用于检测艾滋病治疗药物ddi和tdf耐药突变位点的引物对和探针及其应用
【专利说明】用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的引物 对和探针及其应用
[0001]
技术领域
[0002] 本发明属于生物医药领域，涉及一种用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突 变位点的引物对和探针，还涉及上述引物对和探针在检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药 突变位点中的应用。 技术背景
[0003] 世界上流行的艾滋病大多数是由HIV-I引起的。HIV-I基因组包含gag、pol和env 三个结构基因和tat、rev、nef、vpr、vif、vpu 6个调苄基因，在5'末端和3'末端为长重复 序列（LTR)。Pol基因编码蛋白酶、整合酶和逆转录酶，这三个病毒主要蛋白酶用于蛋白前 体的成熟、病毒基因组RNA的逆转录和病毒cDNA在宿主基因组DNA上的整合。
[0004] 目前市场上已流通30余种抗HIV-I药物用于艾滋病的临床治疗。由于HIV-I的 逆转录酶在复制过程中没有校正功能又复制迅速，从而使得HIV-I易于进化、遗传多样性 广泛，为HIV-I的耐药突变迅速产生提供了先决条件。目前，对应于每种临床使用的HIV-I 治疗药物都有其相应的耐药突变的产生。
[0005] 地达诺新（DDI)和富马酸替诺福韦酯（TDF)是目前常用的两种HIV核苷类逆转录 酶抑制剂（NRTIs )，但是由于耐药突变的产生大大降低了这两种药物的有效性。研宄已经 证明引起DDI和TDF耐药产生的主要耐药突变是pol结构基因的K65R，K70E和Q151M三种 突变。
[0006] 现阶段应用于检测HIV-I耐药突变的方法主要是PCR产物直接测序法。由于该方 法检测周期较长，费用昂贵，非封闭操作，难于避免交叉污染，并且由于DNA直接测序存在 的灵敏度较低，杂合突变等问题，使得很难通过一次测序获得精确的数据，需要多次重复测 序才可能避免假阳性等问题，因此直接测序方法很难适用于临床检测。
[0007] 随着艾滋病治疗过程中耐药情况的日益加重，临床上迫切需要开发出能够快速、 准确、操作简便和避免交叉污染的Hiv-I耐药突变检测方法，用于满足临床用药和检测诊 断方面的时效性及个体化医疗方面的要求。
【发明内容】
[0008] 本发明的目标是为解决现有技术检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的 方法存在的灵敏度低、特异性差、操作繁琐、检测成本高、花费时间长等问题，本发明提供了 一种灵敏度高、特异性好、检测成本低、快速、简单的艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位 点的荧光定量PCR检测试剂盒，还提供了一种检测试剂盒的使用方法。
[0009] 技术方案：本发明提供了用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的引 物对和探针，包括检测HIV-I病毒RNA的pol基因的第65位、70位和151位突变位点K65R、 K70E和Ql5IM的ARMS引物对和Taqman探针； K65R的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示 的核苷酸序列，Taqman探针为SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQl标记5' 端和3'端； K70E的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 2所示 的核苷酸序列，Taqman探针为SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，分别用HEX和BHQl标记5' 端和3'端； Q151M的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所 示的核苷酸序列，Taqman探针为SEQ ID No. 7所示的核苷酸序列，分别用ROX和BHQl标记 5'端和3'端。
[0010] 本发明还提供了另一种用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的引物 对和探针，包括检测HIV-I病毒RNA的pol基因的第65位突变位点K65R的ARMS引物对和 Taqman 探针； K65R的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示 的核苷酸序列； ARMS引物对的Taqman探针为SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，分别用FAM和BHQl标 记5'端和3'端。
[0011] 本发明还提供了另一种用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的引物 对和探针，包括检测HIV-I病毒RNA的pol基因的第70位突变位点K70E的ARMS引物和 Taqman 探针； K70E的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别为SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 2所示 的核苷酸序列； ARMS引物对的Taqman探针为SEQ ID No. 3所示的核苷酸序列，分别用HEX和BHQl标 记5'端和3'端。
