专利名称：一种检测槟榔黄化病植原体病原的方法及其专用试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测槟榔黄化病植原体病原的方法及其专用试剂盒，适合于检 疫、农业生产、植物保护等部门使用。
背景技术：
槟榔"recaca"ecw L.)是我国重要的南药资源之一，据海南省农业厅统计， 截至2006年底，海南省槟榔种植面积达5.31万公顷，收获面积2.33万公顷，总 产量7.48万吨，产值18亿元以上。
槟榔黄化病是一种毁灭性病害，最早在印度的Kerala中部发生，到20世纪60 年代，印度Kerala邦的Quilon地区槟榔黄化病已经普遍发生。1981年，槟榔黄化 病首次在我国海南省药材场(屯昌县)发现；上世纪90年代初，海南岛内的部分槟 榔种植区相继开始发现黄化病的为害；据2006年调査，槟榔黄化病除在海南屯昌县 发生外，已蔓延到琼海、万宁、陵水、三亚、保亭等县市的成片槟榔园中，严重威 胁着海南省槟榔产业的发展。
槟榔黄化病在田间的症状表现为发病初期，植株下部倒数第2~4张羽状叶片 外缘l/4开始出现黄化，抽生的花穗较正常植株短小，无法正常展开，结果量大大 减少，常常提前脱落，减产70~80%，少量存留的果实品质严重降低，无法食用。节 间縮短，感病植株叶片黄化症状逐年加重，干旱季节黄化症状更为突出，整株叶片 无法正常舒展生长，解剖可见病叶叶鞘基部刚形成的小花苞水渍状败坏，严重时呈 暗黑色，花苞基部有浅褐色夹心；感病后期病株根茎部坏死腐烂，大部分感病植株 开始表现黄化症状后5 7年枯顶死亡。槟榔生理性黄叶是由于槟榔园管理不善，缺 肥或干旱引起，槟榔叶片发黄现象呈现区域性，成片发生， 一般是下部叶片均匀黄 化，严重的干枯死亡，而黄化病则有明显的发病中心，即在槟榔园开始发病时仅少 量植株有黄化的表现。通过大田流行规律调査、电子显微镜观察、四环素族抗菌素 注射诊断等研究表明，植原体(Phytoplasraa)是导致海南槟榔发生黄化病的病原(罗 大全，陈慕容，叶沙冰，蔡希灼.海南槟榔黄化病的病原鉴定研究.热带作物学 报，2001， 22(2) : 43—46.)。
植原体 (phytoplasraa), 原禾尔类菌原体(mycoplasma-like organism, MLO)，为单细胞原核生物，无细胞壁，由生物膜包围，隶属于细菌界(Bacteria), 硬壁菌门(Firmicutes)，柔膜菌纲(Mollicutes)(又称软球菌纲)，非固醇菌原体目(Achol印lasmatales)，非固醇菌原体科 (Achol印lasmataceae)。定殖于植物韧皮部筛管以及刺吸式介体昆虫的肠道、淋巴、 唾腺等组织内，植原体通常在植物体中含量较低，难以人工培养，且分布不均匀。 研究者们根据植原体的16SrDNA序列对植原体进行分类，将已报道的植原体分为14 个组38个亚组，其中翠菊黄化组(AY组，16Sr I)是植原体中包含植原体数量最多 的组，被分为6个亚组，(Lee I M， Davis R E, Gundersen國Rindal D E. Phytoplasma: Phtopathogenic Mollicutes. ^4朋wa/ Aev/ew M/cro6/o/ogy, 2000, 54: 221-255)。
植原体在世界范围内引起多种经济上重要的植物病害，如椰子致死黄化病、 枣疯病等。植原体病害主要通过无性繁殖材料、种苗或昆虫介体传播，很少或不能 种子传毒，目前尚无很好的防治办法，唯有通过设立和建设无病区、加强植物检疫 严防病害蔓延和扩散，因此病害的早期诊断和疫情监测对于病害的检验检疫和防范 控制具有重要意义。植原体病害的检测目前主要有电子显微镜法，组织化学技术， 血清学方法，核酸杂交技术，PCR技术等，特别是根据16SrDNA设计广谱引物和特 异性引物对植原体进行PCR检测，已被广泛应用，在植原体的研究中有了历史性的 进步。但上述这些方法整个过程繁杂，操作步骤多，需要消耗大量的时间，不适合 大批量的样品检测，如琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色，紫外光观察结果或通过聚 丙烯酰胺凝胶电泳和银染检测，如果要鉴定到种或组，还要进行限制性内切酶多态 性分析(RFLP)，或者进行核酸序列测定和同源性比较，不仅需要多种仪器，而且费 时费力，所使用的染色剂溴化乙锭对人体又有害，这些繁杂的实验过程又给污染和 假阳性提供了机会，严重影响对结果的正确判断。
