培养的人肝细胞的药物代谢活性
*24小时培养的人肝细胞确定的平均±标准偏差酶活性。
细胞色素P450含量表达成pMol/mg细胞蛋白。
NADPH-C、UDPG-t和GSH-t活性表达成纳摩尔/毫克/分钟。
§CYP酶活性表达成pMol/mg/min。
测定还用于与小分子药物的偶联、代谢或解毒有关的酶。例如，可通过与胆红素、胆酸和小分子药物偶联，以通过尿道或胆道排泄的能力来表征细胞。细胞与合适的底物接触，培养合适的时间，然后分析介质(通过GCMS或其它合适的技术)来确定是否形成偶联产物。药物代谢性酶活性包括去乙基化，去烷基化，羟基化，去甲基化，氧化，葡糖醛酸偶联，磺基偶联、谷胱甘肽偶联和N-乙酰转移酶活性(A.Gulliouzo，pp411-431，《药物研究的体外方法》，Academic Press，1997)。测定包括非那西汀去乙基化、普鲁卡因胺N-乙酰化、对乙酰氨基酚磺基偶联和对乙酰氨基酚葡糖醛酸化(Chesne等，345-350页，Liver Cells and Drugs，A.Guiliouzo编，John Libbery Eurotext，London，1988)。
还可以评估肝细胞谱系的细胞储藏糖原的能力。合适的测定使用高碘酸Schiff(PAS)染色，它不与单糖和二糖反应，但对长链聚合物，例如糖原和葡聚糖染色。PAS反应提供了复杂的糖类和可溶性和膜结合糖类化合物的定量估计。Kirkeby等(Biochem.Biophys.Meth.24225，1992)描述了糖类化合物和去污剂的定量PAS测定。Van der Laarse等(Biotech.Histochem.67503，1992)描述了使用PAS反应对糖原进行微光度测定。如果细胞与对照细胞，例如成纤维细胞比较，PAS阳性的水平至少是2倍，优选10倍以上，确定糖原储藏的证据。还可以通过根据标准方法的核型分析来表征细胞。
本发明的分化的pPS细胞可具有许多上述特征，包括抗体可检测的α1-抗胰蛋白酶(AAT)或白蛋白；不存在抗体可检测的α-胎蛋白的表达；RT-PCR可检测的无唾液酸糖蛋白受体(ASGR-1或ASGR-2同工型)的表达；糖原储藏的证据；细胞色素9450或葡萄糖-6-磷酸酶活性的证据；和肝细胞的形态学特征。特定细胞中存在这些特征越多，它越可被表征为肝细胞谱系的细胞。具有至少2、3、5、7或9个这些特征的细胞越来越优选。根据一特定的细胞群，例如可存在于培养容器或给药的制备物，细胞在表达这些特征中的均一性通常是有利的。在这种情况下，其中至少约40％、60％、80％、90％、95％或98％的细胞具有所需特征的群体越来越优选。
本发明分化细胞的其它所需特征是在体内作为药物筛选试验中的靶细胞的能力，和重建肝功能的能力，和作为体外装置的部分。这些特征在下文中进一步详述。
分化的细胞的端粒化理想的是，肝细胞谱系的细胞能在一些药物筛选和治疗应用中复制。本发明的细胞可任选的在变成有限的发育谱系细胞或最终变成分化的细胞之前或之后端粒化，以提高其复制能力。端粒化的pPS细胞可采取先前描述的分化途径；或可直接端粒化分化的细胞。
端粒化之前或之后，可用本领域已知的试剂和方法确定hTERT基因产物的端粒酶活性和表达。例如，用TRAP活性测定(Kim等，Science 2662011，1997，Weinrich等，Nature Genetics 17498，1987)评估了pPS细胞。用RT-PCR评估mRNA水平的hTERT表达。
通过用合适的载体转染或转导、同源重组或其它合适的技术基因改变细胞而端粒化，使其表达端粒酶催化成分(TERT)。特别合适的是人端粒酶的催化成分(hTERT)，在国际专利申请WO 98/14592中提供。对于一些应用，还可使用物种同系物，例如小鼠TERT(WO 99/27113)。Bodhar等，Science 279349，1998和Jiang等，Nat.Genet.21111，1989描述了人细胞中端粒酶的转染和表达。在另一个实施例中，hTERT克隆(WO 98/14592)用作hTERT编码序列的来源，在MPSV启动子的控制下剪接入PBBS212载体的EcoR1位点，或在LTR启动子控制下剪接入市售的pBABE反转录病毒载体的EcoRI位点。用含有8-16小时以上的上清液的载体基因改变分化或未分化的pPS细胞，然后交换到生长培养基中1-2天。用0.5-2.5μg/ml嘌呤霉素筛选基因改变的细胞，并重新培养，然后通过RT-PCR评估hTERT，端粒酶活性(TRAP测定)，hTERT的免疫细胞化学染色或复制能力。在支持增殖的条件下进一步培养可富集连续复制克隆，具有所需表型的细胞可任选的通过限制稀释进行克隆。
在本发明的一些实施例中，pPS细胞分化成具有肝细胞谱系特征的细胞，然后分化的细胞被基因改变以表达TERT。在本发明的其它实施例中，pPS细胞被基因改变以表达TERT，然后分化成具有肝细胞谱系特征的细胞。通过TRAP测定可确定成功的修改增加了TERT表达，或确定是否改进了细胞的复制能力。
还设想了使细胞无限增殖的其它方法，例如用编码SV40大T抗原的DNA转化细胞(美国专利5,869,243，国际专利申请WO 97/32972)。当细胞要用于治疗时，用癌基因或肿瘤病毒产物转染不太合适。端粒化的细胞在本发明的应用中特别感兴趣，因为具有可增殖并维持其核型的细胞是有利的，例如在药物筛选和治疗方案中，其中对个体给予分化的细胞以增加肝功能。
分化的细胞的用途本发明提供了一种方法，通过它可产生大量肝细胞谱系的细胞。这些细胞群可用于许多重要的研究、开发和商业目的。
表达文库和特异性抗体的制备本发明的分化的细胞可用于制备cDNA文库，该cDNA文库相对不被在来自其它谱系细胞中优先表达的DNA污染。例如，1000rpm离心5分钟收集细胞，然后用标准技术从沉淀中制备mRNA(Sambrook等，见上)。在反转录到cDNA中后，用来自任何或全部下列细胞类型的cDNA减去制备物未分化的pPS、胚胎成纤维细胞、内脏内胚层、窦状内皮细胞、胆管上皮或其它不需要的特异性的细胞，从而产生所选cDNA文库，反映代表成熟肝细胞、肝细胞前体或两者的表达模式。
