多组分标记免疫分析方法和即时检测系统的制作方法
【专利摘要】本发明属于快速标记免疫分析技术，具体涉及多个目标物并行标记和检测的方法，以及多组分的即时检测系统。所述方法包括以下步骤：免疫化磁珠组捕获；固定多核苷酸捕获；检测抗体的标记和检测。所述系统包括微流控芯片、磁场产生装置以及检测装置，所述微流控芯片包括微通道和设置在微通道内的免疫化磁珠组，所述微通道包括捕获室和反应室，所述反应室通过隔断机构选择性隔断为若干子反应室，所述子反应室负载有固定多核苷酸，所述子反应室还设有各自独立的检测抗体贮液池。本发明提供的技术方案将多种多核苷酸对包被了不同抗体的磁珠进行标记，通过负载于一组可相互隔离的反应室中的多核苷酸阵列实现多种目标物的捕获、转移、分离以及检测。
【专利说明】多组分标记免疫分析方法和即时检测系统
【技术领域】
[0001]本发明属于快速标记免疫分析技术，具体涉及从微量样本中快速、高灵敏度的分辨并分别采集多个目标物，进一步通过标记技术对多个目标物并行标记和检测的方法，以及一种多组分的即时检测系统。
【背景技术】
[0002]标记免疫技术具有选择性高、灵敏度高、普适性好等优点，主要包括放射免疫技术、酶免疫技术、荧光免疫技术、化学发光免疫技术，采用荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体(或抗原)进行抗原-抗体反应，通过对免疫复合物中的标记物的测定，达到对免疫反应进行监测的目的。
[0003]即时检测(Point-of-care testing, P0CT)是指在采样现场即刻进行分析,省去标本在实验室检验时的复杂处理程序，快速得到检验结果的一类方法。POCT中免疫分析方法目前已广泛用于医疗卫生、环境监测、反恐等领域的快速检测。但目前的POCT均是针对单一目标物进行，如果需要进行一个样本的多目标物检测需要将样本分为多份，然后对每份样本进行不同目标物的检测，但这样一方面受限于样本量的问题能够测试的目标物有限，另一方面，每份样本量较少，导致检测灵敏度大幅下降。因此，如果能够针对一个样本进行同步多目标物提取和检测则可以大大提升POCT的应用范围和价值，但这种方式需要克服一个突出的技术问题，也就是不同抗体间会交叉反应，导致产生大量的假阳性信号，无法获得正确的检测结果。
[0004]超顺磁性纳米微球(superparamagnet ics nano spheres/particles/beads)简称磁珠，是由Senyei A E在1978年首先研制出来的一种新型的功能性材料。它的内部是一个磁核，因而在外部磁场的作用下，微球可以定向移动；而微球外部是一层包覆层，表面分布着许多活性基团，可以和细胞、蛋白质、核酸、酶等生化试剂发生偶联。用于生化分析的磁珠具有以下特点:1)超强的顺磁性，就是指在磁场的存在下能迅速聚集，离开磁场能够均匀分散，不出现聚集显现现象，文献CN102333595A中即公开一种使多个顺磁颗粒在小体积液体中团聚并随后均匀分布的方法；2)合适的粒径且粒径分布范围窄，使微球有足够强的磁响应性，又不会因粒径太大而发生沉降；3)具有丰富的表面活性基团，以便微球可以和生化物质偶联，并在外磁场的作用下实现与被待测样品的分离。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是目前POCT无法实现一个样本的多目标物同步检测，为了克服以上不足，提供了一种多组分标记免疫分析方法和即时检测系统。
[0006]为了解决上述技术问题，本发明的技术方案是:所述多组分标记免疫分析方法，其包括以下步骤:
[0007]I)免疫化磁珠组捕获:样本与免疫化磁珠组混合，所述免疫化磁珠组包括两种以上的免疫化磁珠，所述免疫化磁珠为表面负载有捕获抗体和引导多核苷酸的磁珠，同种免疫化磁珠的捕获抗体相同，同种免疫化磁珠的引导多核苷酸相同，不同种免疫化磁珠的捕获抗体对应不同待测抗原，不同种免疫化磁珠的引导多核苷酸两两之间正交，所述捕获抗体与样本中相应的待测抗原结合；
[0008]2)固定多核苷酸捕获:驱动结合了待测抗原的免疫化磁珠组在反应区域内运动，所述反应区域包括至少与免疫化磁珠种类数相同的子反应区域，所述子反应区域内负载有固定多核苷酸，同一子反应区域内的固定多核苷酸相同，所述引导多核苷酸至少与一种所述固定多核苷酸为互补序列，所述固定多核苷酸与互补的引导多核苷酸结合，从而使不同待测抗原聚集到不同的子反应区域内；