继常规PCR技术之后，实时荧光PCR技术凭借其特异性强、简便迅速、有效 解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，在植物病原物的检测和诊断中得到了广 泛应用。实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，该 技术是利用荧光信号伴随着PCR产物的增加而增强的原理，在PCR扩增过程中， 连续不断的检测反应体系中荧光信号的变化，荧光定量PCR所使用的荧光化学可分 为两种荧光探针(TaqMan， TaqMan MGB和双探针)与荧光染料(SYBR Green 1)。 与TaqMan探针相比，TaqMan MGB探针的原理是在探针的3 '端标记了自身不发 光的无荧光淬灭基团(non-fluorescent quencher,NFQ)，以取代常规可发光的TAMRA 荧光标记，探针的3 '端另结合了小沟结合物(Minor Groove Binder, MGB)，该 方法具有縮短探针长度，提高配对与非配对模板间的Tm值差异，杂交稳定性好， 低背景，提高信噪比等优点。
目前尚未有用于槟榔黄化病植原体病原的实时荧光PCR检测技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速准确的槟榔黄化病植原体病原的检测方法，使槟 榔黄化病在生产上得到有效控制，保障海南槟榔产业的健康发展。
为了使本发明的方法方便实施，利于快速推广，本发明还提供了用于槟榔黄化 病植原体病原检测的探针以及试剂盒。
本发明提供的用于槟榔黄化病植原体病原检测的探针，即用于实时荧光PCR的 方法检测槟榔黄化病植原体病原的TaqManMGB探针，其核苷酸序列为序列表中序 列l。
本发明提供的检测槟榔黄化病植原体病原的实时荧光PCR试剂盒，包括上述用 于槟榔黄化病植原体病原检测的探针和核苷酸序列为序列表中序列2的DNA片段与 核苷酸序列为序列表中序列3的DNA片段组成的引物对。
本发明所提供的检测槟榔植原体感染的方法，是以待测槟榔的总DNA作为模 板，用上述的试剂盒中的引物对为引物，以所述试剂盒中的探针为探针，进行实时 荧光PCR检测，若荧光信号在PCR过程中增强，即荧光信号随着反应循环数递增， 则该植株感染了植原体。
所述实时荧光PCR的反应体系中上、下游引物(核苷酸序列为序列表中序列2 的DNA片段与核苷酸序列为序列表中序列3的DNA片段组成的引物对)的浓度均 优选为650nmol/L。
所述实时荧光PCR的反应体系中探针的浓度优选为230 nmol/L。
本发明的方法利用检测槟榔植原体感染的试剂盒，对未展开的槟榔花苞和心叶 组织损害性取样检测(砍伐表现症状的病株)准确率分别达到100%和80%;对感病 槟榔的非损害性检测(不砍伐表现症状的病株，只取部分组织)表明自根部到顶 部数第2、 3、 5片叶子的检出率分别达到0%、 26.7%、 46.7%和60.0%，故在大田监 测中选用自根部第5片叶子、心叶或花苞作为检测部位，在幼苗检测中选用顶部嫩 叶作为检测部位。
实验证明，本发明的方法与传统巢式PCR电泳检测槟榔黄化病植原体病原的灵 敏度相同，但本发明的方法操作简单，整个检测过程实行自动化控制，只需在加样 时打开一次盖子，其后的过程完全是闭管操作，消除了PCR假阳性污染的机会，无 须PCR后处理，适合批量样品的检测，整个检测过程具有简单、快速、灵敏、准确 的特点。
本发明的方法可以快速监测大田槟榔植株感染黄化病的情况，对成龄槟榔园病 害的发生情况进行普查、检测，及时清除病株，做到早发现和早防范，将其尽快控制并消灭。该方法尤其在槟榔黄化病的传播预防中可起到重大作用，比如通过检测 种苗的带毒情况，切断槟榔黄化病传播的主要途径，即在检验检疫工作中消除种苗 传播具有广阔的应用前景。大田监测和传播预防两种措施相结合可确保槟榔种植业 健康发展，提高农民的收入水平，为海南的经济腾飞和繁荣注入活力，促进社会和 谐和社会稳定具有重要的意义，同时还可以保护生态环境，调节气候、绿化环境， 为改善海南的生态环境，打造生态省奠定一定的基础。
图1为槟榔黄化病样品16SrDNA的PCR扩增产物凝胶电泳电泳检测结果
图2为基于16SrDNA序列构建的槟榔黄化病植原体和16Sr组中代表性的植原
体株系的系统发育进化树
图3为本发明引物/探针组合的实时荧光PCR特异性检测验证
图4为30株感病槟榔植株花苞的实时荧光PCR检测
图5为不同稀释度的槟榔黄化病植原体实时荧光PCR检测
图6为不同稀释度的槟榔黄化病植原体巢式PCR产物的凝胶电泳检测结果
具体实施例方式
下面结合具体实例对本发明做详细说明。下述实施例中的实验方法，如无特殊 说明，均为常规方法。ra。DNA聚合酶，TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver. 2. 0， pMD18-T载体和￡ co"' Competent Cell DH5a菌株均购自TaKaRa公司， TaqMan Universal PCR Master Mix购自美国Applied biosystem公司(ABI)，实 时荧光PCR用引物和探针由美国Applied biosystem公司(ABI)合成，其他引物均 由上海英俊生物技术有限公司合成，序列测定均委托上海英俊生物技术有限公司完 成。
实施例1、槟榔黄化病植原体16SrDNA序列的获得及其分类地位的确定 1、槟榔花苞总DNA的提取
