一种用于筛选和评价艾滋病治疗药物的毒株试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明设及一种用于筛选和评价艾滋病治疗药物的毒株试剂盒。
【背景技术】
[0002] 人免疫缺陷病毒（Humanimmunodeficiencyvirus,HIV)是引起人类获得性免疫 缺陷综合征（Acquiredimmunodeficiencysyn化ome，AID巧的病原体。自1981年美国首 次诊断出艾滋病W来，艾滋病在全球范围内迅速传播。2014年7月UNAIDS的最新报告显 示，全球HIV感染人数已达3500万，2013年，中国新诊断HIV感染者63498例，估计中国目 前有存活的HIV感染者78万人。
[0003]HIV-1蛋白酶是天冬氨酸蛋白酶，由两个长度均为99个氨基酸的同质二聚体组 成。HIV-1蛋白酶主要作用于病毒翻译之后，对gag和gag-pol蛋白多聚体进行剪切，产生 结构蛋白和一些酶类物质。蛋白酶的疏水性底物结合位点可W识别并裂解9种不同的多 肤，从而形成成熟的衣壳、病毒颗粒W及来源于gag蛋白多聚体的p6蛋白和来源于gag-pol 蛋白多聚体的蛋白酶、逆转录酶和整合酶。像其他天冬氨酸蛋白酶一样，HIV-1蛋白酶活性 位点含有保守的S个氨基酸组成的S联体（Asp-T虹-Gly，第25至27位氨基酸）。一旦底 物与第46至56位氨基酸残基结合，蛋白酶活性位点上方的柔性发卡结构（flaps)就呈闭 合状态。
[0004] 在HIV-1的整个生命周期中，病毒前体蛋白的裂解是感染性病毒颗粒包装成熟的 关键一步。蛋白酶抑制剂阻断蛋白酶所介导的病毒颗粒的成熟过程，祀点是野生蛋白酶。蛋 白酶抑制剂是截至目前最有潜力的抗逆转录病毒抑制剂，也是唯一一类单一药物治疗效果 也优于联合治疗效果的抗HIV-1药物。
[0005] 目前共有9种蛋白酶抑制剂通过美国食品药品监督管理局（Foodand化ug a血inistration，抑A)批准；沙奎那韦（saquinavir,SQV)、巧地那韦（indinavir, IDV)、利托那韦（ritonavir,RTV)、奈非那韦（nelfinavirmes}date，NFV)、福司安普那 (FosamprenavirCalcium,F0S-APV)、安扎那韦（atazanavirsulfate,ATV)、替派那韦 (tipranavir，TPV)、达如那韦（darunavir，DRV)和克立芝（lopinavir/ritonavir，LPV/ RTV)。
[0006] 目前纳入我国抗HIV免费治疗名录的药物约有9种（克力芝是唯一一种免费蛋白 酶抑制剂），其中大多为专利过期的仿制药物，品种少，且毒副作用大，无法满足临床需求。 因此，立足自主创新，研发具有自主知识产权的治疗艾滋病等重大疾病的原创性药物，为国 民提供安全有效和廉价的药物，成为了重中之重。鉴于W上提到的蛋白酶抑制剂的特点，国 内蛋白酶抑制剂的研发也成为国内众多生物制药公司的热点。新药研发是个漫长的过程， 而临床前药效学研究是新药研发的基础，也是判断候选药物是否具有研发前景W及确定下 一步研究方向的重要依据。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种用于筛选和评价艾滋病治疗药物的毒株试剂盒。
[0008] 本发明提供了一种试剂盒，包括如下7个重组HIV病毒；HIV-M46I病毒株、 HIV-I54V病毒株、HIV-V82A病毒株、HIV-M46I/N88S病毒株、HIV-G48V/I54V病毒株、 HIV-M46I/V82T/I84V病毒株和HIV-G48V/I54V/V82A病毒株；
[0009]HIV-M46I病毒株，是将野生型HIV病毒的基因组中编码蛋白酶自N末端第46位氨 基酸残基的密码子由甲硫氨酸的密码子突变为异亮氨酸的密码子，得到的重组HIV病毒；
[0010]HIV-I54V病毒株，是将野生型HIV病毒的基因组中编码蛋白酶自N末端第54位氨 基酸残基的密码子由异亮氨酸的密码子突变为鄉氨酸的密码子，得到的重组HIV病毒；
[0011]HIV-V82A病毒株，是将野生型HIV病毒的基因组中编码蛋白酶自N末端第82位氨 基酸残基的密码子由鄉氨酸的密码子突变为丙氨酸的密码子，得到的重组HIV病毒；
[0012] HIV-M46I/N88S病毒株，是将野生型HIV病毒的基因组中编码蛋白酶自N末端第 46位氨基酸残基的密码子由甲硫氨酸的密码子突变为异亮氨酸的密码子、第88位氨基酸 残基的密码子由天冬酷胺的密码子突变为丝氨酸的密码子，得到的重组HIV病毒；
