一种检测石蜡切片组织中结核分枝杆菌复合体的试剂盒和方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测石蜡切片组织中结核分枝杆菌复合体的试剂盒和方法。
【背景技术】
[0002] 结核病主要是由结合分枝杆菌复合体（M. tuberculosis complex，MTC)引起 的一类以呼吸系统感染为主的慢性人兽共患病。MTC主要由核酸组成高度相似但宿主、 表型和致病性等差异明显的不同种群组成：结核分枝杆菌M. tuberculosis,非洲分枝 杆菌M. africanum,肯尼迪分枝杆菌M. canettii,牛分枝杆菌M. bovis,田鼠分枝杆菌 M. microti,海豹分枝杆菌M. pinnipedii以及羊分枝杆菌M. caprae。在中国，每年结核病新 发病例大约是100万，大约占到了全球新发病例的十分之一（http://www. chinacdc. cn/)。 因此，特异、快速、高效地检测出MTC不仅可以尽快的给患者准确的诊断同时从流行病控制 的角度有利于控制和阻止结核病（国家法定乙类传染病）在人群的流行。
[0003] MTC几乎可以感染人类的任何组织和器官，其中最常见的是肺。病人通常是有较密 切的结核病接触史后出现呼吸道咳嗽、咳痰、咯血、胸痛、不同程度胸闷或呼吸困难而入院 就医。通过影像学及痰液或者胸腹水中的MTC检测诊断肺结核。当MTC感染肺以外的其他 组织或者器官包括：淋巴结、消化道、关节和滑膜、（支）气管、肾脏、胸膜和胸壁、鼻（咽） 部、腹腔、骨等，其与宿主组织反应出现肉芽肿结节，外科手术后送检病理诊断。
[0004] 在常规病理诊断中，要确诊结核病，除了观察到以肉芽肿为特征的组织学改变外， 还需找到直接病原菌一 MTC。目前我国病理科开展得最广泛的寻找病原菌的方法为齐-尼 氏抗酸特殊染，但是齐-尼氏抗酸有其突出的几大问题比如：阳性率普遍偏低，国际报道普 遍低于10% ;另外，抗酸染色不能从形态上区分开MTC和其他的非结核分枝杆菌（NTM)，造 成误诊。
[0005] PCR检测时一种较为简便、准确的方法，但是目前所有基于PCR技术的结核临床检 测试剂盒都是针对新鲜样本（体液、血液等），而MTC感染后仅存留在局部组织中，如肉芽肿 结节中，直接取新鲜的体液、血液或者组织时，很多时候会因为选取的组织中不含MTC而造 成假阴性结果。
[0006] 将组织制成石蜡切片组织后，可以有效确定哪些部位有肉芽肿结节，因此通过检 测肉芽肿结节的组织是否含有MTC，可以准确的确定是否感染MTC，降低假阴性结果。但是 石蜡组织有其自身的特点，比如其组织中DNA均不是完整的DNA是片段化DNA，其大小一般 小于500bp，另外石蜡组织中，MTC均夹杂在宿主细胞中，难以富集，提取到的DNA绝大多数 是宿主DNA，待检的MTC的DNA往往含量很低，因此用常规检测新鲜样本的PCR方法难以有 效检测。
[0007] 专利号为US7, 332, 597B的专利申请公开了一种检测石蜡切片组织中MTC的方法， 但是该方法的灵敏度低，MTC的最低检测限为400fg。
【发明内容】
[0008] 为了解决上述问题，本发明提供了一种新的检测石蜡切片组织中结核分枝杆菌复 合体的试剂盒和方法。
[0009] 本发明提供了 SEQ ID NO. 1~2与SEQ ID NO. 3~4所示的引物对。
[0010] 本发明提供了 SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6所示的探针。
[0011] 本发明还提供了 SEQ ID NO. 1~2和/或SEQ ID NO. 3~4所示的引物对以及 SEQ ID NO. 5和/或SEQ ID NO. 6所示的探针在制备检测石蜡切片组织中结核分枝杆菌复 合体的试剂中的用途。
[0012] 本发明还提供了一种检测石蜡切片组织中结核分枝杆菌复合体的试剂盒，它包括 SEQ ID NO. 1~2和/或SEQ ID NO. 3~4所示的引物对以及SEQ ID NO. 5和/或SEQ ID NO. 6所示的探针。
[0013] 本发明还提供了一种检测石蜡切片组织中结核分枝杆菌复合体的方法，它包括如 下步骤：
