] (7)弃上清，加200 yL 70%的无水乙醇，离心5min ;
[0047] (8)弃上清，加200 μ L 70%无水乙醇，离心5min
[0048] (9)弃上清，转移至超净工作台风干；
[0049] (10)加入无菌水200 μ L溶解；-20°C冰箱备用。
[0050] 4.选用10份材料Ty_3a抗病基因的检测：
[0051] 反应体系及反应程序：PCR反应总体系为25 μ L，包括：模板DNA 2 μ L，引物 1.5yL，10XBuffer 2.5yL，Mgcl2 1.5yL，dNTP 0.5yL，Taq 酶 0.5yL，补充超纯水 至25 μ L ;PCR反应程序为94°C预变性5min ;然后94°C变性30s，58. 5°C复性30s，72°C延 伸45s，进行35个循环；最后72°C延伸lOmin。PCR扩增产物在I. 5%琼脂糖凝胶上电泳 (Goldview染色），然后用Bio-RAD凝胶成像仪成像。
[0052] 检测结果：编号为1、9、10的番茄材料扩增出650bp特异片段，为抗病纯合材料； 编号为2、3、4号的番茄材料扩增出320bp特异片段，为感病纯合材料；编号为5、6、7、8号的 番茄材料扩增出650bp和320bp特异片段，为抗病杂合材料。说明该体系能够检测抗病纯 合、抗病杂合和感病纯合材料（如图1所示）。
[0053] 5.选取10份材料Tm-2m病基因的检测
[0054] 反应体系及反应程序：反应体系为20 μ L，包括超纯水15. 9 μ L，IOXPCR Buffer 2· 0 μ L，dNTPs 0· 5 μ L，引物 I. 0 μ L，Taq DNA 聚合酶 0· 1 μ L，模板 DNA 0· 5 μ L。PCR 热循 环程序：94°C预变性5min ;然后94°C变性lmin，58°C复性lmin，72°C延伸80s，进行32个循 环；最后72°C延伸8min。PCR产物用I. 5%琼脂糖凝胶电泳，然后用Bio-RAD凝胶成像仪成 像。
[0055] 检测结果：材料1、3、4、7、8、9扩增出472bp的片段，表明这6份材料含有Tm-2a抗 病基因，2、5、6、10没有扩增出472bp的片段，表明这4份材料不含有Tm-2a抗病基因（如图 2所示）
[0056] 6.利用双重PCR方法同时检测10份材料Ty-3a和Tm-2^t病基因
[0057] 反应体系及反应程序：双重PCR反应总体系为25 μ L，包括：模板DNA 2 μ L，两对 引物各 1. 5 μ L, 10 X Buffer 2. 5 μ L，Mgcl2 1. 5 μ L，dNTPO. 4 μ L，Taq 酶 0· 4 μ L，补充超纯 水 25 yL。94°C预变性 5min ;然后 94°C变性 30s，58. 5°C复性 30s，72°C延伸 I. 30min，进行 30个循环；最后72°C延伸IOmin。
[0058] PCR扩增产物在1. 5%琼脂糖凝胶上电泳，然后用Bio-RAD凝胶成像仪成像。
[0059] 检测结果：双重PCR对10份材料的鉴定结果，与基因 PCR鉴定结果完全一致，说 明本双重PCR鉴定方法是可靠的，具体结果如下：编号为1、9的番茄材料扩增出了 650bp、 472bp的特异片段，同时含有Ty-3a和Tm-2a基因，为抗黄化曲叶病毒病和抗烟草花叶病毒 病的材料；编号为2的番茄材料只扩增出了 320bp的特异片段，不含Ty-3a* Tm-2a基因， 为感病纯合材料，不含有两个抗病基因；编号为3、4的番茄材料扩增出了 472bp、320bp的特 异片段，含有Tm-2a基因，但不含Ty-3a基因，为抗烟草花叶病、感黄化曲叶病的纯合番茄材 料；编号为5、6的番茄材料扩增出了 650bp、320bp的特异片段，说明含有Ty-3a抗病基因， 不含Tm-2^t病基因，为抗黄化曲叶病、感烟草花叶病的番茄材料；编号为7、8的番茄材料 扩增出了 650bp、472bp、320bp三条特异片段，说明材料含有Ty-3a和Tm-2a基因，为抗黄化 曲叶病和烟草花叶病的番茄材料；编号为10的番茄材料只扩增出了 650bp的特异片段，含 有Ty-3a不含Tm-2a基因，为纯合的抗黄化曲叶病、感烟草花叶病的番茄材料，如图3所示。 上述结果表明：利用双重PCR技术检测结果与单基因 PCR检测结果是一致的，均扩增出各个 引物的目标条带，因此可以利用该双重PCR反应体系同时鉴定Ty-3a、Tm-2a基因。