[0013]HIV-G48V/I54V病毒株，是将野生型HIV病毒的基因组中编码蛋白酶自N末端第 48位氨基酸残基的密码子由甘氨酸的密码子突变为鄉氨酸的密码子、第54位氨基酸残基 的密码子由异亮氨酸的密码子突变为鄉氨酸的密码子，得到的重组HIV病毒；
[0014] HIV-M46I/V82T/I84V病毒株，是将野生型HIV病毒的基因组中编码蛋白酶自N末 端第46位氨基酸残基的密码子由甲硫氨酸的密码子突变为异亮氨酸的密码子、第82位氨 基酸残基的密码子由鄉氨酸的密码子突变为苏氨酸的密码子、第84位氨基酸残基的密码 子由异亮氨酸的密码子突变为鄉氨酸的密码子，得到的重组HIV病毒；
[0015] HIV-G48V/I54V/V82A病毒株，是将野生型HIV病毒的基因组中编码蛋白酶自N末 端第48位氨基酸残基的密码子由甘氨酸的密码子突变为鄉氨酸的密码子、第54位氨基酸 残基的密码子由异亮氨酸的密码子突变为鄉氨酸的密码子、第82位氨基酸残基的密码子 由鄉氨酸的密码子突变为丙氨酸的密码子，得到的重组HIV病毒。
[0016] 所述野生型HIV病毒为HIV-1B亚型抑L4. 3野生株。所述HIV-1B亚型抑L4. 3野 生株的基因组DNA如序列表的序列1所示。
[0017] 所述HIV-M46I病毒株是将重组质粒M46I导入离体的哺乳动物细胞并培养哺乳动 物细胞得到的；所述重组质粒M46I为将如下DNA分子插入表达载体的多克隆位点得到的重 组质粒：将野生型HIV病毒的基因组中编码蛋白酶自N末端第46位氨基酸残基的密码子由 甲硫氨酸的密码子突变为异亮氨酸的密码子。所述重组质粒M46I具体可为实施例中的重 组质粒抑L4. 3-M46I。
[0018] 所述HIV-I54V病毒株是将重组质粒I54V导入离体的哺乳动物细胞并培养哺乳动 物细胞得到的；所述重组质粒I54V为将如下DNA分子插入表达载体的多克隆位点得到的重 组质粒：将野生型HIV病毒的基因组中编码蛋白酶自N末端第54位氨基酸残基的密码子由 异亮氨酸的密码子突变为鄉氨酸的密码子。所述重组质粒I54V具体可为实施例中的重组 质粒抑L4. 3-I54V。
[0019] 所述HIV-V82A病毒株是将重组质粒V82A导入离体的哺乳动物细胞并培养哺乳动 物细胞得到的；所述重组质粒V82A为将如下DNA分子插入表达载体的多克隆位点得到的重 组质粒：将野生型HIV病毒的基因组中编码蛋白酶自N末端第82位氨基酸残基的密码子由 鄉氨酸的密码子突变为丙氨酸的密码子。所述重组质粒V82A具体可为实施例中的重组质 粒抑L4. 3-V82A。
[0020] 所述HIV-M46I/N88S病毒株是将重组质粒M46I/N88S导入离体的哺乳动物细胞并 培养哺乳动物细胞得到的；所述重组质粒M46I/N88S为将如下DNA分子插入表达载体的多 克隆位点得到的重组质粒；将野生型HIV病毒的基因组中编码蛋白酶自N末端第46位氨基 酸残基的密码子由甲硫氨酸的密码子突变为异亮氨酸的密码子、第88位氨基酸残基的密 码子由天冬酷胺的密码子突变为丝氨酸的密码子。所述重组质粒M46I/N88S具体可为实施 例中的重组质粒抑L4. 3-M46I/N88S。
[0021] 所述HIV-G48V/I54V病毒株是将重组质粒G48VI54V导入离体的哺乳动物细胞并 培养哺乳动物细胞得到的；所述重组质粒G48V/I54V为将如下DNA分子插入表达载体的多 克隆位点得到的重组质粒；将野生型HIV病毒的基因组中编码蛋白酶自N末端第48位氨基 酸残基的密码子由甘氨酸的密码子突变为鄉氨酸的密码子、第54位氨基酸残基的密码子 由异亮氨酸的密码子突变为鄉氨酸的密码子。所述重组质粒G48V/I54V具体可为实施例中 的重组质粒抑L4. 3-G48V/I54V。
[0022] 所述HIV-M46I/V82T/I84V病毒株是将重组质粒M46I/V82T/I84V导入离体的哺乳 动物细胞并培养哺乳动物细胞得到的；所述重组质粒M46I/V82T/I84V为将如下DNA分子插 入表达载体的多克隆位点得到的重组质粒：将野生型HIV病毒的基因组中编码蛋白酶自N 末端第46位氨基酸残基的密码子由甲硫氨酸的密码子突变为异亮氨酸的密码子、第82位 氨基酸残基的密码子由鄉氨酸的密码子突变为苏氨酸的密码子、第84位氨基酸残基的密 码子由异亮氨酸的密码子突变为鄉氨酸的密码子。所述重组质粒M46I/V82T/I84V具体可 为实施例中的重组质粒抑L4. 3-M46I/V82T/I84V。
[0023] 所述HI