本发明的分化的细胞还可以用于制备对肝细胞标记、祖细胞标记、对肝细胞前体特异性的标记和其它可在细胞上表达的抗原特异性的抗体。本发明的细胞提供了一种产生这些抗体的改良方法，因为它们与pPS培养物和来自肝脏组织的肝细胞培养物比较，相对富含特定的细胞类型。可通过将本发明的细胞以免疫原性形式注射入脊椎动物，来制备多克隆抗体。标准文献如Harrow & Lane(1986)，美国专利号4,491,632、4,472,500和4,444,887和Methods In Enzymology73B3(1981)描述了单克隆抗体的产生。获得特异性抗体分子(最佳是单链可变区形式)的其它方法涉及使免疫活性细胞或病毒颗粒与靶抗原接触，并在阳性筛选的克隆中生长。见Marks等，New Eng.J.Med.335730，1996，国际专利申请WO94/13804、WO 92/01047、WO 90/02809和McGuiness等，NatureBiotechnol.141449，1996。通过用本发明的pPS阳性筛选和用携带更广泛分布的抗原的细胞(例如分化的胚胎细胞)或成年人衍生的干细胞阴性筛选，可获得所需的特异性。抗体相反可用于鉴定或拯救来自混合细胞群的所需表型的肝细胞前体细胞，如用于使用组织样品在免疫诊断期间共染色，和从成熟肝细胞或其它谱系的细胞中分离这些细胞。
基因组学分化的pPS细胞感兴趣之处在于鉴定肝细胞前体细胞特征性转录物和新合成的蛋白质的表达模式，和有助于指导分化途径或促进细胞之间的相互作用。获得分化的细胞的表达模式并与对照细胞系，例如未分化的pPS细胞，其它类型的定型的前体细胞(例如朝其它谱系分化的pPS细胞，造血干细胞，其它中胚层衍生的组织的前体细胞，内皮或胆管上皮的前体细胞，从成年组织获得的肝细胞干细胞，或用其它试剂或技术朝肝细胞谱系分化的pPS细胞)比较。
在蛋白质水平比较表达的合适方法包括上述的免疫分析或免疫组织化学技术。在转录水平比较表达的合适的方法包括mRNA分化显示方法(Liang，Peng等，Cancer Res.526955，1992)和基质阵列表达系统(Schena等，Science 270467，1995；Eisen等，Methods in Enzymol.303179，1999；Brown等，Nat.Genet.21增刊133，1999)。
Fritz等Science 288316，2000；“微阵列生物芯片技术”，M.Schena编，Eaton Publishing Company；“微阵列分析”，Gwynne&Page，Science(1999/8/6增刊)；Poliack等，Nat Genet 2341，1999；Gerhold等，Trends Biochem.Sci.24168，1999；“基因芯片(DNA微阵列)”，L Shi，www.Gene-Chips.com综述了微阵列在分析基因表达中的用途。从下列公司可买到进行微阵列分析的系统和试剂，例如Affymetrix，Inc.，Santa Clara Ca；Gene Logic Inc.，ColumbiaMD；Hyseq Inc.，Sunnyvale CA；Molecular Dynamics Inc.，Sunnyvale CA；Nanogen，San Diego CA；和Synteni Inc.，Fremont CA(由Incyte Genomics，PaloAlto CA获得)。
固相阵列是通过在所需位置合成探针，或预先合成探针片段，然后将其附着于固相载体，将探针附着在特定位点制备的。可使用各种固相载体，包括玻璃、塑料、陶瓷、金属、凝胶、膜、纸和各种成分的珠。美国专利号5,445,934公开了一种芯片上合成的方法，其中用含有光可切割的保护基团的化学物质衍生载玻片。通过掩模辐射去除各位点的保护，然后与含有光保护性基团的DNA单聚物反应。将预先合成的探针附着于固相载体的方法包括吸附、紫外光连接和共价结合。在一个例子中，修饰固相载体携带一个活性基团，例如羟基、羧基、胺、醛、肼、环氧化物、溴乙酰基、马来酰亚胺或巯基，通过该基团可接合探针(美国专利号5,474,895和5,514,785)。
探测试验通常是通过阵列与可能含有感兴趣的核苷酸序列的液体在合适的杂交条件下接触，然后确定形成的任何杂交体进行的。例如，样品中的mRNA或DNA在与合适标记接合的核苷酸，例如荧光标记的Cy3或Cy5存在下扩增。调节条件，从而发生具有精确互补配对，或在合适情况下具有不同程度同源性的杂交。然后洗涤阵列，通过测定与固相结合的标记量，确定结合的核酸。可比较阵列之间不同样品的相对表达水平，可任选使用在大多数感兴趣的细胞中表达的基因，例如核糖体或持家基因，或作为样品中总多核苷酸的比例标准化。另外，可通过从具有不同标记的来源制备扩增的多核苷酸，同时在同一阵列上测试两个或多个不同来源的样品。
用Genetic Microsystems阵列发生器和Axon GenePixTM扫描仪进行一种示范性方法。通过首先以96或384孔形式扩增编码要分析的标记序列的cDNA片段制备微阵列。然后直接将cDNA点样于载玻片上，密度高达＞5000/片。为了比较感兴趣的两种细胞的mRNA制备物，将一种制备物转化成Cy3-标记的cDNA，而另一种转化成Cy5-标记的cDNA。同时将两种cDNA制备物与微阵列载玻片杂交，然后洗涤消除非特异性结合。阵列上任何给定的点将以两种原始mRNA制备物中的转录物的丰度成正比，与各cDNA产物结合。然后在各标记合适的波长扫描载玻片，得到的荧光是定量的，格式化结果得到阵列上各标记的mRNA相对丰度的指标。
鉴定表达产物，用于表征和影响本发明分化的细胞，涉及分析第一细胞类型，例如沿肝细胞谱系分化的pPS细胞的RNA、蛋白质或其它基因产物的表达水平；然后分析相同产物在对照细胞类型中的表达水平；比较两种细胞类型之间的相对表达水平(通常由样品中的总蛋白质或RNA标准化，或与期望在两种细胞类型中以相似水平表达的另一种基因产物，例如持家基因)；然后基于比较的表达水平鉴定感兴趣的产物。
与对照比较，在本发明的分化的pPS细胞中如果相对表达水平至少是约2倍、10倍或100倍提高(或抑制)，它们通常是感兴趣的产物。该分析可任选的是计算机辅助的，通过在独立的轴上标记各细胞类型中的表达水平，其中相对于各轴的标记的位置是根据各细胞中的表达水平，然后基于标记位置选择感兴趣的产物。另外，第一种细胞与对照细胞之间的表达差异可以在色谱上表示(例如黄色代表相等的表达水平，红色代表增加的表达，蓝色代表抑制的表达)。然后可基于代表一种感兴趣的标记的表达的颜色，或基于代表多种标记的颜色的图案选择感兴趣的产物。