采集表现典型黄化症状的槟榔黄化病植株样品，槟榔黄化病按照罗大全等(罗 大全,陈慕容,叶沙冰,蔡希灼.海南槟榔黄化病的病原鉴定研究.热带作物学报，2001, 22(2): 43-46.)所述方法鉴定，其中，采自海南屯昌(3株)Dcl、 Dc2、 Dc5;定安 (3株)Da2、 、 Da3、 Da5;琼海(3株)Qh21、 Qh22、 Qh23;万宁(3株) Wnl、 Wn2、 Wn3;三亚(3株)Syl5、 Sy21、 Sy22;健康样品采自海南儋州。 参照Lee等(Lee I M， Davis R E, Hiruki C. Genetic interrelatedness among clover proliferation mycoplasmalike organisms(MLOs) and other MLOs investigated by nucleic acid hybridization and restriction fragment length polymorphism analyses. Appllied andenvironmental Microbiology. 1991, 57(12): 3565-3569.)的方法提取上述样品的花苞总 DNA。
2、 PCR扩增及电泳检测
根据Gundersen (Gundersen D E, Lee I M. Ultrasensitive detection of phytoplasmas by nested隱PCR assays using two universal primer pairs.尸/^topflfAo/og/a Afet//te/7Ymefl. 1996,35,144-151.)和Lee (Lee I M, Hammond R W, Davis R E， et a 1. Universal amplification and analysis of pathogen 16S rDNA for classification and identification of mycoplasmalike organisms. PtytopaAo/ogy ， 1993, 83, 834-842.)等报道的引物进行巢 式PCR扩增植原体16SrDNA基因片段序列。R16mF2/R16mRl作为第一对引物，以 上述提取的总DNA为模板；R16F2/R16R2作为第二对引物，以第一次PCR产物稀 释50倍后的样品为模板。进行巢式PCR(nested-PCR)扩增。以健康槟榔植株花苞 总DNA为阴性对照，以双蒸水为空白对照。引物序列如下
R16mF2: 5 '國CATGCAAGTCGAACGGA-3 ';
R16mRl: 5 ' -CTTAACCCCAATCATCGAC-3 ^ ;
R16F2 : 5 ' -ACGACTGCTAAGACTGG-3 ';
R16R2 : 5 ' -GCGGTGTGTACAAACCCCG-3 '。
第一次和第二次PCR的反应体系和反应条件相同。PCR的反应体系如下
DNA模板2.0^1，正向引物(10 pmol/L)2.0 nl，反向引物(10 |imol/L) 2.0 pl， 10xPCR buffer 2.5 pl， 25 mmol/L MgCl2 2.5 pl， 10 mmol/L dNTPs 2.0 pl， 7bg DNA 聚合酶(1U/|liL) 0.2 pl， ddH20 11.8 pl，共25.0 pl。
PCR反应条件先94°C ，预变性2 min;然后94。C变性1 min， 45。C退火45 s， 72。C延伸1 min，共进行30个循环；最后72'C延伸10 min。
反应结束后，取5^PCR产物在lQ^琼脂糖凝胶(含Goldview染料)lxTAE缓 冲系统电泳。在120V电场强度下电泳约20min，检测结果如图1所示(M为Marker DL2000,泳道1 -15依次为表现黄花症状的槟榔Dcl、 Dc2、 Dc5、 Da2、 Da3、 Da5、 Qh21、 Qh22、 Qh23、 Wnl、 Wn2、 Wn3、 Syl5、 Sy21、 Sy22的PCR产物，泳道 16为健康槟榔植株的PCR产物，泳道CK为空白对照)，结果表明表现黄化症状 的槟榔花苞样品总DNA中均扩增到大小约1.2 kb的特异片段，片段大小与Lee等报 道(Lee I M, Hammond R W, Davis R E， et al. Universal amplification and analysis of pathogen 16SrDNA for classification and identification of mycoplasmalike organisms. 户/iytopa决o/ogy , 1993, 83, 834-842.)的相符，而健康植株和双蒸水对照均未出现特异 扩增带。
73、 PCR产物的克隆、测序及序列分析