[0014] (1)提取样本DNA :取待检石蜡切片组织，提取其中的DNA ;
[0015] (2)基因扩增：用权利要求3所述的试剂盒对待检样本中的DNA进行扩增；
[0016] (3)结果检测：对DNA扩增结果进行检测。
[0017] 本发明提供的试剂盒可以准确检测石蜡切片组织中是否有结核分枝杆菌复合体， 且灵敏度高，MTC的最低检测限为10fg，特异性好，检测快速，临床应用前景良好。
[0018] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0019] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0020] 图1是中国食品药品鉴定研宄院提供人结核标准菌株H37Rv经过福尔马林固定石 蜡处理后，在不同浓度下本发明与商品化新鲜样本结核检测试剂盒（进口）对比实验。P表 示弱阳性参照，N是阴性参照，1待检菌株H37Rv DNA浓度在IOfg条件下，用本发明方法和 试剂盒检测的结果，2表示待检菌株H37Rv DNA浓度在IOfg条件下，用商品化新鲜样本结核 检测试剂盒（进口）检测的结果；
[0021] 图2是中国食品药品鉴定研宄院提供人结核标准菌株H37Rv经过福尔马林固定石 蜡处理后，在不同浓度下本发明与商品化新鲜样本结核检测试剂盒（进口）对比实验。P表 示弱阳性参照，N是阴性参照，1待检菌株H37Rv DNA浓度在100f g条件下，用本发明方法和 试剂盒检测的结果，2表示待检菌株H37Rv DNA浓度在IOOfg条件下，用商品化新鲜样本结 核检测试剂盒（进口）检测的结果；
[0022] 图3是中国食品药品鉴定研宄院提供人结核标准菌株H37Rv经过福尔马林固定石 蜡处理后，在不同浓度下本发明与商品化新鲜样本结核检测试剂盒（进口）对比实验。P表 示弱阳性参照，N是阴性参照，1待检菌株H37Rv DNA浓度在1000 fg条件下，用本发明方法 和试剂盒检测的结果，2表示待检菌株H37Rv DNA浓度在1000 fg条件下，用商品化新鲜样本 结核检测试剂盒（进口）检测的结果。
【具体实施方式】
[0023] 实验试剂：
[0024] PCR 反应液（货号 R007A)、dUTP、MgCl2、UNG 酶、Taq 酶，均购自大连 Takara 公司； 石蜡组织提取试剂盒，购自Qiagen公司。
[0025] 实施例1本发明检测试剂盒和检测方法
[0026] 一、本发明试剂盒的组成
[0027] PCR扩增试剂（50人份）：
[0028]
[0029] Primer 1 :上游引物（F)为：5'-TGG CCA TGC TCT TGA TGC-3'（SEQ ID NO. 1);下 游引物（R)为：5' -CAA ACA AAA CCC AAA CAC TCC C-3'（SEQ ID NO. 2);
[0030] FAM 标记的 Taqman 荧光探针 1 引物序列为 5' -CAGGATATTTCTAAATACCTTTGGCTCCCT -3' (SEQ ID NO. 5)；
[0031] Primer 2 :上游引物（F)为：5'-GACCTACTACGACCACATCAA-3'（SEQ ID NO. 3);下游 引物（R)为：5'-TCAGGGTTAGCCACACTTT-3'（SEQ ID N0.4);
[0032] FAM 标记的 Taqman 荧光探针 2 引物序列为：5' -ATGGCGAACTCAAGGAGCACATCA-3 (S EQ ID NO. 6) 〇
[0033] 二、采用本发明试剂盒检测
[0034] 1、样本DNA提取：可以使用Qiagen公司、天根公司、Promega公司等
[0035] 石蜡组织提取试剂盒，本例以Qiagen公司为例，提取DNA :
[0036] 利用手术刀取出组织边界无用的石蜡；
[0037] 将石蜡包埋组织切成4 μ m厚的薄片；
[0038] 迅速用灭菌小镊子取2-6枚装入DNase/RNase Free EP管中（每张摊开面积 500 (最大）mm2，即边长I. 6cm的正方形大小；
[0039] 加入800 μ 1二甲苯，振荡器上震荡10s，最大转数