用于药物筛选的分化的pPS细胞可用本发明的分化的pPS细胞筛选影响肝细胞谱系的分化细胞的特征的因子(例如溶剂、小分子药物、肽、多核苷酸等)或环境条件(例如培养条件或操作)。
在一些应用中，用pPS细胞(分化或未分化的)筛选促进细胞沿肝细胞谱系成熟的因子，或促进在长期培养中增殖和维持这些细胞。例如，通过将候选肝细胞成熟因子或生长因子加到不同孔的pPS细胞中，然后根据进一步培养的所需条件和细胞的用途测定任何表型改变测试这些因子。
本发明的特定筛选应用涉及在药物研究中测试药物化合物。读者一般可参见标准教科书《药物研究的体外方法》，Academic Press，1997和美国专利5,030,015。在该发明中，分化肝母细胞谱系的pPS细胞对标准药物筛选和毒性测试起了测试细胞的作用，如先前在肝细胞细胞系或原代肝细胞在短期培养中进行的。候选药物化合物活性的评估通常涉及将本发明的分化的细胞与候选化合物混合，确定可归因于化合物的细胞形态、标记表型或代谢活性的任何改变(与未处理的细胞或用惰性化合物处理的细胞比较)，然后将化合物的作用与观察到的变化联系起来。由于设计的化合物对肝脏细胞具有药理学作用，或由于设计的对其它部位有作用的化合物对肝脏有不良副作用，因此可进行筛选。可联合测试两种或多种药物(通过同时或依次与细胞混合)，来检测可能的药物-药物相互作用效果。
在一些应用中，筛选的化合物起初可能有肝脏毒性(Castell等，pp.375-410，于《药物研究的体外方法》，Academic Press，1997)。可在一开始用对细胞存活能力，存活、形态和酶渗漏入培养基的影响来确定细胞毒性。进行更详细的分析来来确定化合物是否影响细胞功能(例如糖异生、尿素生成和血浆蛋白质合成)，而不导致中毒。乳酸脱氢酶(LDH)是良好标记，因为肝同工酶(V型)在培养条件中是稳定的，使得培养上清液中在12-24小时孵育后有可复制的量度。酶(例如线粒体谷氨酸草酰乙酸酯转氨酶和谷氨酸丙酮酸转氨酶)的渗漏也可使用。Gomez-Lechon等(Ahal.Biochem.233296，1996)描述了测量糖原的微阵列，它能够用于测量药物化合物对肝细胞糖异生的作用。
目前用于评估肝脏毒性的其它方法包括确定白蛋白、胆固醇和脂蛋白的合成和分泌；偶联的胆酸和胆红素的转运；尿素生成；细胞色素p450水平和活性；谷胱甘肽水平；α-谷胱甘肽s-转移酶的释放；ATP、ADP和AMP代谢的；胞内K+和Ca2+浓度；核基质蛋白或寡核小体的释放；和凋亡的诱导(由细胞变圆，染色质凝聚和核片段化指示)。可用[3H]-胸腺嘧啶或BrdU掺入测定DNA合成。药物对DNA合成或结构的作用可通过测定DNA合成或修复确定。[3H]-胸腺嘧啶或BrdU掺入，尤其在细胞周期中的未预定的时间，或在细胞复制可需的水平以上，与药物作用有关。不良作用还包括姐妹染色体交换的异常比例，由分裂中期涂片确定。读者可参见A.Vickers(pp.375-410，于《药物研究的体外方法》，Academic Press，1997)进一步详述。
肝功能的恢复本发明还提供了用分化的pPS细胞使由于急性、慢性或先天性肝脏功能损伤，而需要这种治疗的病人恢复一定程度的肝功能。
为了确定分化的pPS细胞治疗应用的合适程度，首先可在合适的动物模型中测试细胞。在一个水平，评估细胞在体内存活和维持其表型的能力。将分化的pPS细胞在适合进一步观察的位点，例如在肾囊下，胰脏内或肝脏叶中给予免疫缺陷动物(例如SCID小鼠，或通过化学方法或辐射使的动物免疫缺陷)。在几天到几周或更长时间后收集组织，评估是否还存在pPS细胞。这可以通过提供给予具有可检测标记(例如绿色荧光蛋白，或β-半乳糖苷酶)的细胞进行，或通过测定对给予的细胞特异性的组成型标记。当在啮齿类模型中测试分化的pPS细胞时，可用免疫组织化学或ELISA，使用人特异性抗体，或通过RT-PCR使用引物和导致对人多核苷酸序列特异性扩增的杂交条件，评估给予的细胞的存在和表型。表3提供了在mRNA或蛋白质水平评估基因表达的合适标记。Grompe等(Sem.Liver Dis.197，1999)；Peeters等(Hepatology 25884，1997)和Ohashi等(Nature Med.6327，2000)提供了用于确定动物模型中肝细胞样细胞命运的一般描述。
在另一个水平，评估分化的pPS细胞在缺乏完全的肝功能的动物中恢复肝功能的能力。Braun等(Nature Med.6320，2000)描绘了由尿激酶表达的肝脏疾病的模型。Mignon等(Nature Med.41185，1998)描绘了HSK tk基因的转基因小鼠中毒素诱导的肝脏疾病的模型。Rhim等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA924942，1995)和Lieber等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 926210，1995)描绘了针对细胞表面标记Fas的抗体诱导的肝脏疾病。Overtruf等(Human GeneTher.9295，1998)在小鼠中通过靶向破裂Fab基因开发了一种遗传性酪氨酸血症I型模型。通过供给2-(2-硝基-4-氟甲基苄醇基)-1，3-环己二酮(NTBC)拯救了该动物的缺陷，但取出NTBC时产生肝脏疾病。急性肝脏疾病可用90％肝切除术作为模型(Kobayashi等，Science 2871258，2000)。急性肝脏疾病的模型也可以是用肝脏毒素，例如半乳糖胺，CCl4，或硫代乙酰胺处理动物。慢性肝脏疾病，例如硬化可用亚致死剂量的肝脏毒素长期处理动物，足够诱导成纤维化作为模型(Rudolph等，Science 2871253，2000)。评估分化的细胞重建肝功能的能力涉及将细胞施给这些动物，然后确定1-8周或更长的存活，同时监测动物病况的发展。可评估在肝脏组织中表达的标记、细胞色素p450活性和血液指标，例如碱性磷酸酶活性、胆红素偶联和凝血酶原时间，以及宿主的存活来确定对肝功能的作用。根据存活、疾病发展或肝功能的维持中的任何改善与疗效有关的任何这些条件，可进行进一步优化。