将Dcl、 Da3、 Qh22、 Wn2和Syl5样品扩增到的特异片段由TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0纯化回收，然后分别与pMD18-T载体连接，转化入 ￡.co// Competent Cell DH5a菌株中，在培养好的平板上挑取白色菌落，放入含250 ml LB液体培养基中，37°C ， 230 r/min培养12 h。然后用OMEGA公司的E.Z.N.A.TM Plasmid Mini Kit I试剂盒抽提质粒，取1 ^质粒抽提液稀释50倍后作为反应模板， 用R16F2和R16R2引物进行PCR扩增，取能扩增出约1.2kb目标条带的质粒(Dcl-l、 Dcl-2、Dcl-3; Da3-l、Da3-2、 Da3陽3; Qh22-1、 Qh22-2、 Qh22-3; Wn2-1、 Wn2-2 、 Wn2-3; Syl5-1、 Syl5-2、 Syl5-3)所对应菌液迸行测序。
结果表明，15个质粒的测序结果相同，其扩增的16SrDNA序列即为序列表中 序列4，该16SrDNA基因扩增片段含有1 237个核苷酸，G + C的含量为47.0%，符 合植原体16SrDNA基因G+C含量要求，将该植原体命名为槟榔黄化病植原体
(Arecanut yellow leaf, AYL)，该扩增得到得具有序列表中序列4所示序列即为槟 榔黄化病植原体(Arecanut yellow leaf, AYL) 16SrDNA。利用国际基因数据库 GenBank中的BLAST程序对测序结果进行同源性检索，槟榔黄化病植原体与16SrI 组中Coneflower phyllody(EU333394)，Periwinkle virescence(DQ381535)、 Paulownia witches'隱broom (AY647461) 、 Paulownia witches'-broom ( FJ263621) 、 Chrysanthemum yellows (AY265214) 、 Tomato big bug (L33760) 、 Wheat blue dwarf (DQ078304)、 Clover phyllody (AY265218) 、 Clover phyllody (AF222066) 、 Blueberry stunt
(AY265220) 、 Apricot chlorotic leaf roll (X68338)和Aster yellows (AY265212) 的亲缘关系较近，达到98.3%~99.8%;与其他16Sr组中的各植原体亲缘关系均在 96.4%以下，利用MEGA4软件分析得出槟榔黄化病植原体和其它21个植原体16S rDNA系统发育进化树，如图2所示，结果表明，AYL与Coneflower phyllody
(EU333394)和Periwinkle virescence (DQ381535)聚类为一个亚组(16SrI-B) 上述结果表明，槟榔黄化病植原体AYL为翠菊黄化组B亚组成员。
实施例2、本发明检测槟榔黄化病植原体病原的探针、试剂盒的制备及它们的 效果验证
1、本发明检测槟榔黄化病植原体病原的探针和引物的设计及试剂盒的制备 本研究以植原体16SrDNA为目标基因进行引物、探针设计，从NCBI中下载所有 已知植原体的16SrDNA序列，用ClustalXl. 81软件进行比对，找出16Srl组内序 列保守而与其他组间序列有稳定性突变的区域，然后用Primer Express version 3. 0软件设计实时荧光PCR引物/TaqMan MGB探针，利用NCBI中的Blast程序(http:〃blast.ncbi.nlra.nih. gov/Blast)分别将正向和反向引物进行比对，未发
现除16Sr I组之外的可以和此对引物配对并引起扩增的物种。序列如下所示 引物序列
上游引物，PbLF: 5 '-GCGAAGGCGGCTTGCT-3 '(序列表中序列2) ， 下游引物，PbLR: 5'-TTTGCT CCCCACGCTTTC-3 ,(序列表中序列3)。 探针序列
bFprobe: 5 ' -FAM-CTTTACTGACGCTGAGGCA-MGBNFQ-3 ' (FAM指荧 光报告基团，MGB指小沟结合物，NFQ指非荧光淬灭基团)(序列如序列表中序 列1所示)。
上述引物PbLF和PbLR，探针bFprobe组成本发明检测槟榔黄化病植原体病原 的试剂盒。根据需要，将探针bFprobe和上下游引物PbLF和PbLR分别配制成溶液， 分别装在试剂瓶中，上游引物和下游引物可以配成相同浓度的溶液，分别或共同装 在试剂瓶中，即得到本发明的试剂盒。试剂盒中探针bFprobe浓度为20 uM， PbLF 和PbLR分别装在一个试剂瓶，浓度均为20uM。
2、实时荧光PCR反应体系优化
实时荧光PCR在ABI 7500型PCR仪上进行，反应条件50 °C 2 rain; 95 °C 10 min; 94 °C 15 s， 60 °C 1 min， 40个循环。
