抗心肌抗体四联诊断试剂盒的制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种抗心肌抗体四联诊断试剂盒的制备方法。本发明的抗心肌抗体四联诊断试剂盒由四段抗心肌抗体多肽抗心肌线粒体腺苷酸转移酶抗体、β1肾上腺素能受体抗体、抗钙离子通道抗体和心肌肌球蛋白重链抗体分别包被组成。利用本发明试剂盒检测疑诊DCM患者血清中抗心肌肽类抗体，可提高DCM的诊断水平，实现早期诊断。
【专利说明】抗心肌抗体四联诊断试剂盒的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于医用检测试剂领域。涉及一种抗心肌抗体四联诊断试剂盒的制备。抗 心肌抗体四联诊断试剂盒可用于辅助病毒性心肌炎和扩张型心肌病的诊断和治疗方案的 选择。
【背景技术】
[0002] 病毒性心脏病（VHD)是一组与病毒感染有关的心脏疾病，常见的有病毒性心肌炎 (VMC)和扩张型心肌病（DCM)。近年来，VHD的发病率有逐渐增高的趋势。在病毒感染的 流行期约有5%的患者发生心肌炎，其中12. 5%可转化为DCM，而普通人群中DCM发病率仅 8-10/10万人口。我国广西南宁地区66632人中DCM的普查患病率为84. 04/10万，占该地 区各种心脏病自然发病率的第4位。一般认为，DCM患者症状出现后5年生存率约40%，10 年生存率仅22%左右，严重危害人类健康。
[0003] 目前超声心动图、胸部X线和心内膜心肌活检等检查是VMC和DCM临床诊断的常 用工具。但超声心动图和胸部X线出现改变时，患者已有明显的心脏形态学改变，常伴有心 力衰竭。心内膜心肌活检缺乏特异性，且难以在临床推广。故寻求VMC和DCM早期有效的 诊断方法，是本领域面临的重要课题。
[0004] VMC和DCM患者血清中存在抗心肌自身抗体，目前发现的四种主要心肌自身抗体 是抗心肌线粒体腺苷酸转移酶（ANT)抗体、抗3 1肾上腺素能受体抗体、抗钙离子通道抗体 和抗心肌肌球蛋白重链（MHC)抗体。大量实验研究及临床资料表明，病毒性心肌炎可以转 化为扩张型心肌病，许多慢性病毒性心肌炎患者体内存在抗心肌自身抗体，通过各种免疫 学机制导致DCM的发病，即抗心肌抗体介导的心肌损害是DCM发病的一个始动因素及其早 期发展的重要因素。此项检测可用于监测病毒性心肌炎（VMC)向DCM转化。另外，在DCM早 期，对抗心肌抗体检测中抗ANT抗体或抗钙离子通道阳性的患者，应用钙通道阻滞剂如地 尔硫卓，抗P 1受体抗体阳性的患者应用P受体阻滞剂，阻止抗体效应，可以防止抗体介导 的心肌损害，保护心肌，对DCM患者进行早期、及时干预，可降低患者的再住院率和死亡率， 故抗心肌抗体检测可用于指导DCM的防治。因此，检测疑诊VMC和DCM患者血清中抗心肌 肽类抗体，将提高VMC和DCM的诊断和治疗水平。
[0005] 天然心肌抗原分离提纯困难，难以长期保存，限制了心肌抗体检测的临床应用，根 据心肌自身抗体的氨基酸序列及抗原决定簇的分布状况，设计并合成天然抗原决定簇的多 肽，并以此多肽作为抗原检测患者体内的抗心肌肽类抗体。通过比较，我们发现合成肽结果 与天然心肌抗原的检测结果具有高度一致性，可以代替天然抗原用以检测患者血清中抗心 肌自身抗体。因此，借用合成肽制备抗心肌抗体四联诊断试剂盒，对临床VMC和DCM的诊断 和治疗具有重大社会和经济价值。
【发明内容】
[0006] 本发明目的就是针对现有技术的缺陷，提供一种抗心肌抗体四联诊断试剂盒的制 备方法。利用本发明试剂盒检测疑诊DCM患者血清中抗心肌肽类抗体，可提高DCM的诊断 水平，实现早期诊断。
[0007] 为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：所述的抗心肌抗体四联诊断试剂 盒由四段抗心肌抗体多肽抗心肌线粒体腺苷酸转移酶抗体、P1肾上腺素能受体抗体、抗钙 离子通道抗体和心肌肌球蛋白重链抗体分别包被组成。
[0008] 其中所述的抗心肌线粒体腺苷酸转移酶抗体肽段氨基酸序列为如下两种之一：
[0009] ANT-I
[0010] Pro-IIe-Glu-Arg-Val-Lys-Leu-Leu-Leu-Gln-Cys-Cys。
[0011] ANT-2
[0012] Tyr-Asp-Glu-IIe-Lys-Lys-Phe-Val-Cys-Cys。