[0060] 7.利用双重PCR方法检测19份未知抗病性的番茄材料
[0061] 利用双重PCR方法对19份番茄材料进行抗性鉴定，结果如图4所示。编号为11、 16、17、20、22、23的材料只扩增出320bp的片段。为不含两个抗病基因的感病材料；编号为 12、13、18、21、24、25、28的材料扩增出472bp、320bp的片段，说明这些材料含Tm-2 a基因但 不含Ty-3a基因；编号为14、15、26、27的材料只扩增650bp的片段，说明材料含有Ty-3a纯 合抗病基因而不含Tm-2 a基因；编号为19、29的材料同时检测出650bp、472bp、320bp三个 片段，说明这两份材料对两种病害都有抗病性。本试验说明该方法可用于两个抗病基因的 检测。
【主权项】
1. 一种同时检测番茄抗病基因Ty-3a和Tm-2a的双重PCR方法，其特征在于：该方法 通过引物设计、基因组DNA的提取、双重PCR反应体系的建立、反应产物的凝胶成像检测步 骤，确定番茄育种试材对这两个抗病基因的抗性情况，以选择抗病材料和选育抗病品种，具 体两个抗病基因的双重PCR鉴定方法包括下列步骤： (1) 根据Ty_3a和！'!11-23两个抗病基因分子标记的引物序列设计引物，引物序列如下 表：(2) 利用CTAB法提取基因组DNA; (3) 将两对引物放入同一PCR反应体系中，进行PCR扩增； (4) 将PCR产物进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳，再用Bio-RAD凝胶系统成像； (5) 对扩增片段进行分析：扩增出650bp片段为含有抗病基因Ty-3a的抗病纯合材料， 扩增出650bp和320bp片段为含有抗病基因Ty-3a的抗病杂合材料，扩增出320bp片段为 不含抗病基因Ty-3a的纯合感病材料，扩增出472bp片段为含有抗病基因抗病材 料。2. 根据权利要求1所述同时检测番茄抗病基因Ty-3a和Tm-2a的双重PCR方法，其特征 在于：所述双重PCR反应总体系为25yL溶液体系，其组分和含量为：模板DNA2yL，两对引 物各 1. 5yL,lOXBuffer2. 5yL，Mgcl2l. 5yL，dNTPO. 4yL，Taq酶（DNA聚合酶）0? 4yL， 补充超纯水至25yL。3. 根据权利要求1所述同时检测番茄抗病基因Ty-3a和Tm-2a的双重PCR方法，其特 征在于：所述PCR反应体系按照如下程序进行双重PCR反应：94°C预变性5min;然后94°C 变性3〇8,58.5°0复性3〇8,72°0延伸1.3〇1^11，进行30个循环；最后721：延伸1〇111111。
【专利摘要】一种同时检测番茄抗病基因Ty-3a和Tm-2a的双重PCR方法，包括如下步骤：1.根据Ty-3a和Tm-2a两个抗病基因分子标记的引物序列设计引物；2.CTAB法提取基因组DNA；3.将两对引物放入同一PCR反应体系中，进行PCR扩增；4.将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，再用Bio-RAD凝胶系统成像。5.对扩增结果进行分析，明确材料是否含有Ty-3a、Tm-2a抗病基因。本发明双重PCR技术有以下优点：1.在一个PCR反应体系中同时检测两个抗病基因，所用时间只是分别检测两个抗病基因的一半，提高的基因检测效率。2.能够节约抗病基因检测所需要的药品，降低了试验成本。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104911265
【申请号】CN201510300231
【发明人】张子君, 邹庆道, 马小青, 王晓峰, 李海涛, 张逸鸣, 朱华
【申请人】辽宁省农业科学院蔬菜研究所
【公开日】2015年9月16日
【申请日】2015年6月3日