实时荧光PCR反应的原始数据由ABI 7500 PCR仪中Sequence Detection Systems (SDS)软件自动收集。
本实验以实施例1中步骤1所述的Del样品的花苞总DNA为模板。
2.1引物浓度优化
当PCR引物浓度太低时，则产物量降低，会出现假阴性。引物浓度过高会促 进引物的错误引导非特异产物合成，还会增加引物二聚体的形成。非特异性产物和 引物二聚体也是PCR反应的底物，与耙序列竞争DNA聚合酶、dNTP底物，从 而使靶序列的扩增量降低。此步骤的目的是确定能获得最大ARn信和最小Ct信的 最佳引物浓度。将步骤1制备的试剂盒按照上述条件进行实时荧光PCR，反应体系 中探针bFprobe浓度设为150 nM， TaqMan Universal PCR Master Mix 12.5 ^d， 模板DNAl^il;将上下游引物PbLF和PbLR浓度从50 nM至950 nM以100 nM递 增(50nM， 150 nM， 250 nM， 350 nM， 450 nM， 550 nM， 650 nM， 750 nM， 850 nM， 950 nM)设置10个处理，均补无核酸酶水(Nuclease-free water)至25 pl。结 果表明在650nM时产生最大的ARn值和最小Or值，随后ARn值减小和CT值变 大，确定引物最佳终浓度为650nM。
92. 2探针浓度优化
此步骤的目的是确定能获得最大ARn值和最小CT值的最适探针浓度。探针 浓度的大小，会影响ARn值的高低。当探针浓度过小时，PCR产物过量，会干扰 荧光的收集；探针过量时，无足够的PCR产物与探针结合，ARn值降低。浓度实 验中将探针浓度从50 nM至320 nM以30 nM递增(50nM， 80 nM， 110 nM， 140 nM， 170 nM， 200 nM， 230 nM， 260 nM， 290 nM， 320 nM)使用步骤1制备 的试剂盒按照上述PCR反应条件进行实时荧光PCR，其反应体系中PbLF和PbLR浓 度均为650 nM ， TaqMan Universal PCR Master Mix 12.5 (il，模板DNA 1 pl， 均补无核酸酶水(Nuclease-free water)至25 pl。结果表明ARn值在230 nM 时达到最大，确定探针最佳终浓度为230nM。
优化后的实时荧光PCR反应体系为TaqMan Universal PCR Master Mix 12. 5 pi;引物PbLF 650 nM;引物PbLR 650 nM;探针bFprobe 230 nM;模板DNA 1 jal; 补无核酸酶水(Nuclease-free water)至25 |il。
3、 本发明检测槟榔黄化病植原体病原的试剂盒的探针和引物的特异性验证 以如下所述9种植原体样品和5种细菌样品的总DNA为模板，植原体DNA的提
取参考实施1中的提取方法，利用步骤1制备的试剂盒中的引物PbLF/PbLR和 bFprobe探针组合对如下所述9种植原体样品和5种细菌样品进行实时荧光PCR反 应。
1) 植原体翠菊黄化组槟榔黄化病植原体实施例1中步骤1所述的Del样品。
2) 植原体翠菊黄化组苦楝丛枝病植原体罗大全等，海南苦楝丛枝病植原体的
分子鉴定，热带作物学报，2008，4: 522-524;其16SrDNA序列GenBank登录号为 EF990733;中国热带农业科学院环境与植物保护研究所。
3) 植原体翠菊黄化组小麦蓝矮病植原体(Wheat blue dwarf， WBD):顾沛雯 等.小麦蓝矮病植原体16SrDNA基因片段的比较分析.植物病理学
报，2005, (5) :403-411;其16SrDNA序列GenBank登录号为DQ078304;中国热带农 业科学院环境与植物保护研究所。
4) 植原体翠菊黄化组长春花小叶病原菌(Periwinkle little leaf, PLL-Hn): 车海彦等.海南长春花小叶病植原体16SrDNA基因片段的比较分析.热带作物学报， 2008,3:380-384;其16SrDNA序列GenBank登录号EU375834;中国热带农业科学 院环境与植物保护研究所。
5) 植原体花生丛枝组假臭草丛枝病植原体(Praxelis witches' -broom, PrWB): 王真辉等，假臭草丛枝病植原体16SrDNA检测与PCR-RFLP分析.热带作物学报，2007， 28(4) :51-56;其16SrDNA序列GenBank登录号为EF061924，中国热带农业科
学院环境与植物保护研究所。
6) 植原体花生丛枝组猪屎豆丛枝病植原体(Crotalariawitches，broom， CrWB): Wang Z H, " a/. Occurrence of a 16SrII group phytoplasma associated with crotalaria witches' broom in Hainan, China. Plant Pathology. 2008, 57(2): 364;其16SrDNA序列登 录号为EF656453,中国热带农业科学院环境与植物保护研究所。