[0013] 所述的P 1肾上腺素能受体抗体肽段氨基酸序列如下：His-Trp-Trp-Arg-Ala-Gl U-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe-Val-The-Asn -Cys-Cys0
[0014] 所述的抗I丐离子通道抗体肽段的氨基酸序列如下：Val-Asn-Glu-Asn-Thr-Arg-Me t-Tyr-Ile-Pro-Glu-Glu-Asn-His-Gln-Cys-Cys〇
[0015] 所述的心肌肌球蛋白重链抗体肽段的氨基酸序列为如下三种之一：
[0016] MHC-1 Glu-IIe-Glu-Arg-Lys-Leu-Ala-Glu-Lys-Asp-Cys-Cys〇
[0017] MHC-2 Val-Asp-Lys-Leu-Gln-Leu-Lys-Val-Cys-Cys。
[0018] MHC-3
[0019] Ala-Lys-Ser-Arg-Asp-Ile-Gly-Ala-Lys-Gly-Leu-Asn-Glu-Cys-Cys
[0020] 本发明具体方法是：将抗心肌线粒体腺苷酸转移酶抗体、3 i肾上腺素能受体抗 体、抗钙离子通道抗体和心肌肌球蛋白重链抗体多肽片段分别溶解于四个装有PH为9. 2碳 酸缓冲液的容器中，以每孔中100 y 1的碳酸缓冲液含I y g的相应多肽抗原量进行包被，置 4°C冰箱18小时后，用洗涤液洗3次，每次3分钟，拍干后将含1 %牛血清白蛋白的磷酸缓冲 液作为封闭液，每孔150 封闭，置37°C孵育2h，以消除非特异性反应，拍干干燥后保存于 4°C或-20°C冰箱备用。
[0021] 因 DCM患者血清中存在抗心肌自身抗体，利用本发明试剂盒检测疑诊DCM患者血 清中抗心肌肽类抗体，可提高DCM的诊断水平，实现早期诊断。大量实验研究及临床资料表 明病毒性心肌炎可以转化为扩张型心肌病，许多慢性病毒性心肌炎患者体内存在抗心肌自 身抗体，通过心肌抗体介导的心肌损害是DCM发病的一个重要因素，故本发明试剂盒可用 于监测VMC向DCM转化。在DCM早期，对抗心肌抗体检测中抗ANT抗体或抗钙离子通道阳 性的患者，应用钙通道阻滞剂如地尔硫卓，抗P1受体抗体阳性的患者应用P受体阻滞剂 阻止抗体效应，可以防止抗体介导的心肌损害，保护心肌，对DCM患者进行早期、及时干预， 可降低患者的再住院率和死亡率。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1为抗原合成流程图见附图，图中S、L为侧链保护基团。
【具体实施方式】
[0023] 以下结合实施例进一步说明本发明制备方法
[0024] 试剂盒检测试剂的制备
[0025] -、抗原肽的合成
[0026] 1、合成与四种心肌抗原有相同抗原原性的抗原肽：抗心肌线粒体腺苷酸转移酶 (ANT)、抗P 1肾上腺素能受体、抗钙离子通道和抗心肌肌球蛋白重链（MHC)。相应心肌细胞 抗原肽段的氨基酸序列如下：
[0027] 合成的抗心肌线粒体腺苷酸转移酶（ANT)肽段氨基酸序列：
[0028] ANT-I
[0029] Pro-Ile-Glu-Arg-Val-Lys-Leu-Leu-Leu-Gln-Cys-Cys
[0030] ANT-2 Tyr-Asp-Glu-Ile-Lys-Lys-Phe-Val-Cys-Cys
[0031] 合成的抗P i肾上腺素能受体肽段的氨基酸序列：
[0032] His-Trp-Trp-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu-Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-L ys-Cys-Cys-Asp-Phe-Val-The-Asn-Cys-Cys
[0033] 合成的抗钙离子通道肽段的氨基酸序列：
[0034] Val-Asn-Glu-Asn-Thr-Arg-Met-Tyr-Ile-Pro-Glu-Glu-Asn-His-Gln-Cys-Cys
[0035] 合成的心肌肌球蛋白重链（MHC)肽段的氨基酸序列：
[0036] MHC-I
[0037] Glu-Ile-Glu-Arg-Lys-Leu-Ala-Glu-Lys-Asp-Cys-Cys
[0038] MHC-2 Val-Asp-Lys-Leu-Gln-Leu-Lys-Val-Cys-Cys