[0009]3)检测抗体的标记:采用标记免疫技术，在不同的子反应区域内通过特异的经过标记的检测抗体与待测抗原的反应形成标记了的免疫复合物，用洗脱液将多余的检测抗体洗脱；和
[0010]4)检测:分别就各子反应区域内的免疫复合物进行检测，获得相应待测抗原的检测数据。
[0011]本发明首先通过免疫化磁珠组将样本中两种以上待测抗原捕获，然后，分布在不同区域的固定多核苷酸将结合了不同待测抗原的免疫化磁珠分离开来并将结合了相同待测抗原的免疫化磁珠聚集起来，最后，对固定在不同区域的待测抗原进行标记和检测。
[0012]免疫化磁珠可以是将表面有链亲和素的磁珠与生物素化的抗体以及生物素化的多核苷酸混合孵育一小时，然后洗去未结合的生物素化的抗体以及生物素化的多核苷酸。当然免疫化磁珠也可以通过其他常用的负载一种活性物质时的方法将抗体和多核苷酸分次或者同时负载于磁珠表面，具体反应条件及过程为现有技术在此不再赘述。
[0013]文中所述互补序列是指两多核苷酸的序列存在较长碱基互补部分，可以形成有效
?
[0014]文中所述多核苷酸两两之间正交是指两两序列之间不存在连续三个碱基互补，无法形成有效的结合。
[0015]优选地是，在步骤2)和步骤3)之间，将子反应区域之间进行隔离，这样有效的避免同时检测时不同亲和分子间的交叉反应，导致假阳性信号的产生，进行隔离后，子反应区域内只加入特定的检测抗体并进行检测，准确度提高。
[0016]优选地是，在步骤I)和步骤2)之间包括洗脱步骤:施加磁场，聚集捕获了待测抗原的免疫化磁珠组，洗脱液替换掉流体，待测抗原通过免疫化磁珠组被保留下来。
[0017]优选地是，所述样本为经抗凝处理的血液样本、血浆、血清、尿液或唾液。
[0018]优选地是，引导多核苷酸和固定多核苷酸有连续的至少10个碱基互补，优选的，引导多核苷酸和固定多核苷酸有连续的至少20个碱基互补。
[0019]优选地是，所述标记技术选自酶免疫标记技术(ELISA)或化学发光免疫技术(CLIA)0
[0020]本发明还提供了一种多组分的即时检测系统，包括微流控芯片、设置在微流控芯片上下一方或两方的磁场产生装置以及检测装置，所述微流控芯片包括微通道和设置在微通道内的免疫化磁珠组，所述微通道包括捕获室和反应室，所述反应室通过隔断机构选择性隔断为若干子反应室，所述子反应室负载有固定多核苷酸，所述子反应室还设有各自独立的检测抗体贮液池。[0021]优选地是，所述隔断机构为阀或插片。
[0022]优选地是，所述微流控芯片还包括设置在捕获室所处微通道一端的废液出口和设置在反应室所处微通道一端的洗脱液贮液池，所述废液出口分别与捕获室和各子反应室相连，所述洗脱液贮液池分别与捕获室和各子反应室相连，所述捕获室设置进样口。
[0023]优选地是，所述捕获室和反应室之间设有物理斜坡，其垂直障碍高度为0.l_2mm。物理斜坡可以有效防止所述物理斜坡防止剩余的滞留物从捕获室下部部分流入反应室，只有通过磁场转移的磁珠可以顺利从捕获室进入反应室，进一步降低了系统的背景噪音。
[0024]优选地是，所述捕获室的体积为2-40微升。也就是进样量只需在2-40微升之间，满足了 POCT样品量少的要求。
[0025]本发明提供的技术方案将多种多核苷酸对包被了不同抗体的磁珠进行标记，通过负载于一组可相互隔离的反应室中的多核苷酸阵列实现微量液体样本中多种目标物的捕获、转移、分离以及对各目标物的单独检测，可以在不增加样本量的前提下使对各目标物的检测灵敏度和可靠性接近其单独检测时的水平，实现一个样本的多目标物同步检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1是本发明所述多组分即时检测系统一【具体实施方式】的结构示意图；
[0027]图2是本发明所述微流控芯片一【具体实施方式】的结构示意图；
[0028]图3是本发明所述免疫化磁珠一【具体实施方式】的示意图；
[0029]图4是本发明所述检测抗体标记一步的示意图。
[0030]图中所示:
[0031]11-捕获室，111-进样口，12-反应室，121-第一子反应室，122-第二子反应室，123-第三子反应室，124-第四子反应室，125-固定多核苷酸，126-检测抗体贮液池，127-发色底物贮液池，128-检测窗口，129-检测抗体，131-第一免疫化磁珠，132-第二免疫化磁珠，133-第三免疫化磁珠，134-第四免疫化磁珠，135-捕获抗体，136-引导多核苷酸，14-废液出口，15-洗脱液贮液池，16-物理斜坡，17-隔断机构，21-上电磁铁，22-下电磁铁，31-待测抗原IL-6，32-待测抗原TNF- α，33-待测抗原IL-8，34-待测抗原VEGF。
【具体实施方式】
[0032]下面结合附图对本发明作详细描述:
[0033]本实施例以血液样本中同时检测白细胞介素6 ( IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α )、白细胞介素8 (IL-8)与血管内皮生长因子(VEGF)四个组分为例说明本发明提供的方法和系统，其余样本中多组分检测本领域技术人员可参照实现。
[0034]血液样本:包含了不同浓度白细胞介素6 (IL-6)、肿瘤坏死因子a (TNF-a ),白细胞介素8 (IL-8)和血管内皮生长因子(VEGF)4组分的血液，共7种浓度样本，每种重复3份，共计21份样本。每种样本中各组分浓度从低到高分别为:IL-6(O, 0.48，2.4，12，60，300，1500pg/ml), TNF-a (O, 2.2，11.2，56，280，1400，7000pg/ml),IL-8 (0，1.6，8，40，200，1000，5000pg/ml), VEGF (0，6.4，32，160，800，4000，20，OOOpg/ml),血液样本是将白细胞介素6 (IL-6)、肿瘤坏死因子a (TNF-a )、白细胞介素8 (IL_8)和血管内皮生长因子(VEGF)的标准蛋白加入到经乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝处理后的健康人的血液中获得。可用的抗凝剂还包括柠檬酸、肝素等。所用待测抗原(IL-6、TNF-α、IL-8与 VEGF)来自 R&D Systems 公司。
[0035]方法或系统中采用的免疫化磁珠是将表面包被链亲和素的磁珠与生物素化的抗体以及生物素化的多核苷酸混合孵育一小时，然后洗去未结合的生物素化的抗体以及生物素化的多核苷酸获得。表面包被链亲和素的磁珠来自Solulink公司。生物素化的抗体来自美国R&D Systems公司。生物素化的多核苷酸由生工生物合成。另外，负载在反应室内的固定多核苷酸是通过生物素化的多核苷酸负载于基底上。检测抗体是辣根过氧化物酶标记的抗体，来自美国R&D Systems公司。辣根过氧化物酶的发色底物(SuperSignal ELISAFemto Maximum Sensitivity Substrate)购自美国 Pierce 公司。
[0036]光电倍增管(PMT)购自日本滨松公司。
[0037]所述多组分的即时检测系统，包括微流控芯片、设置在微流控芯片上下两方的磁场产生装置以及检测装置(图中未示)。
[0038]如图1所示，所述微流控芯片包括微通道、设置在微通道内的免疫化磁珠组、废液出口 14和洗脱液贮液池15。
[0039]如图1和2所示，所述微通道包括捕获室11、反应室12和设置在捕获室11和反应室12之间的物理斜坡16。所述捕获室11的体积为40微升，所述物理斜坡16的垂直障碍高度为2mm。另一实施例中所述捕获室11的体积为2微升，所述物理斜坡16的垂直障碍高度为0.1mm。所述物理斜坡16可仅是下层倾斜向上到达较高的反应室12，也可以是上下层平行向上到达较高的反应室12。所述废液出口 14设置在捕获室11所处微通道一端，所述洗脱液贮液池15设置在反应室12所处微通道一端。
[0040]如图1和2所示，所述捕获室11上设有进样口 111，所述反应室12通过隔断机构176选择性隔断为4个子反应室:第一子反应室121、第二子反应室122、第三子反应室123和第四子反应室124。所述废液出口 14分别与捕获室11和各子反应室相连，所述洗脱液贮液池15分别与捕获室11和各子反应室相连。