本发明包括包囊的分化的细胞，或生物人工肝脏装置的部分。各种形式的包囊在(Cell Encapsulation Technology and Therapeutics)，Kuhtreiber等编，Birknauser，Boston MA，1999中描述。本发明的分化的细胞可以用体外或体内使用的任何方法包囊。
临床使用的生物人工器官设计成作为长期治疗的一部分，或连结暴发性肝脏衰竭和肝脏重建或肝脏移植之间的时间，以支持肝功能受损的个体。Macdonald等，pp.252-286，于““Cell Encapsulation Technology and Therapeutics”中综述了生物人工肝脏装置，及在美国专利号5,290,684、5,624,840、5,853,717和5,935,849。悬吊型生物人工肝脏包括悬浮在平板透析液中，或在合适基质中微囊化，或与被胞外基质包裹的微载体珠结合的细胞。另外，肝细胞可置于填料床、多片平床或微通道屏障，或包围空心纤维毛细管的固相载体上。装置具有病人的血液通过的进口和出口，有时有一套单独的可对细胞提供营养物的口。
这些肝脏支持装置的目前计划涉及来自异种来源的肝细胞，例如猪肝细胞悬液，因为缺乏可得的原代人肝细胞。异种组织来源产生有关免疫原性和可能的物种交叉病毒传播的有条理的关注。
本发明提供了一个产生人细胞的制备性培养物的系统。根据上述方法制备分化的多能干细胞，然后将其装在装置中的合适基质，例如Matrigel或胶原上。可通过比较传入通道和传出通道中血液的成分，根据从传入的液体中取出的代谢物和传出的液体中新合成的蛋白质评估装置的效力。
可用该类装置对液体，例如血液解毒，其中液体与本发明的分化的细胞在允许细胞除去或改变液体中毒素的条件下接触。解毒涉及除去或改变肝脏通常具有的至少一种配体、代谢物或其它化合物(天然和合成的)。这些化合物包括但不限于胆红素、胆酸、尿素、血红素、脂蛋白、糖类、转铁蛋白、血色素结合蛋白、无唾液酸糖蛋白、胰岛素和胰高血糖素等激素，和各种小分子药物。装置还可以用于富集流出液中的合成的蛋白质，例如白蛋白、急性期反应物和未负荷的载体蛋白。可优化该装置，从而进行这些不同的功能，由此恢复尽可能多的肝功能。在治疗护理中，装置处理从肝脏衰竭病人流出的血液，然后血液回到病人。
在动物模型中(如上所述)显示所需的功能特征的本发明的分化的pPS细胞还适合直接对肝功能受损的病人给药。为了止血，细胞可在充分接触循环的任何位点，通常在腹腔内施用细胞。对于一些代谢和解毒功能，有利的是细胞接触胆道。因此，细胞在肝脏(例如在治疗慢性肝脏疾病中)或脾脏(例如在治疗暴发性肝衰竭中)附近施用。在一种方法中，细胞通过肝动脉或通过门静脉，通过固定导管输液，施用到肝循环内。可操纵门静脉中的导管，使得细胞主要流入脾脏或肝脏，或两者的组合。在另一种方法中，通过在接近靶器官的腔内安置丸药，通常是将留住在丸药的赋形剂或基质中施用细胞。在另一种方法中，细胞直接注射到肝脏或脾脏的叶中。
可用本发明的分化的细胞治疗任何需要恢复或补充肝功能的病人。适合这些治疗的人病况包括任何原因的暴发性肝衰竭、病毒性肝炎、药物诱导的肝脏损伤、硬化、先天性肝脏功能不全(例如Wilson氏病、Gilbert氏综合征或α1-抗胰蛋白酶缺陷)、肝胆癌、自身免疫性肝脏疾病(例如自身免疫性慢性肝炎或原发性胆硬化)和任何其它导致肝功能损伤的病况。对于人治疗，剂量通常在约109-1012个细胞之间，通常在约5×109和5×1010个细胞之间，根据病人体重、疾病的性质和严重程度，和施用的细胞的复制能力进行调节。最终由主治医生负责确定治疗模式和合适的剂量。
提供下列实施例是为了非限制性说明本发明的具体实施例。
实施例实验方法本节提供了下列实施例使用的技术和试剂的一些细节。
人胚胎肝细胞的维持在无血清培养基中的原代小鼠胚胎成纤维细胞上维持hES细胞。hES细胞作为小簇以约40,000细胞/cm2接种在辐射过的小鼠胚胎成纤维细胞上。这些培养物维持在含有80％KO DMEM(Gibco)和20％血清替代品(Gibco)，补充有1％非必需氨基酸，1mM谷氨酰胺、0.1mMβ-巯基乙醇和4ng/ml人bFGF(Gibco)的培养基中。通过连续传代ES集落来扩增细胞。这是通过在37℃用1mg/ml胶原酶处理ES集落的单层培养物实现的。然后温和刮下培养物除去细胞。小簇温和分离，并作为小簇重新铺在新鲜的饲养细胞上。
胚状体(EB)的产生通过在胶原酶中孵育15-20分钟，然后从平板上刮下细胞收集hES细胞在饲养细胞上或下的汇合的单层培养物。然后将细胞解离成簇，并置于培养基中的非黏附的细胞培养物平板(Costar)中，该培养基含有80％ KO DMEM(Gibco)和20％未热灭活的FBS(Hyclone)，补充有1％非必需氨基酸，1mM谷氨酰胺、0.1mMβ-巯基乙醇。在每孔(6孔板)的2ml培养基中，以1∶2比例接种细胞。每隔一天每孔加入2ml培养基喂养EB。当培养基体积超过4ml/孔时，收集EB并重悬浮在新鲜培养基中。4-8天悬浮后，将EB铺在底物上使其进一步分化。
Matrigel包裹的培养基底物根据厂商指导用Matrigel包涂孔。简单地说，4℃融化常规Matrigel或生长因子扣除的Matrigel(Collaborative Biosciences)至少3小时。在冷KODMEM中1∶10或1∶20稀释hES细胞培养物或1∶30稀释肝细胞培养物。用预先冷却的平板和移液管头，在各孔(9.6cm2)中加入0.75-1ml Matrigel溶液。平板在室温下孵育1小时或4℃过夜，然后在加入细胞前用冷KO DMEM洗涤一次。