7) 植原体榆树黄化组酸枣丛枝病植原体(Wild jujube witches-broom， WJWB): 王海妮等，枣疯病和酸枣丛枝病植原体16S rDNA和tuf基因的序列同源性分析.中 国农业科学2007,40(10) :2200-2205;其16SrDNA序列GenBank登录号为DQ886426; 中国热带农业科学院环境与植物保护研究所。
8) 植原体榆树黄化组枣疯病植原体(Jujube witches-broom，JWB):王海妮等， 枣疯病和酸枣丛枝病植原体16SrDNA和tuf基因的序列同源性分析.中国农业科学 2007， 40(10) :2200-2205;其16SrDNA序列GenBank登录号为EU375835;中国热带 农业科学院环境与植物保护研究所。
9) 野油菜黄单胞菌核桃致病变种(Jwz^o/K^as ca/z pesz^z's f尸3MZ7e〗jA MOT): 购自中国林业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为1340。
10) 丁香假单胞菌丁香致病变种(Pseudomonas syringae pv. syringae Van Hall):购自中国林业微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为1335。
11) 根癌土壤杆菌(^ ro&cfe2^咖t鹏e/aci朋s):购自中国林业微生物菌 种保藏管理中心，保藏编号为1379。
12) 胡萝卜软腐菌(Erwinia carotovora vax. carotovora):购自中国普通 微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为1. 1000。
13) 小麦棒形杆菌(67aw'&"er/a/^7'i):购自中国普通微生物菌种保藏管 理中心，保藏编号为1.2001。
实时荧光PCR反应体系为TaqMan Universal PCR Master Mix 12.5 fxl;引 物PbLF 650 nM;引物PbLR 650 nM;探针bFprobe 230 nM;模板DNA 1 pi;补无 核酸酶水(Nuclease-free water)至25 pl。
实时荧光PCR在ABI 7500型PCR仪上进行，反应条件50 °C 2 rain; 95 °C 10 min; 94 °C 15 s， 60 °C 1 min， 40个循环。
实时荧光PCR反应的原始数据由ABI 7500 PCR仪中Sequence Detection Systems (SDS)软件自动收集。
结果表明，利用上述探针和引物进行实时荧光PCR检测结果仅翠菊黄化组植原体有荧光增加的信号，表现为阳性扩增，其检测结果如图4所示。而其它供试菌及 水对照均没有荧光增加的信号，表现为阴性扩增。说明本发明的探针对16Srl组植 原体(翠菊黄化组植原体)有较强的特异性，不仅能区分16Sr I组植原体和其它植 物病原细菌，而且能把16Sr I组和其他组的植原体区分开。
4、 本发明检测槟榔黄化病植原体病原方法的检测限
将实施例1中制备含有槟榔黄化病植原体16SrDNA的质粒Del-2用日本岛津 UV-1700 PharmaSpec型紫外可见分光光度计测定0"值，计算所提取的质粒浓度为 50 ng/VL，通过公式(拷贝数二质量/分子量x6.02x1023)计算得到每pl质粒原液 中含有的植原体16SrDNA的拷贝数二50ng/pLx6. 02x1027(2692+1237) ><660 = 1. 16x101。。将该溶液进行梯度稀释，稀释倍数为10-109倍，则得到含有的植原体 16SrDNA质粒拷贝数分别为1. 16xl09， 1. 16x108， 1. 16><107， 1. 16x106， 1. 16x105， 1. 16x104, 1. 16x103， 1. 16x102， 1. 16x10个的溶液。将上述稀释好的质粒DNA溶液 作为模板，用步骤l制备的试剂盒进行检测，即以PbLF和PbLR为引物，bFprobe 为探针，按照步骤3所述的方法进行实时荧光PCR反应。
结果表明，当样品浓度为1.16xl()9 1.16xl04个拷贝时，均有荧光信号增加，当 样品浓度为1.16xl03~l. 16x10个拷贝，PCR仪检测不到荧光信号。说明上述实时荧 光PCR方法检测到的槟榔黄化病植原体16SrDNA质粒稀释限点为1. 16><104个拷贝。
5、 本发明的检测槟榔黄化病植原体病原的试剂盒对槟榔样品的检测效果 在海南岛的东线和南线砍伐30株感染槟榔黄化病植株，按照罗大全等(罗大全，
陈慕容，叶沙冰，蔡希灼.海南槟榔黄化病的病原鉴定研究.热带作物学报，2001， 22(2): 43-46.)所述方法鉴定，在海南儋州采集30株健康槟榔植株。按照实施1 中的方法提取样品的花苞总DNA，以提取的DNA作为模板，用步骤1制备的试剂盒进 行实时荧光PCR检测，即利用引物PbLF/PbLR和探针bFprobe对上述样品的花苞总 DNA，分别按照步骤3所述的方法进行实时荧光PCR检测。