[0039] MHC-3
[0040] Ala-Lys-Ser-Arg-Asp-Ile-Gly-Ala-Lys-Gly-Leu-Asn-Glu-Cys-Cys
[0041] 2.用SHIMADZU公司PSSM-8型多肽合成仪合成心肌抗原肽段：
[0042] (1)去保护：Fmoc保护的柱子和单体必须用一种碱性溶剂（piperidine)去除氨基 的保护基团。
[0043] (2)激活和交联：下一个氨基酸的羧基被一种激活剂所激活。激活的单体与游离 的氨基反应交联，形成肽键。在此步骤使用大量的超浓度试剂驱使反应完成。
[0044] (3)循环：这两步反应反复循环直到合成完成。
[0045] (4)裂解切割和脱保护：多肽从柱上切割下来，其保护基团被一种脱保护剂（TFA) 洗脱和脱保护。
[0046] 3.多肽抗原合成后分离与纯化：
[0047] 用甲醇（优级纯）清洗5次，每次1分钟，再用t_J甲基醚（优级纯）清洗2次，此 两种清洗的目的是洗去游离的未结合的氨基酸。用脱树脂溶液（sigma公司的三氟乙酸）将 合成好的多肽从树脂上切割下来，再用乙醚（分析纯）沉淀，离心分离，使脱树脂溶液（三 氟乙酸）与合成好的多肽分离；倒掉上层的脱树脂溶液，最后用氮气（N2)将沉淀的合成好 的多肽吹干，置_40°C冰箱保存备用。
[0048] 二、抗原的包被
[0049] 将ANT、@ p Ca、MHC抗原多肽片段分别溶解于四个装有PH为9. 2碳酸缓冲液的 容器中，以每孔中100 U 1的碳酸缓冲液含I y g的相应多肽抗原量进行包被，置4°c冰箱 18小时后，用洗涤液洗3次，每次3分钟，拍干后将含1%牛血清白蛋白的磷酸缓冲液作为 封闭液，每孔150ul封闭，置37°C孵育2h，以消除非特异性反应，拍干干燥后保存于4°C 或-20°C冰箱备用。
[0050] 三、试剂的配制：
[0051] (1)样品的稀释液：（容积比）9份磷酸缓冲液（PH7. 4)+1份小牛血清；
[0052] (2)辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体；
[0053] (3)显色剂A :200mg溶于无水乙醇IOOml加水至IOOOml
[0054] (4)显色剂8:将磷酸氢二钠14.68，柠檬酸9.338,0.75%过氧化氢尿素4.6!111溶 于IOOOml蒸馏水中即得显色剂B ;
[0055] (5)终止液：为 2mol/L H2SO4 ;
[0056] (6)洗液：含 0? 1 % Tween-20 的 0? 01mol/L 磷酸缓冲液（PH7. 4)。
[0057] (7)阴性对照血清：健康人血清50 ii 1。
[0058] (8)阳性对照血清：已确诊的扩张型心肌病（DCM)患者血清50 ill
[0059] 试剂盒检测使用步骤
[0060] 1.取出分别包被有ANT、P i、M2、MHC多肽抗原的包被板；用样品稀释液稀释阴性对 照血清、阳性对照血清及待测样本，稀释度为1 :40,每孔加100 yl，置37°C孵育30分钟；
[0061] 2用洗涤液洗3次，每次3分钟，拍干，每孔加 I :16000辣根过氧化物酶标记的羊 抗人IgG抗体100 iil，置37 °C孵育30分钟后，同上洗3次；
[0062] 3.加显色剂：每孔分别加入显色剂A 50 ii 1后，再在每孔中加入显色剂B 50 ii 1， 混匀，37°C温箱10分钟；
[0063] 4.显色完毕后,立即加50 ii 1终止液于各反应孔；
[0064] 5.在酶标仪上450nm波长测定光密度值，实验中设置空白对照阴性；
[0065] 6?结果判断：
[0066] (I) Cut Off值确定为2. I XN(阴性对照血清平均值），阴性对照OD值彡0? 05按 0. 05计，高于0. 05按实际OD值计。
[0067] (2)样本OD值S/co > 1者判为阳性，否则为阴性。
[0068] (3)检测结果中，阴性对照OD值须 > 空白对照OD值，（阳性对照OD值-空白对照 OD值）八阴性对照00值-空白对照00值）须>2.1，否则检验结果不可靠。
[0069] 实验结果
[0070] 1.用本发明试剂盒对临床上已经确诊的394例DCM患者和100例健康献血员血清 进行了验证性检测，以检验本发明诊断试剂盒的敏感性和特异性。检测结果为：