免疫细胞化学在室温，将培养槽载玻片上生长的细胞在3.5％低聚甲醛中固定5分钟，然后在甲醇中-20℃下固定20分钟。将固定的细胞用PBS漂洗两次，用10％山羊血清的PBS溶液封闭1小时。然后在用10％山羊血清和PBS稀释的一抗中孵育2小时。以1∶500稀释针对白蛋白、α-胎蛋白(AFP)(Sigma)和α1-抗胰蛋白酶(OEBBiosciences Inc.)的抗体，1∶200稀释细胞角蛋白8、18和19，结蛋白(Neomarkers)、波形蛋白(Dako)和SMA(Sigma)。然后用PBS洗涤细胞3次，在二抗中孵育，它是5％山羊血清的PBS溶液中1∶100稀释的FITC-偶联的抗小鼠IgG，和1∶1000稀释的Hoechst HH33258(Sigma)，孵育1小时。然后将染色的细胞在PBS中洗涤3次，并装在VectashieldTM(Vector Labs)中。用装有落射荧光和光点CCD照相机的Nikon LabophotTM以10X、40X拍照。
糖原染色从美国Master Tech Scientific Inc.获得高碘酸Schiff染色(PAS)。在培养槽载玻片上生长的细胞，用丙酮∶甲醇1∶1在-20℃下固定20分钟。用自来水，然后用蒸馏水漂洗固定的细胞。然后在0.5％高碘酸溶液中室温温育细胞4分钟，用蒸馏水漂洗。然后与Schiff溶液在室温温育10分钟，用自来水漂洗数次。然后细胞在Fast Green染料中温育2分钟，用100％乙醇漂洗两次，装在DPX固定装置中。用装有落射荧光和光点CCD照相机的Nikon LabophotTM以10X、40X拍照。
BrdU染色细胞在培养槽载玻片上在指定的生长培养基中生长，并用10μmBrdU标记24小时。然后用3∶1的甲醇乙酸固定细胞30分钟，并在暗处风干过夜。用PBS漂洗固定的细胞一次，用0.07N NaOH变性2分钟，然后在pH8.5和pH7.4的PBS中快速漂洗几次。然后用1.5％山羊血清(Vector Labs)封闭15分钟，用在1.5％山羊血清和0.05％TweenTM20中1∶500稀释的BrdU抗体(Sigma)温育2小时。样品在PBS中洗涤三次，然后与二抗温育30分钟，该二抗是生物素酰化的山羊抗小鼠免疫球蛋白(Vector Labs)，在1.5％马血清中以10微克/毫升稀释。样品再次在PBS中洗涤三次，然后与以30微克/毫升稀释于10mM HEPES缓冲液和0.15MNaCl pH8.5的染色偶联物，Texas Red标记的链霉亲和素(Vector Labs)避光温育20分钟。将Hoechat HO33258染料(二苯酰亚胺，Sigma目录号B2883)以2.5μm的最终浓度混入链霉亲和素溶液，以染色所有的核。染色的细胞在PBS中再洗涤3次，装在VectashieldTM(Vector Labs)上。用装有反射荧光和光点CCD照相机的Nikon LabophotTM以10X、40X拍照。
反转录酶PCR扩增如下进行转录水平上表达的RT-PCR分析用RNAeasy试剂盒TM(Qiagen)如厂商指示从细胞提取RNA。然后用DNase消化最终产物以除去污染的基因组DNA。RNA在含有10mM Tris pH7.5，10mM MgCl2和5mM DDT的缓冲液中，在RNAguard(Pharmacia Upjohn)和DNAse I(Pharmacia Upjohn)中37℃温育30-45分钟。为了从样品中除去蛋白质，进行苯酚-氯仿抽提并用3M乙酸钠和100％冷乙醇沉淀RNA。用70％乙醇洗涤RNA，风干沉淀物，并重悬浮在DEPC-处理的水中。为了反转录酶(RT)反应，将500ng总RNA与最终浓度为1X的第一链缓冲液(First StrandBuffer)(Gibco)、20mm DDT和25微克/毫升随机六聚物(Pharmacia Upjohn)混合。RNA在70℃变性10分钟，然后室温退火10分钟。以最终浓度为1mm加入dNTP和0.5微升Superscript II RT(Gibco)，42℃温育50分钟，然后80℃热灭活10分钟。然后将样品储藏在-20℃，直到它们进行PCR分析。用对感兴趣的标记特异性的引物在下列反应混合物中进行标准聚合酶链式反应(PCR)cDNA 1.0微升，10×PCR缓冲液(Gibco)2.5微升，10×MgCl22.5微升，2.5mM dNTP 3.0微升，5μM3’-引物1.0微升，5μm 5’-引物，1.0微升，Taq 0.4微升，DEPC-水13.6微升。所选的标记和反应条件如表3所示。
表3RT-PCR表达分析的反应条件
实施例1用正丁酸盐分化人胚胎干细胞如之前面的部分中的描述制备胚状体(EB)。悬浮培养5天后，收集并铺在减少生长因子的Matrigel包涂的平板上，和培养槽载玻片(Nunc)内。平行使用了下列三种条件·含有20％胎牛血清(FBS)的培养基；·含有20％FBS和5mM丁酸钠(Sigma)的培养基；·含有20％FBS、0.5％DMSO(ATCC)、4μm地塞米松(Sigma)、150ng/ml胰岛素、10ng/mlEGF、600nM胰高血糖素(Sigma)。
在各种情况下，每天更换培养基，在铺板后第4天固定细胞用于免疫细胞化学。
铺板后1天，单独铺在20％FBS中的EB看似健康，它们几乎全部粘附在板上，并似乎正在增殖。几天后，只有在FBS中的细胞存活得很好，并分化形成种类非常不同的群体。相反，含有丁酸钠的培养物铺板1天后具有大比例的明显死亡的细胞，仅有几片含有明显均一的细胞群存活。这些细胞的形态与原代肝细胞相似，即细胞大而且在几天后变成多核。将这些培养物与原代人肝细胞培养物(从匹兹堡大学Stephen Strom博士处获得)和HepG2细胞(永久人肝细胞系衍生自肝母细胞瘤，与美国专利5,290,684中报道的类似)比较。在含有0.5％DMSO和生长因子(3号)的情况下，细胞看似健康，培养物含有显著不同的细胞群。
图1显示了重新铺板并培养再2天的胚状体细胞的形态(4X、10X、20X)。右侧显示通过在肝细胞分化剂正丁酸盐中培养2天分化的细胞。在胚状体铺板的位点上形成圆形集落；中间的白色斑点是小区域的死亡细胞。视野中的其它细胞显示明显均一的形态。左侧显示单独在含血清的培养基中培养的细胞。胚状体分散在广泛的区域内，并形成不同斑点的细胞，显示许多不同细胞类型的形态。
铺板后4天，用针对不同肝脏特异性标记的抗体固定在培养槽载玻片上生长的细胞，用于免疫细胞化学。结果如表4所示。用丁酸钠处理的培养物不表达AFP，但约30％的细胞表达抗体可检测水平的白蛋白。
表4培养的细胞的免疫细胞化学