[0012] 本发明还提供了另一种用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的引物 对和探针，包括检测HIV-I病毒RNA的pol基因的第151位突变位点Q151M的ARMS引物和 Taqman 探针； Q151M的ARMS引物对的上游引物和下游引物分别SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 6所示的 核苷酸序列； ARMS引物对的Taqman探针为SEQ ID No. 7所示的核苷酸序列，分别用ROX和BHQl标 记5'端和3'端。
[0013] 本发明还提供了上述引物对和探针在检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位 点中的应用。
[0014] 本发明还提供了一种用于检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的试剂 盒，包括权利要求上述ARMS引物对和探针。
[0015] 优选地，所述试剂盒还包括RT-PCR混合液、混合酶液、阳性对照品混合液、阴性对 照品混合液；所述RT-PCR混合液包括RT-PCR缓冲液、dNTPs、MgCl 2、3对上下游引物及3条 探针；所述混合酶液包括M-MLV逆转录酶和Taq DNA聚合酶。
[0016] 更优选地，所述试剂盒中各组分含量分别为： RT-PCR 混合液 875uL ; 混合酶液 125 uL ; 阳性质控品 45 uL ; 阳性对照品混合液 45 uL ; 阴性对照品混合液 45 uL。
[0017] 更优选地，所述试剂盒中： 所述RT-PCR混合液包括： RT-PCR 缓冲液（20mM Tris-Hcl, IOOmM NaCl，ρΗ8· 3)终浓度 IX ; dNTPs终浓度3mM ; MgCl2终浓度为L 6mM ; 各ARMS引物对的上、下游引物的终浓度均为200nM ;各ARMS引物对的Taqman以及试 剂盒质控品引物对的Taqman探针终浓度均为300nM ; 所述混合酶液包括： M-MLV逆转录酶终浓度2U/ μ L ; TaqDNA聚合酶终浓度0· 05U/ μ L ; 所述阳性对照品混合液中模板cDNA终浓度0. 1~IOng/ μ L。
[0018] 本发明还提供了上述试剂盒在检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点中的 应用，包括以下步骤： (1) 总RNA提取：提取待测样本的RNA，提到模板RNA溶液； (2) 反应组分配制：分别配制检测混合物、阳性对照品混合物和阴性对照品混合物；其 中，检测混合物按PCR混合液17. 5uL、混合酶液2. 5uL、模板RNA溶液5uL配制一人份；阳性 对照品混合物按PCR混合液17. 5uL、混合酶液2. 5uL、阳性对照品混合液5uL配制一人份； 阴性对照品混合物按PCR混合液17. 5uL、混合酶液2. 5uL、阴性对照品混合液5uL配制一人 份； (3 )扩增：分别将检测混合物、阳性质控品混合物、阳性对照品混合物和阴性对照品混 合物放入荧光定量PCR仪扩增，按以下程度进行扩增：
(4)结果判定：根据荧光信号到达设定阈值所经历的循环数Ct值判定结果：当阳性对 照品的Ct值小于等于35,或者检测混合物为阳性时，试剂盒有效；当阳性对照品的Ct值大 于35,或者检测混合物无 Ct值时，试剂盒无效或需重复检测。
[0019] 其中，步骤（4)中，根据检测混合物的Ct值定性判定，依据为：Ct > 40时，待测 样本中无 HIV治疗药物DDI和TDFF耐药突变；35 < Ct < 40时，待测样本可疑，需重检一 次，重检结果如Ct > 40或无扩增曲线，则为待测样本中无 HIV治疗药物DDI和TDFF耐药 突变，反之则为待测样本中有HIV治疗药物DDI和TDFF耐药突变；Ct < 35时，待测样本中 有HIV治疗药物DDI和TDFF耐药突变产生。
[0020] 所述的检测艾滋病治疗药物DDI和TDF耐药突变位点的方法是RT-ARMS-Taqman qPCR法，该方法基于实时定量PCR平台，利用ARMS引物对突变靶序列进行特异性PCR扩 增，Taqman探针对扩增产物进行特异性位点检测，在Real-time PCR基础上鉴定特定突变。
[0021] 有益效果：本发明公开的基于RT-ARMS-Taqman qPCR技术检测HIV-I耐药物DI 和TDF突变位点的方法，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、快速、成本低等优点。设计的 ARMS弓丨物只针对基因突变序列，能特异性扩增突变模板RNA，在ARMS引物的3'向5'端1-2 位设计两个错配碱基，可以增加 ARMS引物的特异性，本发明设计的Taqman探针针对目的基 因正义连的突变位点设计，特异地结合突变模板RNA，设计的ARMS引物只针对基因特异突 变序列，能特异性扩增突变模板RNA，从而达到对微量突变模板的富集作用，提高检测灵敏 度，本发明公开的方法检测基因突变灵敏度可以达到1% (即目的基因的突变基因 RNA模板 数占野生型RNA模板数的1%)，而直接测序法检测基因突变的灵敏度为10%(即目的基因的 突变基因 RNA模板数占野生型RNA模板数的10%)，检测过程为闭管反应，减少污染的可能 性，操作简单快速，整个PCR反应过程只有90分钟，结果判读明确客观，只需根据PCR仪器 上的数据即可完成对样本基因类型的判读，同时本发明还具有安全性高，整个体系不包含 有毒有害物质，无需PCR产物的开管，对试验人员以及环境都无危害。
【附图说明】
[0022] 图1为以含有K65R点突变的合成突变型pol RT基因为模板，用不同稀释比例 进行PCR扩增，检测DDI和TDF两个主要耐药突变位点K65R，K70E和Q15IM突变型的 RT-ARMS-Taqma