[0041]所述子反应室的基底分别负载有固定多核苷酸125，所述子反应室还设有各自独立的检测抗体贮液池126和检测窗口 128，所述反应室12还设有发色底物贮液池127，所述子反应室分别与所述发色底物贮液池127连接。需要指出的是，发色底物贮液池127均是由于采用酶标记技术所需要增加的贮液池，该贮液池可以根据情况增加或者减少，比如化学发光免疫技术或荧光免疫技术时，可能仅需要发光物质标记或荧光标记的检测抗体贮液池，发色底物。
[0042]各子反应室中负载的固定多核苷酸125和各自检测抗体贮液池126中的检测抗体129的具体情况如表I所示。
[0043]表I
[0044]
【权利要求】
1.一种多组分标记免疫分析方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)免疫化磁珠组捕获:样本与免疫化磁珠组混合，所述免疫化磁珠组包括两种以上的免疫化磁珠，所述免疫化磁珠为表面负载有捕获抗体和引导多核苷酸的磁珠，同种免疫化磁珠的捕获抗体相同，同种免疫化磁珠的引导多核苷酸相同，不同种免疫化磁珠的捕获抗体对应不同待测抗原，不同种免疫化磁珠的引导多核苷酸两两之间正交，所述捕获抗体与样本中相应的待测抗原结合； 2)固定多核苷酸捕获:驱动结合了待测抗原的免疫化磁珠组在反应区域内运动，所述反应区域包括至少与免疫化磁珠种类数相同的子反应区域，所述子反应区域内负载有固定多核苷酸，同一子反应区域内的固定多核苷酸相同，所述引导多核苷酸至少与一种所述固定多核苷酸为互补序列，所述固定多核苷酸与互补的引导多核苷酸结合，从而使不同待测抗原聚集到不同的子反应区域内； 3)检测抗体的标记:采用标记免疫技术，在不同的子反应区域内通过特异的经过标记的检测抗体与待测抗原的反应形成标记了的免疫复合物，用洗脱液将多余的检测抗体洗脱；和 4)检测:分别就各子反应区域内的免疫复合物进行检测，获得相应待测抗原的检测数据。
2.根据权利要求1所述一种多组分标记免疫分析方法，其特征在于，在步骤2)和步骤3)之间，将子反应区域之间进行隔离。
3.根据权利要求1或2所述一种多组分标记免疫分析方法，其特征在于，在步骤I)和步骤2)之间包括洗脱步骤:施加磁场，聚集捕获了待测抗原的免疫化磁珠组，洗脱液替换掉流体，待测抗原通过免疫化磁珠组被保留下来。
4.根据权利要求1或2所述一种多组分标记免疫分析方法，其特征在于，所述样本为经抗凝处理的血液样本、血浆、血清、尿液或唾液。
5.根据权利要求1或2所述一种多组分标记免疫分析方法，其特征在于，所述引导多核苷酸和固定多核苷酸有连续的至少10个碱基互补，优选的，引导多核苷酸和固定多核苷酸有连续的至少20个碱基互补。
6.根据权利要求1或2所述一种多组分标记免疫分析方法，其特征在于，所述标记技术选自酶免疫标记技术(ELISA)或化学发光免疫技术(CLIA)。
7.一种多组分的即时检测系统，其特征在于，包括微流控芯片、设置在微流控芯片上下一方或两方的磁场产生装置以及检测装置，所述微流控芯片包括微通道和设置在微通道内的免疫化磁珠组，所述微通道包括捕获室和反应室，所述反应室通过隔断机构选择性隔断为若干子反应室，所述子反应室负载有固定多核苷酸，所述子反应室还设有各自独立的检测抗体贮液池。
8.根据权利要求7所述一种多组分的即时检测系统，其特征在于，所述微流控芯片还包括设置在捕获室所处微通道一端的废液出口和设置在反应室所处微通道一端的洗脱液贮液池，所述废液出口分别与捕获室和各子反应室相连，所述洗脱液贮液池分别与捕获室和各子反应室相连，所述捕获室设置进样口。
9.根据权利要求7或8所述一种多组分的即时检测系统，其特征在于，所述捕获室和反应室之间设有物理斜坡，其垂直障碍高度为0.l_2mm，所述捕获室的体积为2_40微升。
10.根 据权利要求7或8所述一种多组分的即时检测系统，其特征在于，所述隔断机构为阀或插片。
【文档编号】G01N33/543GK103575880SQ201310572029
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2013年11月15日 优先权日:2013年11月15日
【发明者】施奇惠, 司珂 申请人:司珂, 施奇惠