*-对于显示阳性染色的细胞百分数提供的结果(n.d.)＝在该实验中未确定实施例2分化的细胞表达的标记悬浮培养4或5天后收集hES细胞衍生的胚状体，铺在用Matrigel包涂的6孔板(用于RNA抽提)和培养槽载玻片(用于免疫细胞化学)中的含有20％FBS和5mM正丁酸钠的培养基中。每天或每隔一天更换培养基。在第1天有许多细胞死亡，然后在后面的几天内死亡的细胞较少。
图2显示了用正丁酸盐培养6天后分化的细胞的形态。同一培养物显示6个不同的视野(10x在顶部，20x在其它列中)。细胞是显著均一的，显示成熟肝细胞的大多边形表面和双核中心特征。
铺在分化剂中后的第6天，用RT-PCR和免疫细胞化学根据上述方法分析细胞的标记表达。用高碘酸Schiff染料测定这些细胞中的糖原含量。通过在铺板后第5天将细胞与10μm BrdU温育，然后用抗BrdU抗体在24小时后染色，来测定细胞周期的S期中的细胞数。
图3显示了某些细胞特异性标记的免疫组织化学染色的结果。图3A(40X)显示了从匹兹堡大学获得的原代成年人肝细胞的结果-抗体染色在右侧，对于相同视野用Hoechst HH33258二苯酰亚胺染色的细胞核在左侧。图3B(20X)显示了用正丁酸盐培养6天的hES细胞的结果。两组细胞对白蛋白、α1-抗胰蛋白酶和CD18显示高比例的细胞染色，肝细胞谱系细胞的三个特征性标记，和对α-胎蛋白阴性是早祖细胞的标记。
图4显示了用正丁酸盐培养6天的细胞的糖原染色图(10X和40X)。用高碘酸Schiff染色细胞中的糖原(粉红、深色)，用Fast Green染色勾画细胞胞质(背景绿色，浅色)。约60％丁酸盐处理的细胞显示糖原储藏的证据(顶部列)，与胎儿肝细胞的80％(中部列，阳性对照)和人成纤维细胞(称为BJ成纤维细胞)中几乎没有(底部列，阴性对照)比较。
表5提供了表型分析的总结。在55％的细胞中发现白蛋白表达。完全不存在AFP。在至少60％细胞中储藏糖原。16％的细胞被BrdU标记，表明大部分的细胞在分析时增殖。
表5；分化的细胞表型
还在用正丁酸盐培养6天后进行了RT-PCR分析，观察在肝细胞中正常表达的各种基因的表达模式。这些数据与相同基因在成年肝细胞、胎儿肝细胞、HepG2细胞(肝癌系)和非肝细胞RPE(视网膜色素上皮)细胞系中的表达模式比较。结果如表6所示。
表6基因表达的RTPCR分析
将正丁酸钠的效果与其它可能的肝细胞分化剂在相似方案中比较。悬浮培养胚状体4天，然后重新铺在包涂胶原酶I的板上。然后在各化合物存在下培养细胞6天。结果如表7所示。
表7肝细胞分化剂
+导致肝细胞分化并选择性除去其它细胞类型
-无诱导作用±轻微诱导作用；可能允许其它细胞类型的生长或存活在5mM浓度，氯化钠没有作用，而丁酸和丁酸钠相等有效-表明分化不是简单由于离子浓度的变化。读者应理解丁酸和丁酸钠在培养基的缓冲能力范围内是相同物质的共轭形式。因此，术语在本公开中可互换除非需要另外说明。
为了比较，以6mM测试各种丁酸盐的结构类似物。类似物丙酸、异缬草酸和异丁酸有效导致肝细胞分化，但被认为在这些条件下不是优选的，因为富集具有肝细胞表型的细胞不够强。
曲古抑菌素A是组蛋白去乙酰酶的另一抑制剂，发现在2.5-100μM的范围内对细胞有毒，在10-50nm范围内是无效的。在75-100nM，曲古抑菌素A似乎诱导肝细胞分化并选择对抗其它细胞类型的存活。用5mm正丁酸钠和100nM曲古抑菌素A产生的肝细胞谱系细胞的表型如表8所示。
表8分化的细胞的表型
实施例3用肝细胞成熟因子提高正丁酸盐的分化作用在用正丁酸盐分化的细胞中测试了各种可能的肝细胞成熟因子的作用。在5mM正丁酸钠中培养hES 4天，然后换到不同的培养基中。测试了下列替代物1.Clonetics的“HCM”培养基2.10％胎牛血清(FBS)，补充有胰岛素、表皮生长因子(EGF)、地塞米松和胰高血糖素；3.10％小牛血清(CS)，补充有胰岛素、EGF、地塞米松和胰高血糖素；4.20％FBS，补充有胰岛素、EGF、地塞米松和胰高血糖素在这些条件下维持细胞4天。细胞在所有条件下存活，但在10％FBS和生长因子(组2和4)中看来最好。用胰蛋白酶消化这些细胞，重新铺在用新鲜Matrigel包涂的平板中。用相似方案或组合测试其它生长因子，来确定它们对肝细胞成熟和细胞表型的作用。
实施例4hES衍生的肝细胞的端粒化用丁酸钠分化hES几天后，用编码人端粒酶反转录酶(hTERT)的人同系物的反转录病毒转导细胞。载体含有来自质粒pGRN145的hTERT编码序列，在市售的pBABE嘌呤霉素构建物的EcoR1位点内。hTERT编码序列置于反转录病毒启动的控制下。用PA317包装细胞系制备对照和hTERT pBABE反转录病毒上清液，并与4μg/ml多聚季铵混合。
制备分化的hES细胞培养物，用含有反转录病毒上清液的培养基替换培养基8-16小时。再次用正常生长培养基替换培养基，使细胞恢复1-2天。然后用0.5-2.5微克/毫升嘌呤霉素选择细胞。用形态学方法评估细胞的生长速率，用免疫细胞化学和RT-PCR评估表达模式。用TRAP测定评估端粒酶活性。
实施例5人胚胎干细胞在无饲养细胞培养物中的分化未分化的hES集落在无饲养细胞的条件下如下连续传代。培养物在1mg/ml胶原酶中37℃温育5分钟。通过将细胞从表面刮下，并解离成小簇，收集细胞。将细胞以1∶3或1∶6，约55000细胞/ml(17000细胞/平方厘米)分开。重新铺板后，可再次鉴定未分化的细胞的集落。集落之间的单个细胞分化了。在几天后，见到未分化的细胞增殖，集落变大和紧密。集落之间分化的细胞变得更紧密。细胞在每天用条件培养基喂养，4-7天后变汇合。当细胞达到汇合时，再次将它们分开。
对于该实施例，分化前将H9 hES细胞(p30+5)维持在无饲养细胞条件下30天(5次传代)。将未分化的细胞维持在层粘连蛋白上，用MEF条件培养基饲养，如本公开之中所述。为了诱导分化，用含有5mM丁酸钠的SR培养基(未补充bFGF)替换条件培养基。
在这些条件中1天后，可见到具有肝细胞样形态的小块细胞。另外，大量细胞死亡并似乎粘附在培养皿底部。在接受不含丁酸盐的SR培养基的对照培养物中，观察到大量的多种多样的分化(具有不同形态的细胞)。处理6天后，接受丁酸钠的培养物含有许多块的肝细胞样细胞，但也鉴定出一些具有其它形态的细胞。许多死亡细胞仍粘着在培养皿上。不接受丁酸盐的培养物似乎非常分化，具有多种多样的表型。