结果如图4所示，30株感病样品均有荧光信号的增加，表现为阳性扩增，即可 以检测到植原体，而30株健康槟榔花苞样品检测结果均没有荧光信号的增加，检测 结果为阴性，即未检测到植原体。
上述结果表明本发明的试剂盒可以用于槟榔黄化病植原体病原的检测。
6、 本发明的检测槟榔黄化病植原体病原的方法与传统的巢式PCR方法效果比较 取实施例1中提取的Del样品花苞总DNA，以10倍梯度稀释5次，以稀释好的
DNA作为模板，分别按照步骤3所述的实时荧光PCR方法和实施例1步骤2所述的 巢式PCR方法对上述样品进行检测。结果表明，巢式PCR (图5)与实时荧光PCR (图6)对花苞DNA原样、稀释10、 102倍的DNA样品检测结果均为阳性，对稀释103~105倍的表现黄化症状的槟榔的花 苞DNA样品检测结果均为阴性，说明两种方法的检测灵敏度相同。图6中，M, DNA Marker DL2000; 1，原样；2， IO倍稀释样品；3， 102倍稀释样品；4， 10:'倍稀释样
品；5， 104倍稀释样品；6, 105倍稀释样品；CK，空白对照。
实施例3、本发明的检测槟榔黄化病植原体病原的试剂盒对槟榔不同部位取样 的检测准确性效果验证
在海南岛的东线和南线砍伐30株感染槟榔黄化病的植株，按照罗大全等(罗大 全，陈慕容，叶沙冰，蔡希灼.海南槟榔黄化病的病原鉴定研究.热带作物学报，2001， 22(2) : 43-46.)所述方法鉴定，分别取花苞、心叶、叶片(从下槟榔植株的底部叶 片往上依次取第2、 3、 5片叶子的叶脉)、根部作为检测部位，分别提取总DNA作 为模板样品，均用实施例2的步骤1制备的试剂盒，按照实施例2的步骤3所述的 实时荧光PCR检测方法进行检测。
检测结果如下所述
(1) 花苞样品的检测结果
以槟榔未展开的花苞组织提取总DNA为模板，结果表明，30株黄化症状的槟榔 花苞样品均有荧光信号的增加，检测结果为阳性，检出率为100.0%。
(2) 心叶的检测结果
以槟榔未展开心叶的总DNA为模板进行实时荧光PCR检湖"，结果显示，30个心 叶样品中有24个样品有荧光信号的增加，表现为阳性扩增，检出率为80.0%。
(3) 感病植株不同叶位的叶片的检测结果
以第2片叶子提取的总DNA为模板进行PCR扩增，结果显示，30个样品中有8 个样品有荧光信号的增加，表现为阳性扩增。而其他22个样品的DNA及水对照均 没有荧光增加的信号，表现为阴性扩增了，检出率为26.7%。
以第3片叶子提取的总DNA为模板进行PCR扩增，结果显示，30个样品中有14 个样品有荧光信号的增加，表现为阳性扩增。而其他16个样品的DNA及水对照均 没有荧光增加的信号，表现为阴性扩增了，检出率为46.7%。
以第5片叶子提取的总DNA为模板进行PCR扩增，结果显示，30个样品中有18 个样品有荧光信号的增加，表现为阳性扩增。而其他12个样品的DNA及水对照均 没有荧光增加的信号，表现为阴性扩增，检出率为60.0%。
(4) 病株根部的检测
所有供试的30个样品的根部DNA及水对照均没有荧光增加的信号，表现为阴性扩增了。
上述结果表明，自根部到顶部数第2、 3、 5片叶子的检出率分别达到0%、 26. 7%、 46. 7%和60.0%，说明自根部至顶部的叶片越靠顶部检测准确率越高。花苞的检测准 确率最高，但是花苞只有成株才有，故在大田监测中(成龄植株)选用自根部数第 5片叶子叶脉、心叶或花苞作为检测部位，在幼苗检测中选用顶部嫩叶作为检测部 位。这样结合特异组织的检测，利用本发明的试剂盒(包括本发明的探针和引物) 进行实时荧光PCR检测，具有准确性高、并且比巢式PCR操作简便，假阳性低等特 点。
14序列表
<160〉 4
〈210〉 1
<211> 19
〈212〉 ■
〈213〉 人工序列
〈220〉 〈223>
〈400> 1
ctttactgac gctgaggca 19
〈210〉 2
<211〉 16
〈212〉 DNA <213〉人工序列
〈220〉 <223〉
<400〉 2
gcgaaggcgg cttgct 16
〈210〉 3
〈211> 18
<212〉 醒 〈213〉人工序列
<220〉 <223〉
15<400〉 3
tttgctcccc acgctttc 18
<210〉 4
<211〉 1237
<212> DNA
<213〉 槟榔黄化病植原体(Arecanut yellow leaf)
<400> 4
acgactgctaagactggataaggcatcttcttgtttttaa犯gacctagc60
aataggtatgcttagggeiggagcttgcgtcacattagttagttggtggggtaaaggccta120
ccaagactatgatgtgtagccgggctgggaggttgaacggCC6lC3ttgggactgagscac180
ggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaattttcggcaatgg鄉aaactctgac240
cgagcaacgccgcgtgaacg3tgaagt3tttcggtacgtaaagttcttttattagggaag300
aataaatgatggaasaatcattctgacggt3CCt朋tg33taagccccggctaactatgt360
gccagcagccgcggtaatacatagggggcaagcgttatccggaattattgggcgtaaagg420
gtgcgtaggcgtttatggtctaagtgcaatgctcaacattgtgatgctat■
肌aaactgtttagctagagtaagatagaggcaagtggaattccatgtgtagtggta肌3t540
gcgtaaatatatggaggaacaccagtagcg肌ggcggcttgctgggtctttactgacgct600
gaggcacgaa3gCgtgggg3gcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgt3a3C660
gatgagtact3犯Cgttgggtaaaaccagtgttgaagttaacacattaagtactccgcct720
gagtagtacgtacgcasgtatg肌3ctta^3gg肌ttg8Cgggactccgcacaagcggtg780
gatcatgttgttt8attcg3aggtacccgaaaaacctcaccaggtcttgacatgcttctg840
caaagctgteigaaacacagtggaggttatcagttgcacaggtggtgcatggttgtcgtca900
gctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttattgttagtta960
ccagcacgtaatggtggggactttagcaagactgccagtgataaattggaggaaggtggg1020
gacgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacaaacgtg3tacaatggctgt1080
tacaaagggt3gCtg肌gCgcaagtttttggcaaatctC8aa^aaacsgtctcagttcgg1140
attgaagtctgcaactcgacttcatgaagttggaatcgctsgt肌tcgcgaatcagcatg1200
tcgcggtgaatacgttcgcggggtttgtac3caccgc123权利要求
1、一种检测槟榔黄化病植原体病原的探针，其核苷酸序列为序列表中序列1。
2、 一种检测槟榔黄化病植原体病原的试剂盒，包括权利要求1所述的探针和核 苷酸序列为序列表中序列2的DNA片段与核苷酸序列为序列表中序列3的DNA片 段组成的引物对。
3、 一种检测槟榔黄化病植原体病原的方法，是以待测槟榔的总DNA作为模板， 用权利要求2所述的试剂盒中的引物对为引物，以所述试剂盒中的探针为探针，进 行实时荧光PCR检测，若荧光信号在PCR过程中增强，则该植株感染了植原体。
4、 根据权利要求3所述的方法，其特征在于当待测槟榔为成龄植株时，所述 模板为花苞、心叶或自根部向顶部数第5片叶子叶脉的总DNA;当待测槟榔为幼苗 时，所述模板为槟榔嫩叶的总DNA。
5、 根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于所述实时荧光PCR的反应 体系中核苷酸序列为序列表中序列2的DNA片段和核苷酸序列为序列表中序列3 的DNA片段的浓度均为650 nmol/L。
6、 根据权利要求3-5中任意一项所述的方法，其特征在于所述实时荧光PCR 的反应体系中探针的浓度为230nmol/L。
全文摘要
本发明公开了一种检测槟榔黄化病植原体病原的方法及其专用试剂盒。该试剂盒，包括核苷酸序列为序列表中序列1所示的探针和核苷酸序列为序列表中序列2的DNA片段与核苷酸序列为序列表中序列3的DNA片段组成的引物对。该方法，是提取待测槟榔的DNA作为模板，用上述试剂盒，进行实时荧光PCR检测，若荧光信号在PCR过程中增强，则该植株感染了植原体。实验证明，本发明的方法检测槟榔植原体感染的灵敏度与传统巢式PCR电泳检测相同，但本发明的方法操作简单，整个检测过程实行自动化控制，闭管操作，消除了PCR假阳性污染的机会，无须PCR后处理，适合批量样品的检测，具有操作简单、快速、准确的特点。
文档编号C12Q1/68GK101475995SQ20091007704
公开日2009年7月8日 申请日期2009年1月16日 优先权日2009年1月16日
发明者罗大全, 车海彦 申请人:中国热带农业科学院环境与植物保护研究所