[0071] 抗ANT抗体的敏感性93. 91 %，特异性91 % ;抗￠1受体抗体的敏感性98. 22%， 特异性81% ;抗钙离子通道抗体的敏感性99. 24%，特异性85% ;抗肌球蛋白重链抗体的敏 感性95. 69%，特异性89%。通过比较我们还发现合成肽结果与天然心肌抗原的检测结果 具有高度一致性，合成肽基本上可以反映心肌抗原的主要抗原决定簇，可以代替天然抗原 用以检测患者血清中抗心肌自身抗体。
[0072] 2.使用本发明试剂盒对病毒性心脏病患者抗心肌多肽抗体检测结果的比较：
[0073] 对病毒性心脏病患者及健康人进行抗心肌多肽抗体检测，相互比较后发现，DCM组 和急性病毒性心肌炎（AVMC)组抗心肌多肽抗体阳性率明显高于及健康人组（P〈0. 01)，而 急性病毒性心肌炎（AVMC)组与DCM组间无明显差异（P>0. 05)。见表1及表2。各种抗心 肌多肽抗体对DCM检测的敏感性及特异性分别为：ANT 93. 91%，91% ; P 198. 22%，81% ; Ca 99. 24%，85% ;MHC 95. 69%，89%，见表 3。
[0074] 表1病毒性心脏病患者及对照组抗心肌多肽抗体检测分析
[0075]
【权利要求】
1. 一种抗心肌抗体四联诊断试剂盒的制备方法，其特征在于：所述的抗心肌抗体四联 诊断试剂盒由四段抗心肌抗体多肽抗心肌线粒体腺苷酸转移酶抗体、^肾上腺素能受体 抗体、抗钙离子通道抗体和心肌肌球蛋白重链抗体分别包被组成。
2. 根据权利要求1所述的抗心肌抗体四联诊断试剂盒的制备方法，其特征在于：所述 的抗心肌线粒体腺苷酸转移酶抗体肽段氨基酸序列如下：Pr〇-Ile-Glu-Arg-Val-Lys_Leu- Leu_Leu-Gln-Cys_Cys 〇
3. 根据权利要求1所述的抗心肌抗体四联诊断试剂盒的制备方法，其特征在于：所述 的抗心肌线粒体腺苷酸转移酶抗体肽段氨基酸序列如下：Tyr-Asp-Glu-Ile-Lys-Lys_Phe- Val-Cys-Cys〇
4. 根据权利要求1所述的抗心肌抗体四联诊断试剂盒的制备方法，其特征在于：所述 的3丨肾上腺素能受体抗体肽段氨基酸序列如下：His-Trp-Trp-Arg-Ala-Glu-Ser-Asp-Glu -Ala-Arg-Arg-Cys-Tyr-Asn-Asp-Pro-Lys-Cys-Cys-Asp-Phe-Val-The-Asn-Cys-Cyso
5. 根据权利要求1所述的抗心肌抗体四联诊断试剂盒的制备方法，其特征在于：所述 的抗I丐离子通道抗体肽段的氨基酸序列如下：Val-Asn-Glu-Asn-Thr-Arg-Met-Tyr-Ile-Pr o-Glu-Glu-Asn-Hi s-Gln-Cys_Cys 〇
6. 根据权利要求1所述的抗心肌抗体四联诊断试剂盒的制备方法，其特征在于：所述 的心肌肌球蛋白重链抗体肽段的氨基酸序列如下：Glu-Ile-Glu-Arg-Lys-Leu-Ala-Glu_Ly s-Asp-Cys-Cys〇
7. 根据权利要求1所述的抗心肌抗体四联诊断试剂盒的制备方法，其特征在于：所述 的心肌肌球蛋白重链抗体肽段的氨基酸序列如下：Val-Asp-Lys-Leu-Gln-Leu-Lys-Val_Cy s-Cys〇
8. 根据权利要求1所述的抗心肌抗体四联诊断试剂盒的制备方法，其特征在于：所述 的心肌肌球蛋白重链抗体肽段的氨基酸序列如下：Ala-Lys-Ser-Arg-Asp-Ile-Gly-Ala_Ly s-Gly-Leu-Asn-Glu-Cys-Cys 〇
9. 根据权利要求1所述的抗心肌抗体四联诊断试剂盒的制备方法，其特征在于：将抗 心肌线粒体腺苷酸转移酶抗体、3 i肾上腺素能受体抗体、抗钙离子通道抗体和心肌肌球蛋 白重链抗体多肽片段分别溶解于四个装有PH为9. 2碳酸缓冲液的容器中，以每孔中100 yl 的碳酸缓冲液含1 U g的相应多肽抗原量进行包被，置4°C冰箱18小时后，用洗涤液洗3次， 每次3分钟，拍干后将含1 %牛血清白蛋白的磷酸缓冲液作为封闭液，每孔150 ill封闭，置 37°C孵育2h，以消除非特异性反应，拍干干燥后保存于4°C或_20°C冰箱备用。
【文档编号】G01N33/68GK104407149SQ201410455108
【公开日】2015年3月11日 申请日期:2014年9月9日 优先权日:2014年9月9日
【发明者】廖玉华, 王敏, 汪朝晖, 袁璟, 程翔 申请人:武汉华纪元生物技术开发有限公司