在随后的实验中，维持在无饲养细胞条件中的hES细胞与丁酸钠在传代时接触。在汇合时用胶原酶收集称为H9并在Matrigel上维持48小时(8次传代)的hES细胞系，并重新接种在Matrigel上。将细胞在含有5mM丁酸钠的SR培养基中传代，并在培养的不同时间评估肝细胞样形态和基因表达，与不用丁酸盐培养的细胞比较。
实施例6丁酸盐联合DMSO的作用在该实验中，在肝细胞成熟因子DMSO的存在下确定肝细胞分化剂丁酸盐的作用。
在4天后收集悬浮培养的人ES细胞衍生的胚状体，铺在下列四种条件中。
·5mM丁酸钠存在下明胶包涂的平板·5mM丁酸钠和1％DMSO存在下明胶包涂的平板·5mM丁酸钠存在下Matrigel包涂的平板·5mM丁酸钠和1％DMSO存在下Matrigel包涂的平板每隔一天更换培养基，在第7天用免疫细胞化学和RT-PCR分析细胞。在这些条件下的细胞看来形态相似，包括具有均一形态的细胞集落。在存在丁酸盐和DMSO的组中有较少的细胞集落，与单独在丁酸盐中培养比较。铺在明胶上的两组具有甚至更少的细胞。
免疫染色显示在所有条件中具有相似的标记表型。培养物中测试的各标记染色的细胞百分数如表9所示。
表9分化的细胞的表型
实施例7hES不形成胚状体直接分化肝母细胞样细胞未分化的hES细胞维持在无饲养细胞条件下(在Matrigel上，MEF-CM中)。策略是通过在亚汇合的培养物中加入肝细胞成熟因子DMSO或视黄酸(RA)，引发全面分化过程。然后通过加入丁酸钠诱导细胞形肝母细胞样细胞。
分开后，hES细胞维持在未分化的培养条件中2-3天。此时，细胞约50-60％汇合，用含有1％DMSO的无条件养基更换培养基。每天用SR喂养培养物4天，然后交换到含有2.5％丁酸钠的无条件SR培养基中。每天用该培养基喂养培养物6天；此时用免疫细胞化学评估培养物的一半。另一半培养物用胰蛋白酶酶收集，重新铺在胶原上，进一步促进富集肝细胞谱系的细胞。然后在翌日进行免疫细胞化学。
如表10所示，经过最终重新铺板的细胞具有比未重新铺板的细胞高5倍的白蛋白表达，类似的α1-抗胰蛋白酶表达和低2倍的细胞角蛋白表达。据信第二次细胞铺板富集了肝细胞样细胞。
表10分化的细胞的表型
实施例8用于hES细胞分化肝细胞的不同基质的比较在无饲养细胞条件中，从hES细胞产生EB。在悬浮4天后，将EB铺在补充有5mM丁酸钠或5mM丁酸钠和1％DMSO的20％FBS培养基中。EB铺在下列基质上1.胶原I(0.03mg/ml，37℃包裹过夜)2.减少生长因子的Matrigel(1∶10，室温包涂1小时)3.明胶(1％，37℃包裹2小时)在丁酸钠中5天后，用形态学方法评估细胞并用免疫细胞化学检测肝细胞标记。在所有条件中，观察到肝细胞样细胞的均一块。然而，与其它条件的相比细胞簇的数量在用明胶包涂的培养物中，大大减少。如表11所示，在所有条件中具有白蛋白、细胞角蛋白和α1-抗胰蛋白酶免疫反应性的细胞百分数相似。在所有条件中糖原储藏也是相似的。这些数据表明所有测试的基质促进肝细胞分化，但Matrigel和胶原I包涂支持存活的效果比明胶更好。
表11分化的细胞的表型
实施例9直接分化条件的进一步优化hES细胞经过先前详述的直接分化方法，调节到表12所示的培养条件。肝细胞培养基购自Clonetics；Strom培养基是如Runge等，Biochem.Biophys.Res.Commun.265376，1999中所述制备的。获得的细胞群用免疫细胞化学和酶活性评估。
表12直接分化方案
在随后的(4天)成熟步骤中测试的其它添加剂包括因子，例如FGF-4和地塞米松存在下的制瘤素M。
图5显示了HCM对hES衍生的细胞的成熟作用。左栏10X放大；右栏40X放大。在丁酸盐存在中截止4天，培养物中80％以上的细胞直径大，含有大核和颗粒状胞质(A列)。在SR培养基中5天后，将细胞转换到HCM中。2天后，许多细胞变成多核，具有大的多边形形状(B列)。在HCM中截止4天，常见多核化多边形细胞，并具有较深的胞液(C列)，根据这些条件它们与新鲜分离的人成年肝细胞(D列)或胎儿肝细胞(E列)相似。
实施例10代谢酶活性测试了直接分化方案产生的hES衍生的肝细胞谱系细胞的细胞色素P450活性。
在分化方案完成后，细胞与或不与5μM甲基胆蒽(cholranthrene)，一种细胞色素P450酶1A1和1A2的(CYP1A1/2)诱导剂一起培养。测量酶活性，作为乙氧基试卤灵(EROD)的去乙基化的速率。在培养基中以5μM加入底物，并在2小时后在荧光显微平板阅读仪上，355nm激发和581nm发射处测定培养物上清液的荧光。用对纯试卤灵测定的标准曲线确定形成的试卤灵量，并表达成每毫克蛋白质每分钟形成的微微摩尔试卤灵。
图6显示了结果。在测试到的三个肝细胞谱系细胞系中检测了CYP1A1/2活性-两个衍生自H1 ES细胞系，一个衍生自H9 ES细胞系。用甲基胆蒽(MC)可诱导活性水平，并超过在两个新鲜分离的人成年肝细胞(HH)制备物中的观察到的水平。未分化的H1和H9细胞中的活性水平(和在BJ人胚胎成纤维细胞系中)是可忽略的。
应理解本领域技术人员可有效地修改本公开中所述的组合物和方法，而不违背以下权利要求中所体现的本发明的精神。
权利要求
1.一种通过分化灵长类多能干细胞获得的，可在体外培养物中分化的细胞群，其特征在于，在该群中至少约60％的细胞具有下列特征的至少三种·α1-抗胰蛋白酶的抗体可检测表达；·白蛋白的抗体可检测表达；·不存在α-胎蛋白的抗体可检测表达；·无唾液酸糖蛋白受体的RT-PCR可检测表达；·糖原储藏的证据；·细胞色素p450活性的证据；·葡萄糖-6-磷酸酶活性的证据；和·肝细胞的形态特征。
2.如权利要求1所述的分化的细胞群，其特征在于，至少约60％的细胞具有所述特征中的至少5个。
3.如权利要求1所述的分化的细胞群，其特征在于，至少约80％的细胞具有所述特征中的至少7个。
4.如前任一权利要求所述的分化的细胞群，其特征在于，细胞色素p450酶1A1/1A2活性的水平是至少和原代人成年肝细胞中的一样高。
5.如前任一权利要求所述的分化的细胞群，其特征在于，从灵长类多能干细胞分化出的细胞是人胚胎干细胞。
6.如前任一权利要求所述的分化的细胞群，其特征在于，所述细胞群被基因改变，以提高的水平表达端粒酶。
7.如前任一权利要求所述的分化的细胞群，其特征在于，所述细胞群是通过在含有肝细胞分化剂的生长环境中培养灵长类多能干细胞获得的。
8.如权利要求7所述的分化的细胞群，其特征在于， 所述肝细胞分化剂是正丁酸盐。
9.如前任一权利要求所述的分化的细胞群，其特征在于，在含有胞外基质的生长环境中培养灵长类多能干细胞。
10.如前任一权利要求所述的分化的细胞群，其特征在于，在含有一种或多种肝细胞成熟因子的生长环境中培养灵长类多能干细胞。
11.如权利要求10所述的分化的细胞群，其特征在于，肝细胞分化因子中的至少一种是a)选自二甲基亚砜、二甲基乙酰胺；六亚甲基二乙酰胺和其它聚亚甲基二乙酰胺的有机溶剂；或b)选自糖皮质激素、表皮生长因子、胰岛素、TGF-α、TGF-β、成纤维细胞生长因子、肝素和肝细胞生长因子、IL-1、IL-6、IGF-I、IGF-II和HBGF-1的细胞或激素。
12.在基本无饲养细胞、胞外基质、肝细胞分化剂和肝细胞成熟因子的组合物中的前述任一权利要求所述的分化的细胞群。
13.具有权利要求1列出的至少三种特征的分化细胞群，它是从权利要求1所述的分化的细胞群收集的，或是这样的细胞的子代。
14.一种分化的细胞群，其特征在于，该细胞群是通过提供在基本无饲养细胞的生长环境中的人多能干细胞；在含有肝细胞分化剂的培养基中，在产生富含肝细胞特征性特征的细胞群的条件下培养所述人多能干细胞；和随后从富集的细胞群中收集具有这些特征的细胞产生的。
15.一种处理人多能干细胞获得可在体外培养分化的细胞的方法，其特征在于，该方法包括a)提供人多能干细胞的培养物；b)在含有肝细胞分化剂的培养基中的基板上，在导致分化的细胞富集的条件下培养细胞。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，人多能干细胞的培养物是在形成胚状体的条件下培养细胞；将胚状体铺在胞外基质上，在胚状体铺板的同时或随后加入肝细胞分化剂；和然后用肝细胞分化剂在允许分化的细胞富集的条件下培养铺板的细胞产生的。
17.如权利要求15-16所述的方法，其特征在于，在含有胞外基质但基本无饲养细胞的人多能干细胞培养物中加入肝细胞分化剂；然后用肝细胞分化剂在允许分化的细胞富集的条件下培养人多能干细胞。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述胞外基质包括层粘连蛋白、胶原、或来自Engelbreth-Holm-Swarm细胞的基质。
19.如权利要求15-18所述的方法，其特征在于，所述肝细胞分化剂是正丁酸盐。
20.如权利要求15所述的方法，其特征在于，该方法还包括在用肝细胞分化剂培养的同时或随后，用一种或多种肝细胞成熟因子培养细胞。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，至少一种肝细胞成熟因子是a)一种有机溶剂，选自二甲基亚砜、二甲基乙酰胺、六亚甲基二乙酰胺和其它聚亚甲基二乙酰胺；或b)一种细胞因子或激素，选自糖皮质激素、表皮生长因子、胰岛素、TGF-α、TGF-β、成纤维细胞生长因子、肝素和肝细胞生长因子、IL-1、IL-8、IGF-I、IGF-II和HBGF-1。
22.一种产生一群在培养物中增殖，具有细胞色素p450活性的细胞的方法，其特征在于，该方法包括在分化成具有细胞色素p450活性的细胞前或后，提高灵长类多能干细胞中的端粒酶活性。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，通过基因改变细胞，使其表达端粒酶反转录酶，提高细胞中的端粒酶活性。
24.一种根据权利要求15-23所述的方法产生的分化的细胞，或所述细胞的子代。
25.如权利要求24所述的分化的细胞，其特征在于，该细胞具有下列特征的至少三种·α1-抗胰蛋白酶的抗体可检测表达；·白蛋白的抗体可检测表达；·不存在α-胎蛋白的抗体可检测表达；·无唾液酸糖蛋白受体的RT-PCR可检测表达；·糖原储藏的证据；·细胞色素p450活性的证据；·葡萄糖-6-磷酸活性的证据；和·肝细胞的形态特征。
26.一种筛选肝细胞毒性的化合物的方法，其特征在于，该方法包括将权利要求1-14或24-25所述的分化的细胞与化合物混合，并确定化合物是否对细胞有毒性。
27.一种筛选化合物调节肝细胞功能的方法，其特征在于，该方法包括将权利要求1-14或24-25所述的分化的细胞与化合物混合，确定由于与化合物接触导致的细胞表型或代谢的变化，并将所述变化与调节肝细胞功能的能力联系起来。
28.如权利要求26-27所述的筛选方法，其特征在于，基因改变所述的分化细胞，使其表达端粒酶反转录酶。
29.一种去除液体毒性的方法，其特征在于，该方法包括使权利要求1-14或24-25所述的分化的细胞与液体在允许细胞除去或改变液体中毒素的条件下接触。
30.一种肝脏支持装置，其特征在于，安排权利要求1-14或24-25所述的分化的细胞除去从病人流出的血液的毒性，然后该血液在用装置解毒后流回病人。
31.一种在个体中重建或补充肝细胞功能的方法，其特征在于，该方法包括在个体腹腔中施用多个权利要求1-14或24-25所述的细胞。
32.一种在个体中重建或补充肝细胞功能的方法，其特征在于，该方法包括将个体与权利要求31所述的肝脏支持装置以其血液循环流过的方式连接，并用该装置解毒。
全文摘要
已发现在肝细胞分化剂存在下培养多能干细胞时，衍生出一群细胞，其中有显著高比例的具有干细胞表型特征的细胞。在一个例子中，使人胚胎干细胞形成胚状体，然后与分化剂正丁酸盐混合，可任选地补充成熟因子。在另一个例子中，在无饲养细胞培养物中的人胚胎干细胞中加入正丁酸盐。在两种方法中都获得了显著均一的细胞群，它主要是由具有肝细胞形态特征的细胞组成的，表达肝细胞特征性表面标记，还具有对肝功能重要的酶和生物合成作用。由于肝细胞易在培养物中增殖，因此该系统为各种用途，例如药物筛选和临床治疗中补充肝功能提供了肝细胞谱系细胞的丰富来源。
文档编号C12N5/10GK1439049SQ01811938
公开日2003年8月27日 申请日期2001年4月26日 优先权日2000年4月27日
发明者拉克舒美·蓝哈拉, 莫莉莎·K·卡本特 申请人:杰龙公司